MikroRNA v patogenezi renálního karcinomu a jejich využití pro stanovení diagnózy a prognózy RCC

Súhrn

MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující RNA, které regulují genovou expresi na posttranskripční ­úrovni. Zúčastňují se řady kritických biologických procesů včetně onkogeneze. V patogenezi ­karcinomu z renálních buněk (renal cell carcinoma – RCC) mohou působit jako onkogeny i jako tumor supresory. Prostřednictvím cílových proteinů různých signálních drah ovlivňují apoptózu, buněčný růst, migraci, invazi, proliferaci, formaci buněčných kolonií či angiogenezi a jsou přímo zapojeny do procesů hypoxie a epiteliálně-mezenchymální proměny. Odlišně exprimované hladiny miRNA umožňují rozlišení zdravé a nádorové tkáně ledviny a dokonce jednotlivých podtypů RCC. Cirkulující a močové miRNA jsou potenciálními biomarkery pro neinvazivní diagnostiku RCC a sledování relapsu onemocnění. Navíc je prokázána prognostická hodnota některých miRNA, a to jak z hlediska identifikace vysoce rizikových primárních tumorů, tak z hlediska odpovědi na biologickou léčbu u metastatických nádorů. Cílem článku je poskytnout přehlednou a co nejaktuálnější informaci o roli miRNA v patogenezi RCC a miRNA využitelných pro diagnostiku a stanovení prognózy RCC.

Klíčová slova:
mikroRNA, karcinom z renálních buněk, biomarker, patogeneze, diagnostika, prognóza

Úvod

Karcinom z renálních buněk tvoří 2–3 % všech maligních nádorů [1]. Navzdory kontinuálnímu zvyšování relativního přežívání během posledních 30 let zůstává jedním z nejletálnějších urologických nádorů s pětiletým relativním přežíváním 71,8 % [2]. V době diagnózy je 17 % nádorů lokálně pokročilých a 17 % metastatických, s pětiletým relativním přežíváním 64,2 %, resp. 12,3 % [2]. Základní metodou léčby je léčba chirurgická, s narůstajícím trendem k záchovným výkonům, zejména u malých nádorů (T1a) [3]. U starších pacientů nebo pacientů s vážnými komorbiditami lze zvolit observaci [4].

Vzhledem k tomu, že kromě zobrazovacích vyšetření není k dispozici jiná spolehlivá modalita pro diagnostiku a sledování onemocnění, pokračuje intenzivní výzkum s cílem identifikace biomarkerů pro časnou detekci, stanovení prognózy a sledování relapsu RCC.

MikroRNA jsou krátké nekódující RNA, které regulují genovou expresi na posttranskripční úrovni prostřednictvím vazby na svou cílovou mRNA, čímž dochází k její inhibici a/anebo degradaci [5]. Zúčastňují se řady kritických biologických procesů, jako je buněčný růst, diferenciace nebo apoptóza. Inhibicí tvorby proteinů svých cílových genů (onkogenů nebo tumor supresorových genů) mohou ve výsledku působit jako onkogeny nebo jako tumor supresory [6]. Odlišná exprese různých miRNA je prokázána u mnoha nádorových onemocnění včetně RCC [7].

MikroRNA v patogenezi RCC

Typickým znakem světlobuněčného RCC (clear-cell RCC – ccRCC) je inaktivace VHL genu, která je odpovědná za vznik prakticky všech familiárních a dvou třetin sporadických ccRCC [8]. Mutace VHL genu a zablokování tvorby jeho produktu, VHL proteinu, vede k neregulované expresi ­HIF-1α a HIF-2α s následnou produkcí tumorigenních cílových produktů, jako jsou VEGF, PDGF, TGFα a Glut1 [9]. VHL dependentní regulace byla pozorována u několika miRNA (miR-210, miR-155, ­let-7i, ­miR-8a) [10]. MiR-210 je HIF-1 dependentní (při hypoxii dochází k její zvýšené expresi), ale některé nádory bez známek VHL inaktivace vykazují rovněž zvýšené hladiny miR-210, což svědčí pro alternativní mechanizmy aktivace HIF, navíc v případě absence HIF-1 je miR-210 regulovaná prostřednictvím HIF-2 [11]. Asociace mezi expresí miR-210 a přežíváním pacientů podporuje předpoklad, že miR-210 není pouze markerem hypoxie, ale alterací genové exprese ovlivňuje samotnou povahu nádoru [10]. Cílovými proteiny miR-210 jsou proteiny ICSU 1, 2, které regulují mitochondriální transportní dráhy a vysvětlují rysy anaerobního chování nádorových buněk RCC. Útlum exprese miR-210 vede k stimulaci buněčné migrace a invazivního potenciálu RCC [12]. VHL a HIF-1 geny jsou cílovými geny i jiných miRNA, např. miR-17-5p a miR-224 [13]. Silná negativní korelace mezi expresí rodiny miR-200 (miR-200a/200b/200c/429/141) a hladinami VEGF svědčí pro regulaci HIF kaskády i těmito miRNA – ztráta regulace je pak odpovědná za aktivaci HIF [14]. U rodiny ­miR-200 je navíc popsána indukce epiteliálně-mezenchymální proměny (tedy proměny buněk epitelu v buňky mezenchymální, což zvyšuje tendenci k jejich invazivitě a metastazování) či regulace buněčného cyklu a EphA2/p-FAK/p-Akt//MMP2/9 kaskády, jak je tomu např. u ­miR-141, asi nejznámější z uvedené skupiny tumor supresorových miRNA [15,16].

Jiné hypoxií indikované miRNA jsou miR-155 a miR-21. Mechanizmů působení miR-21 je několik – jejími cílovými geny jsou tzv. apoptosis-related geny (TIMP3, FASL, PDCD4), které aberantně eprimovaná miR-21 inhibuje, dále reguluje invazi buněk prostřednictvím KISS1 proteinu, zvyšuje buněčnou proliferaci a migraci aktivací Akt kinázy/TORC a nakonec řídí expresi cyklinu D prostřednictvím NF-kappa B-dependentní transkripce [17–20].

Potenciálními cíli miR-155 jsou tumor supresorové geny SOCS-1 a BACH1. Inhibice miR-155 vede k potlačení buněčné proliferace a indukci apoptózy nádorových buněk [21].

Další onkogenní miRNA představují cluster miR-17-5p a miR-20a, miR-122 a miR-183.

Skupina tumor supresorových miRNA je velmi rozsáhlá. Tyto miRNA jsou ve tkáni RCC down-regulovány a transfekce nádorových buněk těmito miRNA nebo obnovení jejich hladin vede ke snížení nádorového potenciálu nádorových buněk.

MiR-584 narušuje mobilitu a viabilitu buněk inhibicí ROCK-1 onkogenu [22]. MiR-215 je jednou z nejvíce down-regulovaných miRNA u metastatického RCC ve srovnání s primárním nádorem. Její cílové geny (SIP1/ZEB2) ovlivňují hlavně epite­liálně-mezenchymální proměnu [23]. ­MiR-205 inhibuje protoonkogenní protein kinázy ze skupiny Src, obnovení hladin tumor supresorové miR-138 snižuje hladinu onkogenního vimentinu v buňkách RCC a výrazně alteruje schopnost jejich invaze [24]. Jiné tumor supresorové ­miRNA ­(miR-34a, miR-101, miR-199a, miR-1285, miR-1826, miR-187, miR-135a, miR-218, cluster miR-143/145, miR-133b, miR-199a-3b) působí cestou down-regulace různých onkogenů, jako jsou c-MYC, Notch1, EZH2, GSK3 beta, TGM2, MEK1, B7-H3, caveolin 2 nebo c-Met [25–30]. Transfekce buněčných linií RCC miR-99a indukuje zastavení buněčného cyklu ve fázi G1. Vzhledem k tomu, že jako přímý cílový protein miR-99a byl identifikován mTOR (mammalian target of rapamycin), tumor supresorový efekt miR-99a je zřejmě zprostředkován inhibicí mTOR kaskády [31]. Byl prokázán vztah mezi down-regulací miR-30a a zvýšenou nádorovou angiogenezí – cílovým proteinem je endoteliální ligand DLL4 [32].

Zajímavou a dosud neobjasněnou vlastností mikroRNA je schopnost ­konkrétní miRNA působit i jako onkogen i jako tumor supresor v závislosti na typu ­nádoru. Například miR-7, která je popsána u několika zhoubných nádorů u lidí jako tumor supresorová miRNA, působí u RCC jako onkogenní miRNA [33].

Diagnostické mikroRNA v nádorové tkáni

U mnoha mikroRNA byl prokázán statisticky významný rozdíl v expresi mezi nádorovou tkání a mezi normálním renálním parechymem. Ze 470 analyzovaných miRNA identifikovali Nakada et al 43 odlišně exprimovaných miRNA mezi ccRCC a zdravým renálním parenchymem a 57 miRNA odlišně exprimovaných mezi chromofobním RCC a zdravým parenchymem. Nejvíce down-regulovanými miRNA byly miR-141 a miR-200c [34]. V jiné analýze s platformou 847 miRNA byla ve srovnání se zdravými kontrolami prokázaná v nádorové tkáni pacientů s ccRCC zvýšená exprese 38 a snížená exprese 48 ­miRNA – ­miR-16 a miR-451 byly mezi nejvíce up-regulovanými, zatímco miR-141 byla nejvíce down-regulovanou ­miRNA [35]. Juan et al popsali u pacientů s ­ccRCC 26 down-regu­lovaných a 9 up-regulovaných ­miRNA (včetně ­miR-21, ­miR-210 a ­miR-155, ­které jsou běžně popsané u jiných nádorů) [36]. Práce Chowa popisuje 80 odlišně exprimovaných miRNA u ccRCC, přičemž miR-122 a miR-200c jsou nejvíce dysregulované [37]. V Chengově studii vybraných osm miRNA byla prokázána zvýšená exprese miR-34a, miR-21 a miR--224; ­miR-141, miR-149 a miR-429 byly signifikantně down-regulovány [38]. Jako slibný biomarker pro odlišení nádorové a nenádorové tkáně se jeví miR-129-3p s diagnostickou přesností 73,5 %. Nízké hladiny jsou navíc spojeny s kratším celkovým přežíváním (overal survival – OS) i přežíváním bez nádoru (cancer-specific survival – CSS) [39].

V několika studiích byla prokázána schopnost odlišit na základě exprese různých miRNA v nádorové tkáni jednotlivé histologické podtypy RCC a onkocytom. Youssef et al vyvinuli čtyřstupňový algoritmus na základě několika spárovaných miRNA, podle kterého lze vzorek zařadit do jednoho ze dvou možných histologických typů. V každém dalším kroku se možnosti zužují (normální tkáň vs tumor; ­ccRCC vs ostatní podtypy; papilární RCC vs chromofobní RCC a onkocytom; chromofobní RCC vs onkocytom). Senzitivita pro odlišení normální tkáně od RCC je 97 %, pro určení ccRCC 100 %, papilárního RCC 97 % a pro odlišení chromofobního RCC od onkocytomu 100 % [40]. Petillova studie byla zaměřená na nejvíce genomicky příbuzné podtypy RCC (ccRCC a papilární RCC; chromofobní RCC a onkocytom), odlišně exprimované ­miRNA jsou uvedeny v tab. 1 [41]. Onkogenní miR-21 vykazuje nejvyšší hladiny u ­ccRCC a papilárního RCC. Senzitivita a specificita pro odlišení těchto dvou podtypů od chromofobního RCC a onkocytomu je 83 %, resp. 90 % [42]. Ve Wachově studii s 9 ­miRNA odlišuje kombinace expresních profilů miR--145, miR-210, ­miR-200c a ­miR-502-3p nádor od zdravé tkáně s 92,9% přesností, kombinace miR-145 a miR-502-3p má 95% přesnost pro odlišení ccRCC a papilárního RCC, kombinace miR-210 a let-7c správně zařadí subtypy papilárního RCC (typ 1 vs typ 2) v 92,3 % (tab. 1) [43].

Cirkulující mikroRNA jako potenciální biomarkery RCC

MiR-210 je studována jako sérový biomarker pro stanovení diagnózy a progrese ccRCC. Studie na 34 pacientech s ­ccRCC a 23 zdravých subjektech prokázala signifikantně vyšší hladiny miR-210 u pacientů s ccRCC (senzitivita 65 %, specificita 83 %, AUC 0,77) [44]. Podobné výsledky byly publikovány i v další studii, které navíc prokázaly u pacientů s ­ccRCC signifikantní snížení hladiny miR-210 po odstranění nádoru [45]. Při srovnání exprese miRNA v séru a nádorové tkáni pacientů s RCC identifikovali Wulfken et al 36 miRNA se zvýšenými sérovými hladinami, které byly současně up-regulovány v nádorové tkáni. Sedm z nich bylo vybráno jako potenciální diagnostické biomarkery (miR-106b, ­miR-1233, ­miR-1290, miR-210, miR-7-1, miR-320b, miR-93) [46]. Práce českých autorů popisuje jako slibné diagnostické biomarkery RCC miR-378 a miR-451. Hladiny miR-378 jsou u pacientů s RCC zvýšené, hladiny miR-451 snížené. Kombinace obou miRNA umožnila odlišení séra pacientů s RCC se senzitivitou 81 %, specificitou 83 %, AUC 0,86 [47]. Signifikantně snížené plazmatické a tkáňové hladiny byly prokázány u tumor supresorových miR-508-3p a miR-509-5p [48,49]. Cheng et al prokázali ve srovnání s benigními nálezy na ledvině signifikantně vyšší sérové hladiny miR-34a, miR-21, miR-224 a nižní hladiny miR-141 u pacientů s ccRCC, hladina miR-21 navíc korelovala se stadiem onemocnění [38]. Dále jsou popsány signifikantně vyšší plazmatické hladiny miR-221 a miR-222 u pacientů s RCC, přičemž u pacientů s metastatickými nádory byla hladina miR-221 vyšší a negativně korelovala s OS [50].

MikroRNA v moči jako potenciální biomarkery RCC

O expresi miRNA v moči pacientů s RCC je zatím velmi málo informací. Zatím v jediné studii je popsaná miR-15a, která je ve vzájemném vztahu s protein kinázou C alfa (PKC alfa), jejíž hladina je zvýšená u benigního onkocytomu, ale snížená u RCC. PKC alfa se jako součást transkripčního komplexu váže na primární transkript ­miR-15a a blokuje tvorbu miR-15a. Proto jsou hladiny miR-15a u pacientů s RCC zvýšené, zatímco u onkocytomu jsou snížené – vzhledem ke zvýšeným hodnotám v moči pacientů s RCC a naopak nedetekovatelným hladinám u onkocytomu a infekcí močových cest se miR-15a jeví jako slibný močový biomarker [51].

MikroRNA jako biomarkery prognózy RCC

Lepší klinicko-patologické charakteristiky jsou popisovány u RCC s vyšší hladinou miR-210 (nižší stadium i grade) – na základě hladin v nádorové tkáni byly stanoveny tři skupiny, přičemž nejlepší celkové přežívání bylo zaznamenáno ve skupině s vysokými hladinami miR-210 [11]. Jasná korelace byla nalezena mezi expresí ­miR-21 a klinickými charakteristikami RCC – všichni pacienti s nízkou hladinou přežili déle než pět let, zatímco u pacientů s vysokými hladinami bylo pětileté přežití pouze 50 %. Hladina miR-21 dále korelovala s T stadiem nádoru [42]. Jiná práce prokázala korelaci zvýšené hladiny miR-21 a snížené hladiny miR-126 s výskytem metastáz a horším CSS [52]. Jako nezávislý prognostický faktor u M0 pacientů s RCC je uváděn poměr miR(21/10b). Vysoký poměr je spojen s horší prognózou, což opodstatňuje striktnější sledování u high-risk pacientů podle poměru miR(21/10b) [53]. MiR-106b je ve tkáni ccRCC výrazně up-regulována. Její hladiny jsou však signifikantně nižší u tumorů těch pacientů, u kterých došlo ke vzniku metastáz. Čeští autoři proto navrhují miR-106b jako prediktivní biomarker relapsu po nefrektomii u pacientů s ccRCC [54].

Z miRNA, které odliší metastatický a nemetastatický ccRCC, byly prokázány nejvýraznější odchylky u miR-451, miR-221, miR-30a, miR-10b a miR-29a. Skupina 4 miRNA (let-7a, let-7c, miR-26a a miR-30a) navíc umožňuje rozlišení nádorů podle klinického průběhu (primárně metastatický, nemetastatický, metastazující s odstupem). Stejná studie prokázala i korelaci několika miRNA s přežíváním bez progrese (progression-free survival – PFS) a CSS [55]. V podobné studii srovnávající primárně metastatický ccRCC, vzdálené metastázy z plic a nemetastatický ­ccRCC bylo prokázáno 14 odlišně exprimovaných miRNA. Down-regulace ­miR-30c a ­up-regulace miR-451 a miR-126 signifikantně korelovaly s PFS a CSS [56]. Na základě odlišné exprese miRNA v lokalizovaném RCC a metastatickém RCC lze pomocí vybraných miRNA identifikovat se senzitivitou 76 % a specificitou 100 % primárně vysoce rizikové a nízko rizikové nádory pro vznik metastáz [57].

Z hlediska detekce časného relapsu po nefrektomii byla prokázána down-regulace miR-143, miR-26a, miR-145, miR-10b, miR-195 a miR-126 u pacientů s relapsem [58]. Dalším možným prediktorem relapsu je miR-514, která je výrazně down-regulována u primárně metastatických nádorů a u těch, u kterých vznikla recidiva [59].

Expresní profil miRNA v periferní krvi umožňuje stratifikaci pacientů s pokročilým RCC podle odpovědi na léčbu první linie sunitinibem. Dvacet osm a 23 z 287 analyzovaných miRNA bylo spojeno s krátkodobou (progrese do šesti měsíců), resp. dlouhodobou (progrese po 18 měsících) odpovědí [60]. Se špatnou odpovědí na léčbu sunitinibem je spojena i down-regu­lace miR-141 (projevující se hlavně epiteliálně-mezenchmální proměnou epiteliálních buněk). Reintrodukce miR-141 in vitro je schopna tento proces zvrátit [61]. Recentní studie srovnávala expresi miRNA u pacientů s výraznou senzitivitou a naopak výraznou rezistencí na sunitinib. MiR-942, miR-628-5p, miR-133a a miR-484 byly ve zvýšené míře exprimovány u pacinetů rezistentních na sunitinib. MiR-942 byla sama schopna odlišit tyto dvě skupiny pacientů. Čas do progrese a OS byly signifikantně redukovány u pacientů s hladinou miR-942 nad stanovenou hraniční hodnotu [62].

Závěr

MikroRNA se při vzniku RCC uplatňují v mnoha patogenetických mechanizmech. Některé z nich jsou zapojeny do regulace konkrétních signálních drah, u mnoha odlišně exprimovaných miRNA však cílové geny zatím nejsou objasněny. Odlišné hladiny miRNA v tkáni, séru/plazmě a moči pacientů s RCC jsou atraktivním cílem pro hledání biomarkerů použitelných v diagnostice a sledování. MiRNA analýza primárního tumoru může pomoci ve stanovení individuální prognózy pacientů. V blízké budoucnosti by se navíc některé ze zmíněných mikroRNA mohly stát novými terapeutickými cíli RCC.

MUDr. Michal Fedorko, FEBU

Urologická klinika LF MU a FN Brno

Jihlavská 20, 625 00 Brno

michal.fedorko@fnbrno.cz