Vývojové chyby u reprodukčných strát v 1. trimestri gravidity

Developmental defects in reproduction losses in the 1st trimester of pregnancy

Early reproduction losses represent a part of prenatal selection system, which provides elimination of individuals with disturbed embryonal development. 1 829 spontaneous abortion of the 1st trimester of pregnancy from the region of Bratislava were cytogenetically and morphologically analyzed in the presented study. Severe disturbance of embryogenesis, almost in a half (45%) of informative analyzed cases were detected. At further 14% of cases milder development defects were detected and they could be considered the equivalent of inborn developmental defects. High frequency of chromosomal aberrations, predominantly trisomies, which represents a new gametic mutations, were detected. Information regarding the cause of the reproduction loss may increase the probability of successful termination of the next pregnancy.

Key words:
early reproduction losses — disturbance of embryogenesis — inborn developmental defects — chromosomal aberrations

Autori: prof. RNDr. Ján Vojtaššák, CSc. ¹; RNDr. Jana Malová, Ph.D. ¹; MUDr. Ľudmila Demjénová ¹; doc. MUDr. Miroslav Korbeľ, CSc. ²; MUDr. Peter Martanovič ³
Pôsobisko autorov: Ústav lekárskej biológie a genetiky Lekárskej fakulty UK v Bratislave ¹; I. gynekologicko-pôrodnícka klinika Lekárskej fakulty UK v Bratislave ²; Ústav patologickej anatómie Lekárskej fakulty UK v Bratislave ³
Vyšlo v časopise: Prakt Gyn 2005; 9(2): 15-18

Súhrn

Včasné reprodukčné straty sú súčasťou systému prírodnej prenatálnej selekcie, ktorá zabezpečuje elimináciu jedincov s narušeným priebehom embryonálneho vývoja. V prezentovanej práci bolo morfologicky a cytogeneticky analyzovaných 1 829 samovoľných potratov z 1. trimestra gravidity z regiónu Bratislava. Štúdia zistila ťažké narušenie embryogenézy u 45 % informatívnych analyzovaných prípadov. U ďalších 14 % boli zistene ľahšie poruchy vývoja, ktoré možno považovať za ekvivalenty vrodených vývojových chýb. Zistená bola taktiež vysoká frekvencia chromozómových aberácií, prevažne trizómií, ktoré predstavujú nové gametické mutácie. Informácie o príčine reprodukčnej straty môžu zvýšiť pravdepodobnosť úspešného ukončenia nasledujúcej gravidity.

Kľúčové slová:
včasné reprodukčné straty — porucha embryogenézy — vrodené vývojové chyby — chromozómové aberácie

Úvod

Včasné reprodukčné straty – samovoľné potraty – tvoria organickú súčasť reprodukcie človeka. Predstavujú koncentrát patológie embryonálneho vývoja, na ktorom sa podieľajú faktory endogénne (chromozómové aberácie, monogénové a multifaktoriálne podmienené poruchy vývoja), ale aj exogénne (fyzikálne, chemické a biologické faktory prostredia). Reprodukčné straty tvoria 50 až 70 % zo všetkých realizovaných koncepcií. Časť z nich sa potratí už v prvých dňoch gravidity, kedy je možná len ich biochemická verifikácia pomocou zistenia prítomnosti beta-podjednotky ľudského choriového gonadodotropínu (βhCG) v krvnom sére matky. Ide o tzv. biochemické gravidity. Klinicky rozpoznané gravidity predstavujú 40–60 % z nich. Najčastejšou príčinou týchto včasných reprodukčných strát sú chromozómové aberácie (50–60 %), ktoré sú zvyčajne sprevádzané aj poruchou vývoja [1,2,3, 4,5]. Predpokladá sa, že takmer všetky samovoľné potraty do 4. postovulačného týždňa majú narušenú embryogenézu [6,7,8]. Závažnosť narušenia embryogenézy je rôzna, od ťažkej so životom nezlučiteľnej formy (anembryomola, kedy nedôjde k založenie štruktúr samotného embrya) až po vývojové chyby zlučiteľné so životom, ktoré môžu byť považované za ekvivalenty vrodených vývojových chýb (VVCH). Väčšina z nich, viac než 95 %, podlieha procesu veľmi účinnej prírodnej prenatálnej selekcii, ktorá navodí predčasné ukončenie takejto gravidity. Populácia živo narodených detí vďaka tomuto procesu obsahuje menej než 1 % chromozómových aberácií a len 2–3 % vrodených vývojových chýb [9,10,11].

Cieľom štúdie bola morfologická a cytogenetická analýza samovoľných potratov z 1. trimestra gravidity. Ide o skupinu reprodukčných strát, o ktorých je aj v česko-slovenskej literatúre najmenej dostupných informácií, keďže mnohé gravidity sa potratia skôr, než sú zachytené pri štandardnom ultrazvukovom screeningovom vyšetrení a ich morfologická a chromozómová analýza nie je súčasťou štandardných diagnostických postupov.

Materiál a metodika

Základný súbor tvorilo 1 829 materiálov, ktoré boli zachytené pri samovoľnom predčasnom ukončení gravidity na gynekologicko-pôrodníckych klinikách a oddeleniach bratislavského regiónu v období 1992–2003. Pri ich morfologickej analýze sa použila klasifikácia Fujikuru [12] a Fantela [13] (tab. 1). „Informatívne“ materiály obsahovali embryo/plod alebo ich súčasti a umožňovali do určitej miery posúdiť priebeh embryogenézy, ktorá bola posudzovaná podľa Streeterových horizontov [14]. Karyologické preparáty boli získané štandardným postupom z deliacich sa buniek priamym spracovaním, po 24hodinovej a dlhodobej kultivácii. Bunková suspenzia bola získaná 0,25% trypsínom (Serva, Germany) a spracovaná štandardným spôsobom na karyologické preparáty. Chromozómy boli farbené konvenčne a G-pásikovaním [15]. Embryonálne alebo fetálne tkanivá (choriové klky, amnionová membrána, chóriová membrána, kožnosvalový aparát embrya a plodu) boli kultivované sendvičovou metódou [16] v kultivačnom médiu MEM-E (PAN Biotech, Germany) s 10% fetálneho bovinného séra (FBS, PAN Biotech, Germany) a antibiotikom Gentamicín (Lék, a.s., Slovinská republika) v CO₂inkubátore s humidovanou atmosférou s 5 % CO₂ vo vzduchu.

**Tab. 1. Morfologické skupiny u reprodukčných strát. Podľa Fujikura et al [12] a Fantel et al [13].**

Výsledky

Z celkového počtu 1 829 analyzovaných samovoľných potratov z 1. trimestra gravidity bolo 263 (14,4 %) informatívnych materiálov (tab. 2). Embryá a plody s normálnym priebehom embryogenézy (102) tvorili 39,4 % informatívnych materiálov. Zachytených bolo 161 (61,2 %) samovoľných potratov s narušeným priebehom embryogenézy. Najťažšie formy narušenia embryogenézy predstavujú anembryomoly (66/25,1 %, u ktorých nebol založený embryonálny terčík alebo došlo k jeho sekundárnej lýze) a dezorganizované embryá (58/22,4 %). „Ľahšie“ vývojové chyby (VCH), ekvivalenty vrodených vývojových chýb (VVCH), boli zachytené u 37 (14,1 %) včasných reprodukčných strát, z nich 7 ešte v embryonálnom období (tab. 3).

**Tab. 2. Zastúpenie „informatívnych“ materiálov, ktoré umožňujú posúdenie priebehu embryogenézy (Σ 263) v súbore reprodukčných strát z I. trimestra gravidity (Σ 1829).**

**Tab. 3. Ekvivalenty VVCH (Σ 33) zachytená v analyzovanom súbore.**

Najpočetnejšiu skupinu tvorili rázštepy pery (CL) a podnebia (CP) (11) s prevahou pravostranných rázštepov pery (5). Tie boli v 4 prípadoch podmienené chromozómovou aberáciou. Tri razy išlo o trizómiu (47,XY,+6; 47,XY,+10; 47,XY,+D) a raz o triploidiu (69,XXX) ako súčasť syndrómu parciálnej moly hydatidózy. Obojstranný CL bol pozorovaný dva razy. Jeden z nich bol podmienený trizómiou D v translokačnej forme (46,XY,-D,+t(Dq;Dq). Izolovaný CP ako aj kombinovaný CL/P bol pozorovaný dva razy. Kultivácia bola úspešná len v prípade kombinovaného CL/P, zistila trizómiu D (47,XY,+D).

Hygróm krku bol druhou najpočetnejšou VCH (7), z toho tri razy v embryonálnom období. Kultivácia bola úspešná len v 3 prípadoch, v 2 z nich bola zistená monozómia X (45,X).

Pri syndróme amniových pruhov (4) ako aj anencefálii (3) bol u úspešných kultivácií (4) zistený normálny karyotyp. U omfalokély (3) bola kultivácia úspešná v 2 prípadoch s nálezom normálneho karyotypu (46,XX) a štruktúrovej chromozómovej aberácie v mozaike s normálnou bunkovou líniou (46,XY/46,XY,3q+).

1 z 2 analyzovaných prípadov hydrocefalu mal trizómiu 21 v mozaikovej forme (46,XX/47,XX,+21) a u jediného prípadu spina bifida bola zistená trizómia 18 (47,XY,+18). U všetkých prípadov s izolovanou syndaktýliou a polydaktýliou bol zistený normálny karyotyp.

Diskusia

Normálne embryá a plody predstavujú u reprodukčných strát pomerne početnú skupinu (40 %), u ktorých ostáva nezodpovedaná otázka o príčine predčasného ukončenia gravidity. Je pravdepodobné, že sú podmienené predovšetkým účinkom exogénnych faktorov. Ak za endogénne faktory považujeme len genotyp, t.j. genetickú výbavu jedinca a poruchy vývoja ním navodené, potom za exogénny faktor môžeme považovať aj organizmus matky.

Druhú najpočetnejšiu morfologickú skupinu tvoria anembryomoly (25,1 %). Predstavujú najťažšiu a veľmi včasnú poruchu embryonálneho vývoja. Morfologicky ide o prázdny choriový vak (obr. 1) – intact embryonic sac, empty gestational sac, empty sac, anembryonic sac, blighted ovum – obsahuje len tekutinu a často hypoplastický chorion frondosum, tvoriaci niekedy ostrovčeky [13]. K založenie embryoblastu buď vôbec nedošlo (primárna anembryomola) alebo embryo založené bolo, ale v dôsledku chybnej amniogenézy v období medzi 7.–14. dňom embryonálneho vývoja, došlo k jeho rezorpcii (sekundárna anembryomola) [17,18]. Zastúpenie anembryomol sa v jednotlivých štúdiách pohybuje v rozpätí 7–45 %. Ide o morfologickú skupinu s vysokým podielom chromozómových aberácií (60–70 %), s prevahou trizómií, najčastejšie trizómiou 16 a 22 [9,18].

**Obr. 1. Neporušené prázdne plodové vajce (IES) priemeru 20 mm. Presvitanie nesúvislej platne chorion frondosum, ktorý je hypotrofický a ostrovčekovitý (šipky).**

Približne rovnako početnú skupinu (22 %) tvoria aj dezorganizované embryá (disorganized embryos, grossly disorganized embryos). Predstavujú jedincov s veľmi ťažko narušenou embryogenézou, nezlučiteľnou so životom (obr. 2). Ich zastúpenie v štúdiách je ovplyvnené aj spôsobom ukončenia gravidity. Pri rutinnom ukončení takejto neperspektívnej gravidity je malá pravdepodobnosť ich zachytenia. Philipp et al (2002) použili transcervikálne embryoskopické vyšetrenie gestačného vaku pred evakuáciou zamĺknutých potratov (154). U 48 z nich (31 %) zistili ťažkú poruchu embryonálneho vývoja [19]. Ide o neperspektívne gravidity s vysokým podielom chromozómových aberácií (70 %), s absolútnou prevahou trizómií autozómov (90 %) [20]. Zachytili však aj dezorganizované embryá s normálnym karyotypom. Autori v analyzovanom súbore DE zistili vysoký, ale o niečo nižší, podiel chromozómových aberácií (50 %), s absolútnou prevahou trizómií autozómov (90 %). Triploidia a monozómia X sa vyskytli len ojedinele. Polovica DE mala normálny karyotyp. V súčasnosti nie sú známe faktory podmieňujúce ťažké narušenie embryonálneho vývoja pri zdanlivo normálnom karyotype. Tento problém si vyžaduje ďalšie štúdium zamerané na detailnú analýzu karyotypu (skrytého mozaicizmu, aberácií v subtelomerických oblastiach chromozómov) a genómu ako takého (poruchy v imprintingu, v homeotických génoch a pod.).

**Obr. 2. Rudimentárne, dezorganizované embryo veľkosti 2 mm.**

Ďaľšiu, z hľadiska prognózy pre nasledujúcu graviditu, veľmi významnú skupinu tvoria embryá a fétusy s vývojovými chybami – EF a FF (33/14,0 %). Predstavujú ekvivalent vrodených vývojových chýb u živonarodených detí, s frekvenciou výskytu 2–3 %, ktoré podmieňujú 22 % dojčenskej úmrtnosti [21]. Ide o veľmi heterogénnu skupinu s podielom nielen chromozómovej ale aj multifaktoriálne podmienenej patológie. Každý takýto jedinec by mal byť považovaný za probanda v danej rodine a mal by byť vzatý do úvahy pri manažmente a monitoringu nasledujúcej gravidity.

**Obr. 3. Obojstranný rázštep pery a podnebia (CL/P) u plodu v 10. vývojovom týždni (12. gestačný týždeň).**

Najčastejšie sa vyskytujúcou VCH v analyzovanom súbore boli rázštepy pery a podnebia (tab. 3). Vo všeobecnosti sa predpokladá ich multifaktoriálna etiológia. Podľa lokalizácie sa delia na rázštepy pery a rázštepy podnebia (Cleft Lip – CL, Cleft Palate – CP) alebo kombinovaný rázštep pery a podnebia (CL/P), a to jednostranné alebo obojstranné [22]. Môžu tvoriť izolovanú VVCH alebo byť súčasťou chromozómových syndrómov. Táto vývojová chyba vzniká okolo 35. dňa vnútromaternicového vývoja tak, že nedôjde k splynutiu frontálnej prominencie s maxilárnym výbežkom. Ľavostranný rázštep sa v populácii novorodencov vyskytuje 2krát častejšie ako pravostranný. V analyzovanom súbore sme pozorovali častejší výskyt pravostranných rázštepov, nešlo však o izolované rázštepy, ale o súčasť chromozómových syndrómov, ktoré tvorili prekvapivo vysoký podiel – 100 % úspešných kultivácií. Dá sa predpokladať, že aj u ostatných prípadov kde zlyhala kultivácia, bola prítomná chromozómová aberácia, s najväčšou pravdepodobnosťou trizómia. Pre stanovenie prognózy pre nasledujúcu graviditu je potrebná informácia o type rázštepu, pohlaví postihnutého plodu ako aj karyotype. V súčasnosti prebieha intenzívny výskum génov, ktoré sa priamo alebo nepriamo podieľajú na vývoji orofaciálnych štruktúr, identifikované ako homeotické gény pre danú oblasť (MSX-1 a MSX-2), receptory a ich DNA polymorfizmy (receptor pre retinovú kyselinu – RARA, receptor pre metyléntetrahydrofolát reduktázu – MTHFR, receptor pre kyselinu listovú – FOLR 1) ako aj faktory životného štýlu matky (alkohol, fajčenie v gravidite). Cieľom tohto štúdia je definovanie mechanizmov podmieňujúcich vznik tejto VVCH.

Obr. 4. Rázštep pery (CL) na strane pravej u embrya v 40. dni vývoja, hodnotený ako missed ab. Vzhľadom na maceráciu tkanív sme nevedeli vylúčiť iatrogénny pôvod pozorovanej ektopie cordis. Išlo o parciálnu molu hydatidózu s karyotypom 69,XXX.

Druhou najpočetnejšou vývojovou chybou v analyzovanom súbore bol hygróm krku, 7 prípadov (obr. 5), taktiež s vysokým podielom neúspešných kultivácií (4x). V 2 prípadoch bola etiologickým faktorom monozómia X (45,X). U monozómie X sa predpokladá, že podmieňuje vznik vaskulopátií plodu, poruchu v embryo-placentálnej cirkulácii ako aj narušenú výstavbu lymfatického systému, čo následne zvyšuje stázu tekutín v extracelulárnych priestoroch. Makroskopicky sa v prvom trimestri prejavuje ako edém krku a lymfedém horných a dolných končatínu [23]. V prípade neprítomnosti embrya/plodu je často nachádzaný pupočník zakončený fragmentom brušnej steny (obr. 6). Ide o novú, vysoko letálnu mutáciu, ktorá podlieha prenatálnej selekcii a neovplyvňuje negatívne prognózu nasledujúcej gravidity. U 2 ďaľších prípadov boli prítomné aj pridružené (kombinované) vývojové chyby (polydaktýlia a syndróm amniových pruhov).

**Obr. 5. Rozsiahly hygróm krku a edém ľavej dolnej končatiny (šipky) u embrya v 7. vývojovom týždni. Dobre viditeľné tri umbilikálne cievy.**

**Obr. 6. Pupočník ukončený fragmentom brušnej steny embrya (šipka). Ide o častý nález u monozómie X (45,X). A – amniová membrána, Ch – choriové klky.**

Syndróm amniových pruhov bol pozorovaný u 4 samovoľných potratov s normálnym karyotypom. V 1 prípade išlo o kombinovanú VCH so syndaktýliou 2., 3. a 4. prsta na hornej a 2. a 3. prsta na dolnej končatine (obr. 7).

Obr. 7. Syndróm amniových pruhov (8.–9. vývojový týždeň). Amputácia distálnych článkov prstov na rukách (a – pravej, b – ľavej), amputácia palca ľavej nohy (c) a strangulácia chodidla pravej nohy(d).

Zachytené boli aj 3 prípady omfalokély s normálnym chromozómovým nálezom (obr. 8). Podľa údajov Eurocatu [24] je prevalencia omfalokély 2,52/10 000 s pomerne vysokou geografickou variabilitou. U 46 % prípadov ide o izolovanú VCH s heterogénnou etiológiou, je však aj súčasťou Beckwith-Wiedemanovho a Sphrintzen-Goldbergovho syndrómu (OMIM). V rámci prenatálneho screeningu sa zachytí približne tretina z nich.

**Obr. 8. Omfalokéla u plodu s karyotypom 46,XX (koniec 10. vývojového týždňa).**

Zachytené boli aj 3 prípady anencefala (obr. 9), taktiež s normálnym chromozómovým nálezom. Jeho incidencia v novorodenckej populácii je 10,12/ 100 000 [24]. U všetkých 3 plodov s anencefáliou boli prítomné aj kombinované VCH (spina bifida v cervikotorakálnej oblasti, syndaktýlia a syndaktýlia s polydaktýliou).

**Obr. 9. Anencefalus u plodu s karyotypom 46,XY (koniec 10. vývojového týždňa). Spina bifida v C – Th oblasti.**

Ojedinelý prípad izolovanej spiny bifidy bola podmienená trizómiou 18. Podľa údajov WHO jej frekvencia v roku 2000 bola 21,03 na 100 000 novorodencov. Pokles prípadov nesyndrómovej spiny bifidy v poslednom desaťročí sa pripisuje pozitívnemu účinku preventívnej suplementácii folátmi [25].

Hydrocefalus bol zachytený 2krát. Jeden z nich ako mozaiková forma trizómie 21 aj so syndaktýliou a polydaktýliou.

Ako vidieť, včasné reprodukčné straty predstavujú koncentrát chromozómovej a morfologickej patológie. Chromozómová analýza potratených plodov, u ktorých sa frekvencia chromozómových aberácií pohybuje okolo 50 %, je oveľa informatívnejšia ako vyšetrenie periférnej krvi progenitorov približne so 4 % pozitívnych nálezov [26]. Komplexná analýza reprodukčnej straty tak predstavuje úsporu času a prostriedkov. Podľa Wolfa a Horgera [27] táto úspora pri zisťovaní príčiny neúspešnej tehotnosti dosahuje až 1 100 USD, a navyše výrazne zvyšuje pravdepodobnosť pôrodu zdravého dieťaťa v nasledujúcej gravidite.

Záver

Na základe údajov získaných pri štúdiu pomerne rozsiahleho súboru včasných reprodukčných strát, u ktorých bol zistený vysoký podiel chromozómovej a morfologickej patológie, autori dospeli k presvedčeniu, že vytvorenie podmienok pre ich rutinné vyšetrovanie by bolo prínosom z medicínskeho ale aj psychologického hľadiska. Pri dodržaní štandardných terapeutických a diagnostických postupov histologické vyšetrenie zvyčajne iba potvrdí, že išlo o graviditu. Otázka o príčine reprodukčného neúspechu ostáva nezodpovedaná, čo sa premietne do managementu nasledujúcej gravidity zo strany ošetrujúceho lekára, ktorý sa nemá o čo oprieť, ale aj do psychiky ženy, hlavne v prípade opakovaných reprodukčných strát.

Zdroje

1. Creasy MR, Crolla JA, Alberman ED. A cytogenetic study of human spontaneous abortions using banding techniques. Hum Genet 1976; 31(2): 177-196.

2. Carr DH, Gedeon MM. Q-banding of chromosomes in human spontaneous abortions. Can J Genet Cytol. 1978; 20(3): 415-425.

3. Boue A, Boue J. Chromosomal abnormalities associated with fetal malformation. In: Schrimgeout J (eds). Towards the prevention of Fetal Malaformation. Edinburgh: Edinburgh Univ Press 1978.

4. Hassold T, Chen N, Funkhouser J, Jooss T, Manuel B, Matsuura J, Matsuyama A, Wilson C, Yamane JA, Jacobs PA. A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions. Ann Hum Genet 1980; 44(2): 151-178.

5. Lakshmi KV, Satyanarayana M, Prabahker S and Sarvani R. Chromosomal Analysis in Recurrent Spontaneous Aborters. Ind J Hum Genet 2002; 8(2): 66-68.

6. O'Rahilly R, Muller F. Human Embryology & Teratology. 3rd ed. New York: Wiley-Liss 2001.

7. Mikamo K. Anatomic and chromosomal anomalies in spontaneous abortion. Possible correlation with overripeness of oocytes. Am J Obstet Gynecol 1970; 106(2): 243-254.

8. Kajii T, Ferrier A, Niikawa N, Takahara H, Ohama K, Avirachan S. Anatomic and chromosomal anomalies in 639 spontaneous abortuses. Hum Genet 1980; 55(1): 87-98.

9. Byrne J, Warburton D, Kline J et al. Morphology of early fetal deaths and their chromosomal characteristics. Teratology 1985; 32: 297-315.

10. Moore KL, Persaud TV, Chabner DEB. Developing Human: Clinically Oriented Embryology. 7th ed. Philadelphia: WB Sauders 2003.

11. Böhmer D. Analýza výskytu vrodených vývojových chýb u živonarodených novorodencov v Slovenskej republike. Gynekológia pre prax 2004; 1: 34-36.

12. Fujikura T, Froelich LA, Driscoll SG. A simplified anatomic classification of abortions. Am J Obstet Gynecol 1966; 95(7): 902-905.

13. Fantel AG, Shepard TH, Vadheim-Roth C et al. Embryonic and fetal phenotypes: prevalence and other associated factors in a large study of spontaneous abortions. In: Porter SH, Hook EB. Human embryonic and fetal death. New York: NY Acad Press 1980: 71-87.

14. Streeter GL. Developmental horizons in human embryos. Embryology Reprint II. Washington: Carnegie Inst 1951.

15. Dejmek J, Vojtaššák J, Malová J. Cytogenetic analysis of 1508 spontaneous abortions originating from south Slovakia. Eur J Obstet Reprod Biol 1992; 46: 129-136.

16. Bullerdiek J, Barnitzke S, Schloot W. A rapid and simple sandwich - method used for chromosome analysis from small fetal and adult biopsy specimens. Clin Genet 1979; 16: 433-437.

17. Lucket WP. The developmental of primordial and definitive amniotic cavities in early rhesus monkey and human embryos. Am J Anat 1975; 144: 149-167.

18. Vojtaššák J, Demjénová L, Ďuríková M, Danihel Ľ, Böhmer D, Korbeľ M. Anembryomola – charakteristika, výskyt, chromozómová analýza. Slovenská Gynekológia a pôrodníctvo 1996; 3(2): 50-54.

19. Philipp T, Philipp K, Reiner A, Beer F, Kalousek DK. Embryoscopic and cytogenetic analysis of 233 missed abortions: factors involved in the pathogenesis of developmental defects of early failed pregnancies. Hum Reprod 2003; 18(8): 1724-1732.

20. Philipp T, Kalousek D. Generalized abnormal embryonic development in missed abortion: embryoscopic and cytogenetic findings. Am J Med Genet 2002; 111: 43-47.

21. Guyer B, Hoyert DL, Martin JA, Ventura SJ, MacDorman MF, Strobino DM. Annual Summary of Vital Statistics – 1998. Pediatrics 1999; 104 (6): 1229-1246.

22. Tolarová M, Červenka J. Classification and birth prevalence of orofacial clefts. Am J Med Genet 1998; 13: 126-137.

23. Canki N, Warburton D, Byrne J. Morphological characteristics of monosomy X in spontaneous abortions. Ann Genet 1988; 31(1): 4-13.

24. Calzolari E, Bianchi F, Dolk H, Milan M. EUROCAT Working group: Omphalocele and gastroschizis in Europe: a survey of 3 million birth 1980–1990. Am J Med Genet 1995; 58: 187-194.

25. National Center for Heath Statistics. Monitoring the Nations Health. http://www.cdc.gov/nchs

26. Ford JH, Wilkin HZ, Thomas P, McCarthy C. A 13-year cytogenetic study of spontaneous abortion: clinical applications of testing. Aust N Z J Obstet Gynaecol 1996; 36(3): 314-318.

27. Wolf GC, Horger EO. Indication for examination of spontaneous abortion specimens: a reassessment. Am J Obstet Gynecol 1995; 173(5): 1364-1368.