Stručné morfometrické poznámky k heterogenitě lymfocytů periferní krve („minireview“ s vlastními výsledky)

Souhrn

Morfometrie nukleolů v lymfocytech ať již měřená, či odhadem, v kombinaci s cytochemickými a moderními morfologickými metodami, by mohla mít i v současné době svůj význam při posuzování stavu vyšetřovaných buněk in situ, tj. i lymfocytů na roztěrových, či cytospinových preparátech. U roztěrových a cytospinových preparátů jsou však měřené hodnoty rozdílné v závislosti na rozprostření vyšetřovaných buněk.

Klíčová slova:
morfometrie nukleolů v lymfocytech

Morfologická i funkční heterogenita lymfocytů lidské periferní krve je obecně známa a je nejen dána jejich původem, ale i stupněm jejich diferenciace a maturace. Na druhé straně je méně známo, že může být i podmíněna stadiem jejich buněčného cyklu (1) i když při hodnocení na krevních nátěrech a cytospinech po panoptickém barvení se lymfocyty v různé fázi buněčného cyklu nejeví příliš odlišně. Nukleoly jsou jedním ze spolehlivých ukazatelů lymfocytární aktivity, který není příliš závislý na roztěrové technice díky jejich relativně vysoké mechanické odolnosti pro vysoký obsah nukleových kyselin a proteinů při zhotovování roztěrových a cytospinových preparátů (2). Nevýhodou je však to, že ve zralých lymfocytech, na panopticky barvených krevních roztěrech nejsou nukleoly zpravidla viditelné, neboť jsou většinou překryty jadernou chromatinovou strukturou. Tato nevýhoda je snadno odstranitelná vizualizací nukleolů jednoduchou cytochemickou metodou pro demonstraci RNA silně zředěným roztokem methylenové, či toluidinové modře McIlvainovým nárazníkem o pH 5,3, který obsahuje kyselinu citronovou (3, 4). Kyselé pH a kyselina citronová zabraňuje mj. extrakci RNA endogenní ribonukleázou a proto jsou nátěry a cytospiny po uschnutí barveny bez předchozí fixace. Při této příležitosti je nutné poznamenat, že chromatin (DNA) není zbarven a z nukleolů pozitivitu dávají jen nukleolární těla (nucleolar bodies) bez perinukleolárního chromatinu (obr. 1–4). Tato technika také umožňuje lehké zbarvení jádra jako pozadí nukleolů. Může však být užita jen na suchých krevních nátěrech a cytospinech do 24 hodin po jejich zhotovení. Na takto zpracovaných nátěrech je zcela postačující měření průměru nukleolů, resp. nukleolárních těl bez dalších výpočtů jejich objemu (5). V následujícím pojednání pro snadný přehled bude užíván termín nukleoly i když ve skutečnosti bude pojednáváno o nukleolárních tělech bez perinukleolárního chromatinu.

Průměr nukleolů může být měřen přímo měřítkem vloženým do okuláru mikroskopu po stanovení hodnoty dílků stupnice po jejich výpočtu srovnáním s dílky na objektivním mikrometru (6). V současné době průměr nukleolů lze určit nepřímo na obraze zachyceném digitální kamerou s následným měřením na obrazovce počítače vybaveného příslušným programem (kupř. ref. 5). Tento poslední typ měření je optimální a to zvláště jestliže je obraz buňky, resp. nukleolu, dostatečně zvětšen. Měření na „klasických“ mikrofotografiích již není prakticky užíváno. Je totiž zatíženo několika možnými chybami při pořizování negativu s následným kopírováním obrázku z negativu. Na druhé straně je však vhodné poznamenat, že i odhad velikosti zkušeným hodnotitelem nátěru či cytospinu může být užitečný. Průměr prsténčitých nukleolů ve zralých lymfocytech se totiž pohybuje kolem 1 μm (viz níže, obr. 1, 2) a slouží jako základ pro srovnávání s většími či menšími nukleoly.

Na roztěrových preparátech je střední hodnota průměru nukleolů v lymfocytech zdravých osob, tj. dárců krve 1,2 ± 0,1 μm (5). Histogram pak ukázal, že průměr největšího počtu nukleolů (77,4 ± 5,1 %) se pohybuje mezi 0,9 a 1,5 μm. Střední hodnota nukleolů v lymfocytech na cytospinových preparátech je však nižší (1,0 ± 0,2 μm), i když byly tyto buňky měřeny na jejich periferii, která se blíží rozprostřením roztěrovým preparátům. Podle histogramů průměr většiny nukleolů se pohyboval mezi 0,7 a 1,1 μm. Při provedené korekci přičtením rozdílu mezi průměrnými hodnotami na roztěrových a cytospinových preparátech se však rozdíl vyrovnává a střední hodnota průměru by opět činila 1,2 μm. Podle histogramu průměr většiny nukleolů v lymfocytech (68,7 ± 6,3 %) by se opět pohyboval mezi 0,9 a 1,5 μm i když jejich zastoupení na roztěrových a cytospinových preparátech je rozdílné.

Heterogenita „zralých lymfocytů“ s hrubou chromatinovou strukturou by mohla být podmíněna i rozdílem jejich stavu v buněčném cyklu. Většina lymfocytů s nukleolárním průměrem mezi 0,9–1,5 μm je patrně v G0/G1 fázi buněčného cyklu. Podle předchozích studií takové buňky v této fázi buněčného cyklu obsahují jen malé nukleoly (1, 7). Nadto tyto nukleoly bez ohledu zda jsou v T, či B lymfocytech, mají prsténčitý charakter (obr. 1, 2) a jsou odrazem snížené transkripce RNA (viz 8, 9). Větší nukleoly s průměrem nad 1.5 μm pak jsou charakteristické pro stimulované lymfocyty v dalších fázích buněčného cyklu, tj. v pozdní G1, S a G2 fázi (kupř. ref. 10). Takové nukleoly ztrácí také prsténčitý charakter (obr. 3) a jejich průměr se zvyšuje. Kupř. 6 hodin po stimulaci T lymfocytů fytohemaglutininem (časná G1 fáze) jejich průměr je 1,7 μm a v dalších fázích buněčného cyklu dosahuje hodnot až nad 2 μm. Jestliže se pohyboval u nestimulovaných lymfocytů podle histogramu průměr většiny nukleolů mezi 0,9 až 1,5 μm, pak u stimulovaných lymfocytů přesahoval průměr většiny jadérek (78,5 ±1,5 %) 2 μm. Stimulované lymfocyty se transformující v blasty s velkými nukleoly, ve srovnání s klidovými buňkami s prsténčitými jadérky, jsou charakterizovány mnohonásobnou transkripcí rRNA (viz 2, 11, 12). Ostatně velikost nukleolů odpovídá jejich aktivitě (13).

Malé nukleoly – mikronukleoly – s průměrem menším než 0,9 μm na nátěrech, resp. 0,7 μm na cytospinech, jsou charakteristické pro terminální lymfocyty (8) za předpokladu, že jsou jediným typem nukleolů v těchto buňkách (obr. 4). V mikronukleolech je transkripce RNA zastavena. Procento mikronukleolů v lymfocytech zpravidla nepřesahuje 15 %. Mikronukleoly přítomné v jádrech lymfocytů vedle větších prsténčitých jadérek, nebo ještě větších jadérek s relativně uniformní distribucí RNA, představují satelitní nukleoly. Ty představují „reverzibilně odložené“ nukleolární organizátory mimo hlavní jadérko (8).

Z předchozího vyplývá, že velikost nukleolů může být užitečným vodítkem při posuzování lymfocytů na nátěrech či cytosinech, a to nejen u zdravých osob, ale i za patologických stavů. Může napovědět, zda a kolik lymfocytů je v klidovém či „aktivovaném“ stavu včetně proliferace. Důležité je také to, že lze hodnotit i jednotlivé buňky. Metoda k vizualizaci jadérek je velmi jednoduchá a lehce zvládnutelná. K hodnocení jejich velikosti často postačí i velmi jednoduchý metodický přístup bez potřeby vyjadřování v absolutních hodnotách, resp. jednotkách. Je však samozřejmé, že optimální je měření přímo v μm na digitalizovaném obraze na počítačové obrazovce za užití příslušného programu (kupř. ref. 5). U nemocných s různým typem chorob včetně leukemií může být průměr jadérek lymfocytů velmi odlišný v závislosti na chorobě a stavu nemocného. Je nezbytné míti na paměti, že vystihuje stav nukleolární transkripce a tím i jednotlivých lymfocytů bez ohledu na jejich původ. Kupříkladu u nemocného s B-CLL bez cytostatické léčby při přijetí k hospitalizaci, střední hodnota průměru nukleolů v lymfocytech byla jen lehce zvýšená, avšak histogram ukázal snížení procenta nukleolů s průměrem 0,9–1,5 μm svědčící o nárůstu buněk v jiné fázi cyklu než G0/G1. Je také známo, že velikost nukleolů může být ovlivněna různými léky včetně cytostatik, ať již jde o leukemické, či neleukemické lymfocyty (14–18). Není bez zajímavosti, že velikost nukleolů v lymfocytech se také mění v závislosti na cirkadiánním rytmu (19).  

Poděkování

Autor by chtěl vyjádřit poděkování všem, kteří umožnili soustavná studia nukleolů v krevních buňkách. Předložené pojednání bylo částečně podpořeno Min. zdrav. VZ 0002373601.

Prof. MUDr. Karel Smetana, DrSc.

Ústav hematologie a krevní transfuze

U nemocnice 1

128 20 Praha 2

e-mail: karel.smetana@uhkt.cz

Doručeno do redakce: 15. 12. 2009

Přijato po recenzi: 18. 1. 2010