Regenerační schopnosti nanovláknového obvazu na bázi polylaktidu

Súhrn

Úvod: Vývoj ideálního krytí pro oblast hojení ran je stále nevyřešeným problémem. Díky rozvoji techniky elektrostatického zvlákňování se do popředí výzkumného zájmu dostaly polymery ve formě nanovláken. Moderním a velice slibným obvazovým materiálem je netkaný textil na bázi nanovláken syntetického polymeru polylaktidu (PLA). Cílem práce bylo posouzení regeneračních schopností PLA na standardizované ráně prasečího modelu a naše výsledky porovnat s literárními údaji.

Metody: Na vytvořené standardizované rány na prasečím modelu jsme aplikovali nanovláknové obvazy na bázi PLA. Třetí, desátý, sedmnáctý a dvacátý čtvrtý den od tvorby defektu jsme ránu převázali za současného odběru tkáně k histopatologickému vyšetření. Průběžně jsme monitorovali hladiny sérových proteinů akutní fáze zánětu.

Výsledky: PLA stimuloval zánětlivou reakci. Od třetího dne narůstala tloušťka fibrinové vrstvy s granulocyty. Maximálních hodnot dosáhla desátý převazový den (průměr 340 μm), zároveň kulminovala hladina sérového amyloidu A jakožto markeru zánětu. Jednotlivé fáze hojení se vzájemně prolínaly. Největších hodnot tloušťky granulační tkáně s buněčným vazivem (průměr 8463 μm) bylo docíleno sedmnáctý den. Dvacátý čtvrtý den byly defekty makroskopicky zhojeny s průměrnou vrstvou reepitelizace 9913 μm.

Závěr: Nanovláknový obvaz na bázi PLA potencuje zánětlivou, proliferační i reepitelizační fázi hojení. Jeho struktura dokonale napodobuje stavbu a funkci extracelulární matrix a slouží jako 3D síť pro růst a interakci buněčných elementů. Mimo biokompatibilitu disponuje PLA unikátní schopností dvoufázové biodegradace. Je slibným materiálem pro výrobu převazových materiálů. Většina dostupných studií byla provedena in vitro. Dosud chybí in vivo srovnávací studie, přibližující použití PLA k denní praxi.

Klíčová slova:

nanovlákna – polylaktid – hojení ran

ÚVOD

Technika elektrostatického zvlákňování polymerů, jehož produktem jsou nanočástice a nanovlákna, do sáhla v posledních desetiletích významného rozvoje. Zjednodušeně jde o metodu, kdy k tvorbě vláken dochází mezi dvěma opačně nabitými vysokonapěťovými elektrodami v roztoku polymeru. Využití nanočástic je všestranné. Uplatňují se v čištění odpadních vod, k absorpci tuků z vody nebo k výrobě protektivních oděvů [1]. Opravdový boom zažívají v biomedicíně a tkáňovém inženýrství. Jejich dominantní přínos se projevil zejména v oblasti hojení ran.

Zachování kožní integrity je jednou ze zásadních podmínek udržení homeostázy organismu. Porušení kožního krytu vede nezbytně k nárůstu morbidity a mortality [2]. Absence časné adekvátní léčby má negativní socioekonomické důsledky. To vše je důvodem k vynalézání stále nových obvazových materiálů s cílem urychlit hojení ran. Ideální krytí musí splňovat hned několik podmínek, jakými jsou biokompatibilita, zabránění vniku exogenních mikroorganismů do rány a flexibilita. Krytí by mělo být biodegradabilní a mít hemostatický účinek [3]. Nezanedbatelné jsou praktické požadavky na cenovou a materiální dostupnost a snadnou a bezbolestnou aplikaci.

Nanovláknové obvazy z elektrostaticky zvlákněných přírodních (např. chitosan) [1] i syntetických (polyglykolát, polylaktid) polymerů se právě pro svoji všestrannost jeví v řešení problematiky hojení ran slibně. Syntetický polylaktid (PLA) je moderní lehce hydrofobní materiál vynikající svými mechanickými vlastnostmi, biodegradabilitou i biokompatibilitou a snadnou obnovitelností. Neopomenutelná je jeho šetrnost k přírodě [4]. V naší práci jsme se zaměřili na zhodnocení regeneračních schopností právě syntetického krytí ve formě netkané textilie na bázi PLA. Zkoumali jsme vliv jeho aplikace na vytvořenou standardizovanou ránu na prasečím modelu v průběhu všech fází hojení rány.

METODY

Pokus byl schválen etickou komisí Ústavu živočišné fyziologie a genetiky Akademie věd ČR (ÚŽFG AV ČR). Členové výzkumného týmu měli oprávnění k vedení experimentální studie na zvířatech v souladu se zákonem č. 246/1992 Sb. upraveným vyhl. č. 207/2004 s následným výkladem k vyhlášce č. 39/2009.

Výroba nanovláknového obvazu se uskutečnila ve spolupráci s firmou Nanotex s.r.o. PLA (IngeoTM, Biopolymer 4032D, NatureWorks, Minnesota, USA) byl připraven ze 7% roztoku chloroformu, dichlorethanu a ethylacetátu. Jeho hmotnost na jednotku plochy činila 10 g/m2. Elektrostatické zvláknění proběhlo na přístroji NanospiderTM unit (NS Lab 500, ELmarco, Liberec).

Pokus byl proveden na půdě ÚŽFG AV. K pokusu bylo využito 8 samčích kastrátů prasat z chovu „Minipig Liběchov“ o průměrné hmotnosti 31 kg. V celkové inhalační anestezii (vzduch + 02 + Isofluran) s intratracheální intubací po předchozí premedikaci (Tiletamine 2 mg/ kg + Zolazepam 2 mg/kg + Ketamine 2 mg/kg + Xylazine 0,4 mg/kg) jsme každému praseti po dezinfekci kožního krytu roztokem Betadine vytnuli skalpelem podél hřbetu 4 identické defekty v celé tloušťce kůže o rozměrech 40×40 mm. Na defekty jsme aplikovali netkaný obvaz ze zvlákněného PLA. Defekty jsme převazovali každý třetí, desátý, sedmnáctý, resp. dvacátý čtvrtý den. V průběhu jednotlivých převazů jsme postupně odebírali tkáňové vzorky a odesílali je k histopatologickému vyšetření. Po odběru byly fixovány v roztoku 10% formalinu, dehydratovány a zality v parafinu. Před mikroskopickým odečtem, prováděným zkušeným patologem, byly obarveny hematoxylin-eosinem. Z každé ze čtyř ran podél hřbetu prasete jsme vzorek odebrali postupně a jen jednou tak, aby nedošlo k další traumatizaci a tím zkreslení výsledku v procesu hojení. Paralelně s převazy jsme prováděli odběry žilní krve ke stanovení hladiny sérových proteinů akutní fáze zánětu – C-reaktivní protein (CRP), sérový amyloid A (SAA), haptoglobin (HPT). Své poznatky jsme porovnali s dostupnou literaturou.

VÝSLEDKY

Mikroskopické hodnocení bylo zaměřeno na zhodnocení hloubky defektu v průběhu hojení. Dále jsme hodnotili tloušťku fibrinové vrstvy s granulocyty typické pro iniciální fázi zánětu, tloušťku vrstvy granulační tkáně a buněčného vaziva charakterizující fázi proliferační a konečně sílu reepitelizace ve finální fázi hojení rány. Deskriptivní data s hodnotami tlouštěk jednotlivých vrstev shrnuje tabulka (Tab. 1).

Jednotlivé fáze hojení se kontinuálně prolínaly. Z dat uvedených v tabulce vyplývá, že významnou zánětlivou reakci jsme pozorovali již během prvního převazu rány a že svého maxima dosahovala kolem desátého dne po tvorbě defektu, kdy již postupně přecházela ve fázi proliferační. Tloušťka granulační tkáně s buněčným vazivem kulminovala sedmnáctý převazový den. Reepitelizace s keratinocyty se objevila již během druhého převazu se svým maximem během posledního převazu, kdy již byly všechny rány makroskopicky zhojeny zepitelizovanou jizvou.

U měřených sérových hladin proteinů akutní fáze zánětu nedošlo s výjimkou SAA k výchylce v průběhu všech fází hojení. Výkyv hladiny SAA dokumentující probíhající zánětlivou reakci během desátého převazového dne znázorňuje Graf 1.

DISKUZE

Elektrostaticky zvlákněné polymery v podobě nanovláken se v posledních desetiletích těší stále větší oblibě a stojí v popředí výzkumných zájmů biomedicíny a tkáňového inženýrství. Využití nacházejí v podobě nosičů léčivých přípravků, slouží jako 3D podpora růstu buněčných elementů při regeneraci chrupavky, kostí, srdečních chlopní, svalů, nervové tkáně a kůže [5]. Vyskytují se ve formě gelů, filmů, částic nebo vláken různých velikostí [6]. Jsou součástí moderních obvazových materiálů.

Předmětem tkáňového inženýrství je najít „scaffold (lešení)“ pro proliferaci a diferenciaci buněk napodobující funkci a strukturu extracelulární matrix v živém systému [4,7], která je za normálních okolností tvořená fibrózní sítí s kolagenem. Taková síť poskytuje nejen mechanickou oporu buňkám, ale umožňuje i jejich vzájemné působení a ovlivňuje jejich funkci. Růst, organizace, diferenciace i smrt buněk je regulována interakcí s matrix [4]. Dříve používané extrahované zvířecí kolagenové preparáty obsahovaly četné endotoxiny a jiné peptidy spouštějící v lidském těle kaskádu patologických procesů [1]. Naproti tomu nanovlákenné polymery, zejména PLA, vykazují vysokou biokompatibilitu. PLA je moderní syntetický polymer. První nanovlákna na bázi PLA byla vyrobena v roce 2005 [8]. Chemický vzorec PLA ukazuje Obr. 1.

Nanovláknová struktura PLA vzniklá zvlákněním roztoku polymeru je výhodná. Materiál obsahuje četné póry a drážky napodobující síť extracelulární matrix (Obr. 2).

Dává tak mechanickou oporu pro růst buněk. Přínosná je forma „plátků“ netkané textilie mající díky porozitě velký povrch vzhledem k objemu obvazu [4]. Formu netkané textilie jsme používali i my v našem in vivo pokusu. Vysoká porozita a flexibilita umožňuje volnou výměnu plynů s okolím [9], přitom „3D mřížka“ usnadňuje buněčnou adhezi, proliferaci i diferenciaci buněk. Bohužel většina dosud publikovaných prací zabývajících se studiem nanovláknových krytí byla prováděna in vitro [10,11]. Dominantní změny typické pro zánětlivou fázi jsme v našem projektu zaznamenali v období kolem desátého dne po vytvoření rány, tedy v průběhu druhého převazu. Kulminovala tloušťka fibrinové vrstvy s granulocyty, svého maxima dosáhla hladina SAA. Z literatury víme, že PLA potencuje vznik silné vrstvy zánětlivých buněk mezi ním a tkání [4]. Méně zánětlivou reakci vyvolává stereokomplexní forma PLA [4]. Hodí se pro případy předpokládaného protrahovaného hojení, např. regenerace nervových vláken, kde je nižší zánětlivá reakce žádoucí. Obecně platí, že stupeň zánětlivé odpovědi polymerních biomateriálů závisí na jejich chemické struktuře, zejména na hydrofilitě polymeru. Tato vlastnost potažmo souvisí, dokonce se prolíná s další vlastností PLA, a tou je biodegradabilita. In vivo je proces degradace zajištěn hydrolýzou materiálu tělesnými tekutinami, následovanou bakteriální degradací nízkomolekulárních fragmentů [12]. Zásadní roli na rychlost procesu mají okolní teplota a pH [13]. Zatímco degradace probíhá rychleji v zásaditém a vodném prostředí, acidita rozpadový proces zbržďuje. Na rozdíl od hydrofilních polymerů je degradace PLA v in vivo podmínkách pomalá a nastupuje zpravidla po 4 týdnech po aplikaci [4], resp. k ní dochází mezi 6–12 měsíci po aplikaci u studií in vivo. To jsme pozorovali i v průběhu našich převazů. PLA se postupně zakomponoval do rány. Jeho hydrofobní „nepřichycené“ zbytky jsme mohli během převazů, bylo-li třeba, nekomplikovaně z rány odstranit, případně jsme materiál navrstvili a postupně se stal součástí rány. Tato vlastnost je unikátní a je možné, že do budoucna bude vytvořeno krytí s minimální potřebou jeho výměny, které se plně degraduje v ráně. PLA také významně akcentuje růst granulační tkáně a fázi reepitelizace. Důvodem je již zmíněná poskytnutá mechanická podpora napodobující extracelulární matrix [5].

Design práce byl zaměřen na zhodnocení vlastností polylaktidového krytí jako takového. Autoři jsou si vědomi, že limitací této práce je bezpochyby absence kontrolní skupiny.

ZÁVĚR

Závažnost problematiky hojení ran vytváří neustálý tlak na výzkum v biomedicíně a tkáňovém inženýrství. Je obtížné naplnit všechny požadavky ideálního obvazového materiálu. Slibným moderním materiálem je krytí na bázi nanovláknového PLA. Tento polymer vyniká svou biokompatibilitou, flexibilitou a zejména unikátní dvoufázovou biodegradabilitou. Dokonale napodobuje strukturu a funkci extracelulární matrix. Jak jsme prokázali, mimo proliferační a reepitelizační fázi má i stimulační vliv na iniciální zánětlivou fázi hojení rány. Slabinou zůstává fakt, že většina prací zabývajících se aplikací nanovláknového PLA je prováděna v in vitro podmínkách. Zcela pak chybí srovnávací in vivo studie mezi různými typy obvazů jako zásadní mezikrok k výrobě a praktické aplikaci těchto obvazů v humánní medicíně.

Projekt byl podpořen grantem MO 3270 a MO 1012.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise, s výjimkou kongresových abstrakt a doporučených postupů.

MUDr. Kateřina Menclová

Chirurgická klinika 2. LF UK a ÚVN

U Vojenské nemocnice 1200

169 02 Praha 6

e-mail: katerina.menclova@uvn.cz

ORCID: 0000-0002-9930-8915