Genetika a farmakogenetika osteoporózy

Súhrn

Osteoporóza je závažné onemocnění charakterizované vysokou morbiditou a mortalitou v důsledku atraumatických fraktur. Kromě vlivu vnějšího prostředí se v patogeneze osteoporózy uplatňují faktory vnitřní (hormonální nerovnováha a genetické pozadí). Článek podává přehled kandidátních genů pro osteoporózu, které klasifikuje podle metabolických okruhů regulujících minerální denzitu nebo kvalitu kosti (okruh estrogenní, RANKL/RANK/OPG, mevalonátový, okruh Wnt, geny pro kolagen a vitamin D). Zabývá se také perspektivou praktického využití farmakogenetiky (identifikace jednotlivých kandidátních genů pomocí PCR) nebo farmakogenomiky (plošné měření škály genů pomocí GWAS) při výběru optimální léčby osteoporózy. Potencionálními prediktory odpovědi na antiresorpční léčbu jsou geny pro ER, FDPS, Cyp19A1, VDR, Col 1A1 a gen pro signalizaci Wnt. Polymorfizmy genů CYP2C, ale také FDPS mohou naopak identifikovat nemocné s vysokým rizikem nežádoucí odpovědi na bisfosfonáty (osteonekróza čelisti). Limitujícím faktorem výzkumu genetiky osteoporózy je nedostatečný konsenzus výsledků asociačních studií. Vysvětlení kontroverzních výsledků lze hledat v rozdílných metodických přístupech (rozsah a homogenita souboru, etnické rozdíly nebo vazebná nerovnováha mezi geny). Klíčovým úskalím asociačních studií je nízká variabilita (7-10 %) kostních fenotypů, které souvisí se zkoumaným genem. Nicméně identifikace nových genů a ověřování jejich asociace s kostními parametry oběma metodami zůstává velkou výzvou s cílem optimalizace prevence a léčby osteoporózy.

Klíčová slova:
farmakogenetika osteoporózy – kalcitonin – kandidátní geny pro osteoporózu – osteoporóza – vitamin D

Úvod

Osteoporóza je závažné onemocnění s vysokou incidencí. Včasná identifikace rizikových jedinců v premorbidním stadiu je prvořadým předpokladem účinné prevence osteoporózy. Známými příčinami nízké kostní denzity jsou hypoestrinizmus, výživová nedostatečnost (deficit kalcia, vitaminů D a K), omezení pohybové aktivity, „frailty“ syndrom, nikotinizmus nebo nadměrná konzumace alkoholu. Se stoupajícím výskytem autoimunitních, revmatických a dalších chorob přibývá nemocných s osteoporózou indukovanou glukokortikoidy a imunosupresivy, antiepileptiky, antikoagulačními látkami nebo i samotným onemocněním.

Výsledky studií u postižených rodin potvrzují, že osteoporóza je onemocněním dědičným. Je známo, že dcery (vnučky) žen s nízkou hodnotou kostní denzity onemocní osteoporózou častěji než dcery (vnučky) žen s normální kostní denzitou [1].

Míra heritability kostních fenotypů (ztráta kostní denzity, biochemické ukazatele remodelace, struktura a rozměry kosti nebo počet fraktur) byla měřena u dvojčat pomocí formule H² = 2 × (rMz – rDz), kde rMz a rDz jsou korelace zjištěné u monozygotních a dizygotních dvojčat. H² vyjadřuje míru geneticky determinované variace kostního fenotypu [2]. Udává se, že heritabilita kostní denzity je 60–80 %, neboli 60–80 % variace kostního minerálu lze vysvětlit genetickým pozadím. Heritabilita kostní denzity se může v různých lokalizacích skeletu lišit. Bylo zjištěno, že zatímco H2 v lumbální páteři je 0,89, v krčku femoru, kde se více uplatňuje vliv mechanické zátěže, je H2 0,77 [3].

Původně byly identifikovány chromozomové lokusy predikující hodnotu kostní hmoty a její fragilitu (lokusy 1p36, 2p21, 5q33–35, 6p11–12 a 11q12–13), kostní geometrii (4p, 4q, 5q, 17 q a 19p) a remodelaci kosti (16q a 20q), později pak alelické varianty jednonukleotidových polymorfizmů (SNP) kontrolujících kostní fenotypy (polymorfizmy v genech pro ERα, VDR, CTR, růstové faktory TGFβ1, BMP-4, IGF-1, CYP17 nebo LRP5). Na základě výsledků asociačních studií lze kandidátní geny pro osteoporózu diferencovat podle okruhů regulujících kostní metabolizmus, a to klasicky pomocí PCR (farmakogenetika) nebo plošnou analýzou široké škály genů pomocí GWAS (genom wide association studies) prováděnou v jediném měření (farmakogenomika) [4]. Obě zmíněné metody se vzájemně doplňují.

Přehled kandidátních genů pro osteoporózu podle okruhů modulujících kostní metabolizmus

Okruh estrogenní

Ovariální estrogeny prostřednictvím receptorů ER1 (ERα) a ER2 (ERβ) v kosti tlumí resorpci kosti přímo nebo inhibicí produkce osteoresorpčních cytokinů (interleukin 1, TNFα). Proto byly analyzovány vztahy mezi polymorfizmy PvuII nebo Xba1 v genu pro ER a kostním fenotypem. Metaanalýza 22 studií u 5 000 žen například zjistila, že XX genotyp polymorfizmu XbaI byl asociován s vyšší hodnotou kostní denzity v páteři i krčku femoru. Další metaanalýza 19 000 probandů z evropských center nalezla asociaci mezi ERα a rizikem fraktur, která však ne vždy korelovala se vztahem ke kostní denzitě [5,6]. U kavkazoidní populace byla u žen zjištěna asociace jednoho SNP v genu pro ERβ s kostní denzitou, zatímco u mužů se ke kostní denzitě vázaly 3 SNP ve stejném genu [7]. Tato studie ukazuje na určitou sexuální diferenciaci ve vazbě genu ke kostnímu fenotypu.

Regulační efekt estrogenu na skelet má pravděpodobně širší sféru působení. Geny pro ER modulují kostní denzitu nejen přímo, ale také prostřednictvím prekurzorů sexuálních steroidů nebo vazebných bílkovin pro sexuální steroidy (SHBG). Sami jsme v pilotní studii ukázali, že polymorfizmus Xba1 v ERα je u postmenopauzálních žen asociován s hladinou androstendionu [8]. Vztah ke kostní denzitě byl pozorován také u polymorfizmu v genu pro SHBG [9]. Kostní denzitu pravděpodobně moduluje také CYP19A1 (lokalizovaný na 15. chromozomu), který primárně reguluje aromatizaci androgenů na estrogen [10].

RANK- RANKL-OPG (základní okruh regulující remodelaci kosti)

RANKL je bílkovina z rodiny tumor necrosis factor (TNF), produkovaná osteoblasty a kódovaná genem TNFRSF11 (TNFRSF11A). RANKL je cílovou molekulou osteoresorpčních cytokinů, proto nepřekvapuje, že mezi kostními parametry a geny kódujícími produkci cytokinů je vzájemný vztah. Czerny et al [11] u souboru 226 osteoporotických a 224 zdravých postmenopauzálních žen nalezl asociaci mezi polymorfizmem 174/C v genu pro IL1α a kostní denzitou, ale pouze u skupiny osteoporotických žen. Regulační vliv genu pro IL1α na kostní denzitu tedy zřejmě závisí na remodelační aktivitě kosti.

Kandidátním genem pro OPG (solubilní falešný receptor pro RANKL), který blokuje vazbu RANKL na RANK, je TNFRSF11B. U postmenopauzálních žen čínské populace byl nalezen vztah alely G v genu pro OPG (polymorfiz­my A163G a T245G) k riziku osteoporózy [12]. Podobně Mencej-Bedrač et al [13] u souboru 478 postmenopauzálních žen nalezli vztah polymorfizmů 1181G≥C a 245T≥G v genu TNFRSF11B ke kostní denzitě. Tato asociace však nebyla potvrzena studií na velkém souboru australských žen, v níž byly analyzovány polymorfizmy G1181C a T950C a A163G [14]. Neuspokojivý konsenzus těchto studií pravděpodobně souvisí s rozdílnou frekvencí alelických kombinací u jednotlivých populací.

Wnt okruh

Wnt signalizace obecně moduluje diferenciaci buněk jednak nekanonickou cestou (prostřednictvím signálu kalciového nebo cAMP) a jednak cestou kanonickou, v níž ústřední roli hraje β katenin. Diferenciace osteoblastů je převážně pod kontrolou kanonické signalizační dráhy. Βeta-katenin po vazbě na receptorové proteiny LRP (low density lipoprotein receptor-related protein) a FZD (frizzled receptors) je přenesen do buněčného jádra, v němž po vazbě na transkripční faktor TCFS evokuje proliferaci a diferenciaci pre-osteoblastů [15,16]. Wnt okruh má tedy osteoanabolický efekt. Inhibitory Wnt jsou SFRP3 (kódovaný genem FRZB), DKK1–4 a sklerostin (kódovaný genem SOST). Bylo zjištěno, že protilátky proti některému z těchto inhibitorů (např. antisklerostinové protilátky) mohou zvýšit hodnotu kostní denzity u hypoestrinních potkanů [17]. Wnt okruh je kontrolován genem LRP5. Inaktivační mutace v LRP5 se u člověka manifestuje jako juvenilní osteoporóza, aktivační mutace naopak jako osteopetróza. Multicentrická studie u 37 534 účastníků z Evropy a severní Ameriky ukázala, že polymorfizmy V667M (v exonu 9) a A1330V (v exonu 18) tohoto genu byly asociovány s nízkou hodnotou kostní denzity a vyšším výskytem fraktur [18].

Kolagen typu I

Kolagen I, jehož α řetězec je kódován genem COL1A1, je klíčovým ukazatelem kvality kosti. Prediktivní význam genu COL1A1 byl potvrzen studií Uitterlindena [19]. Autoři zjistili, že kombinace alel S a s v polymorfizmu Sp1 COL1A1 u bílé populace je asociována s rizikem fraktur. Nositelé kombinace ss měli toto riziko 2,7krát vyšší než nositelé alely S. Vztah mezi COL1A1 a rizikem fraktur byl později potvrzen dalšími autory [20,21].

Vitamin D a kalcitonin

Aktivní metabolit vitaminu D [1,25(OH)₂D₃] je klíčovým regulátorem kostního metabolizmu. Aktivuje specifický receptor (VDR) prostřednictvím responzibilních elementů (VDRE) a moduluje funkci receptoru pro kyselinu retinovou (RXRV), s nímž tvoří heterodimérní komplexy. Po vazbě na osteoblastický VDR, 1,25(OH)₂D₃ aktivuje syntézu alkalické fosfatázy a osteokalcinu v kosti, ale současně, v závislosti na koncentraci v mediu a době inkubace, aktivuje tvorbu osteoklastů [22]. Ve vysokých koncentracích tedy 1,25(OH)₂D₃ zvýší kostní resorpci. Homeostázu kalcia in vivo 1,25(OH)₂D₃ reguluje i na mimokostních úrovních. Snižuje ztráty kalcia a fosforu ledvinami a stimuluje jejich absorpci ve střevě, čímž zajišťuje adekvátní mineralizaci kostní matrix [5].

Gen pro VDR byl prvním kandidátním genem, u něhož byla Morrisonem zjištěna asociace s kostní denzitou. Efekt genotypu VDR (polymorfizmy TaqI, BsmI a ApaI) byl nejsilnější u premenopauzálních žen a s věkem se snižoval [23]. Asociace VDR s kostní denzitou však byla potvrzena jen v ojedinělých studiích [24]. Vztah VDR ke kostní denzitě nebyl potvrzen ani metodou geonome wide association study (GWAS). Byla však nalezena asociace mezi polymorfizmy kódujícími protein vázající vitamin D (VDBP) a hladinu cirkulujícího 25(OH)D. Gen pro VDBP je tedy, podobně jako CYP2R1, dalším nepřímým prediktorem rizika osteoporózy [5].

Kost je základní cílovou tkání kalcitoninu. Asociace mezi receptorem pro kalcitonin (CTR) a kostní hmotou byla nalezena v několika studiích. U zhruba 700 perimenopauzálních a postmenopauzálních žen byl demonstrován vztah mezi genotypem CTR (kombinace alel CC) a kostní hmotou. Vazba však byla silnější u mladších žen souboru [26]. V pilotních studiích byl u postmenopauzálních žen zaznamenán vztah CTR (polymorfizmus C1377T) ke kostní denzitě [26,27]. Avšak další studie konsenzus nepřinesly. U mladých mužů řecké národnosti nebyla nalezena asociace CTR s kostní denzitou předloktí [28]. Efekt genu tedy zřejmě závisí nejen na věku, ale i pohlaví a etniku. Konečnou odpověď by měly přinést analýzy u větších homogenních souborů a také metoda GWAS.

Mevalonátový okruh

Jde o cílový okruh pro aminobisfosfonáty (alendronát, ibandronát, rizedronát, zoledronát), které blokují syntézu cholesterolu na úrovni enzymu farnesyldifosfátsyntázy (FDPS). Důsledkem této blokády je akumulace neprenylovaných proteinů, které tlumí funkci osteoklastů a urychlují jejich zánik. Protektivní vliv bisfosfonátů na skelet mimoto spočívá ve zpomalení apoptózy osteoblastů a osteocytů [5].

Další geny s potenciálním efektem na kostní metabolizmus

Insuficience enzymu laktázy štěpící laktózu ve střevě vede ke gastrointestinální intoleranci mléčných produktů a sekundárně k deficitu kalcia a k osteopenii (osteoporóze). Gen kódující syntézu laktázy může mít tedy prediktivní význam pro kvalitu kostní hmoty [1]. Relevantní studie prokazující vztah tohoto genu ke kostním parametrům zatím chybí. K riziku fraktur má vztah také vysoká hladina homocysteinu kontrolovaná genem pro tetrahydrofolátreduktázu. U seniorské populace dvojčat byla pozorována asociace mezi polymorfizmem C677T v tomto genu a rizikem fraktur, jenž bylo 1,5krát vyšší u nositelů genotypu CT než CC a 1,5krát vyšší u genotypu CT než TT. Prediktivní význam pro vznik osteoporózy má tedy alela T tohoto polymorfizmu [2].

Dalším genem asociovaným s rizikem osteoporotických fraktur je ALDH7A1, zodpovědný za detoxikaci pro skelet toxického acetaldehydu. U asijské populace byla metodou GWAS zjištěna asociace mezi SNP rs 13182402 v tomto genu a osteoporotickými frakturami [4]. Vztah zatím nebyl popsán u bílé populace.

Riziko fraktur je dáno nejen hodnotou kostní hmoty nebo její mikrostrukturou, ale i geometrickými parametry skeletu. Protein fosfolipase c-like 1 (PLCL1) reguluje odpověď kosti na mechanickou nálož, především v kyčli. U populace žen byl metodou GWAS nalezen vztah genu PLCL1 k rozměrům kyčle [29]. Lze však očekávat etnické rozdíly ve vztahu mezi geometrickými parametry skeletu a genem pro PLCL1.

Upravené přehledy kandidátních genů pro kostní denzitu identifikovaných metodou PCR [6] uvádí tab. 1, metodou GWAS [5] tab. 2 a výběr genů vztahujících se k riziku fraktur [30] tab. 3.

Kandidátní geny pro denzitu a kvalitu kosti pravděpodobně modulují také syntézu některých osteotropních hormonů

Asociační studie u souboru 112 postmenopauzálních žen nalezly vztah sérových hladin androstendionu, prekurzoru sexuálních steroidů, a geny pro CTR [31] nebo ER [8]. U téhož souboru žen byly také zjištěny asociace mezi hladinou parathormonu a genem pro VDR [32] nebo mezi hladinou FSH a LRP5 [33]. Vztah mezi VDR a parathormonem později potvrdili Laaksonen et al [34].

Kostní denzita může mít vztah ke genu, který byl primárně identifikován jako gen regulující některý mimokostní systém. Sami jsme u souboru postmenopauzálních žen zjistili, že nositelky rizikové alely E4 v genu pro apolipoprotein (determinující metabolizmus lipidů) mají nižší hodnotu kostní denzity v páteři než nositelky alel E1, E2 a E3 [35]. Tato vesměs náhodná pozorování ukazují na integraci kalcium-fosfátového metabolizmu do regulace celého organizmu, jež se vyvinula v průběhu evoluce. Potvrzení těchto vztahů však přinesou další studie na velkých souborech s využitím GWAS.

Farmakogenetika osteoporózy

Cílem farmakogenetiky je individuální výběr optimálního farmaka, u něhož lze předpokládat nejvyšší efektivitu léčby při nejnižším riziku vedlejších účinků. Studována byla farmakogenetika antiresorpčních látek (estrogenů, SERM a bisfosfonátů).

Polymorfizmy determinující odpověď kosti na estrogen

Byly nalezeny asociace mezi odpovědí kosti na estrogen nebo SERM a polymorfizmy PvuII v ERα a A266G v genu pro LRP5 [5,36,37]. Tyto asociace bude třeba potvrdit dalšími studiemi.

Geny modulující odpověď kosti na bisfosfonáty

Gen mevalonátového okruhu FDPS má pravděpodobně význam pro predikci odpovědi skeletu na bisfosfonáty. Polymorfizmy rs2297480 a rs1126435v genu pro FDPS byly u postmenopauzálních žen bílé populace asociovány s odpovědí kosti na dlouhodobou léčbu bisfosfonáty. Nositelky alely A měly lepší odpověď kostní denzity i biochemických ukazatelů na alendronát a ibandronát [38]. Podobně u španělských žen byla nalezena asociace mezi polymorfizmy rs2297480 a rs1164359 v genu pro FDPS a odpovědí kosti na léčbu alendronátem nebo risedronátem. Vzestup kostní denzity o 1 % byl zaznamenán u žen genotypu AA polymorfizmu rs2297480, naopak u nositelek genotypu CC hodnota kostní denzity klesla o 1,6 %. Lepší odpověď skeletu na bisfosfonáty byla také pozorována u nositelek alely G v polymorfizmu rs1126435 [39]. Naopak rizikovou alelou, která může predikovat nežádoucí účinek bisfosfonátů na skelet, je alela G (polymorfizmus rs17024608) v genu RBMS3. Vztah odpovědi kosti na alendronát ke genu pro OPG byl zatím nalezen pouze u čínských postmenopauzálních žen [5]. Studie analyzující asociaci genu mevalonátového okruhu s odpovědí na parathormon nebo denosumab nebo s rizikem vedlejších účinků zatím nebyly publikovány.

S odpovědí kostní hmoty na dlouhodobou léčbu bisfosfonátem byl asociován gen Sp1 COL1A1. Postmenopauzální ženy s genotypem SS dosáhly vyššího vzestupu hodnoty kostní hmoty v krčku femoru a v páteři při léčbě etidronátem než ženy s genotypem Ss nebo ss Alelou determinující odpověď kosti na bisfosfonát je tedy genotyp SS [40].

Pozitivní vztahy byly zaznamenány u mužů mezi odpovědí kostní denzity na risedronát a polymorfizmy V6677M (rs4988321) a V1330V (rs3736228) v genu pro LRP5 [41]. LRP5 má mimoto vztah k intestinální produkci serotoninu, který kostní metabolizmus ovlivňuje negativně. Gen je tedy potencionálním prediktorem rizika osteoporózy u nemocných léčených inhibitory zpětného vychytávání serotoninu (SSRI) [42].

Geny determinující odpověď kosti na podávání vitaminu D 

V placebem kontrolované studii u dívek dlouhodobě suplementovaných vitaminem D byla zjištěna asociace mezi polymorfizmy BsmI a TaqI a percentuálním vzestupem kostní denzity v několika oblastech skeletu [5,43]. Výsledky bude třeba ověřit dalšími studiemi na velkých souborech a také u dospělých žen a u mužů.

Farmakogenetika osteonekrózy komplikující léčbu bisfosfonáty

Probíhají analýzy polymorfizmů v genech VEGF a PPARG, které regulují transformaci prekurzorové pluripotentní buňky směrem k adipocytům nebo osteoblastům a genů pro osu RANK/RANKL/OPG ve vztahu k nežádoucím účinkům bisfosfonátů na skelet. Relevantní výsledky zatím nebyly publikovány [41].

Komentář a výhledy do budoucnosti

Osteoporóza je polygenní onemocnění, kde každý z kostních fenotypů (denzita, kvalita, metabolický obrat) je výsledkem interakce mezi mnoha slabými geny. „Major gene“, který by zodpovídal za manifestaci osteoporózy, se dosud identifikovat nepodařilo, a to ani s využitím nejmodernějších metod. Některá náhodná pozorování ukazují na širší vliv kandidátních genů pro osteoporózu na skelet. Zmínili jsme vztahy mezi geny ER nebo CTR a hladinami prekurzorů sexuálních steroidů a asociaci mezi LRP5 a cirkulujícím FSH, hormonem, který prostřednictvím interleukinu 1β aktivuje resorpci kosti a ve vysokých koncentracích zrychluje ztrátu kostní hmoty [44]. Regulační vliv těchto genů na hormonální ukazatele bude třeba dále ověřovat.

Genetika osteoporózy má řadu úskalí, která zatím nedovolují aplikovat získané informace do praktické osteologie. Především nebylo dosaženo jednotného konsenzu ve vztazích mezi některými kandidátními geny a kostními fenotypy. Může to být důsledek nejednotných metodických přístupů (výběr probandů, rozsah a homogenita souborů) nebo odlišné alelické frekvence u porovnávaných populací. U malých souborů lze mimoto zaznamenat falešně pozitivní výsledky způsobené vazebnou nerovnováhou v kandidátním genu, který se nachází v těsném sousedství jiného genu. Významným rušivým jevem je vliv vzájemných interakcí mezi geny (interakce mezi ER a VDR) nebo mezi genem a vnějším prostředím (životní styl, výživa, fyzická aktivita). Zvažují se i vlivy epigenetických faktorů, které prostřednictvím metylace cytozinu v DNK, modifikace histonu a malých molekul RNK (miRNK) modulují vztahy mezi sledovaným genem a fenotypem. Klíčovým problémem asociačních studií je poměrně nízká variabilita kostních fenotypů související s kandidátním genem (pohybuje se mezi 7 a 10 %) [5,6].

Těmto úskalím částečně čelí metoda GWAS, která v jednom měření umožňuje identifikovat celou škálu kandidátních genů a vyhodnotit tak vliv jejich vzájemných interakcí na příslušný fenotyp (farmakogenomika). Zatím zhruba 20 studií GWAS zaznamenalo asociaci genů s kostní denzitou, frakturami nebo geometrií skeletu [5]. Analýza provedená na 47 000 probandů nalezla 82 lokusů vztahujících se ke kostní denzitě a 6 lokusů pro fraktury [45]. Lze předpokládat, že GWAS v budoucnu umožní identifikovat geny (v DNK i miRNK) kódující vazbu farmaka na cílové receptory, jeho transportní mechanizmy, farmakokinetiku a farmakodynamiku [46].

Slabé efekty běžných variací kandidátních genů byly zaznamenány v mnohých GWAS analýzách, avšak žádný gen nepřispívá podstatnou měrou k variabilitě kostních fenotypů. Je proto možné, že kromě slabého vlivu velkého počtu běžně se vyskytujících alel k fenotypu přispívají i vzácné varianty s nízkou frekvencí alel. Odhalení vzácných variant může být problematické i v rámci GWAS. Velkou perspektivu v tomto směru představuje technologie sekvenování nové generace (NGS), která ve spojení s bioinformatickými metodami umožňuje analyzovat sekvenci celého geonomu s vysokým potenciálem identifikace i vzácných variant. Tato technologie bude v genetice (genomice) osteoporózy nabývat stále většího významu, zvláště v souvislosti s postupným snižováním nákladů na sekvenování a vývojem nových analytických nástrojů [47].

Přes veškerá úskalí a řadu dosud nezodpovězených otázek zůstává genetika (genomika) osteoporózy velkou výzvou pro další výzkum v oblasti patogeneze, diagnostiky a personalizované léčby osteoporózy.

Práce byla podpořena projektem (Ministerstva zdravotnictví) koncepčního rozvoje výzkumné organizace 00023761 (Endokrinologický ústav Praha).

prof. MUDr. Ivana Žofková, DrSc.

izofkova@upcmail.cz

Endokrinologický ústav, Praha

www.endo.cz

Doručeno do redakce 13. 2. 2014

Přijato po recenzi 27. 3. 2014