Analýza sérových hladin vybraných bio­logických ukazatelů u monoklonální gamapatie nejistého významu a mnohočetného myelomu

Súhrn

Východiska:
Cílem studie bylo hodnocení sérových hladin 18 vybraných ukazatelů u monoklonální gamapatie nejistého významu a iniciální, asymptomatické fáze mnohočetného myelomu, a to i z případného potenciálního přínosu pro odlišení obou stavů.

Materiál a metody:
Analyzovaný 119členný soubor sestával z 59 jedinců s monoklonální gamapatií nejistého významu a z 60 nemocných s mnohočetným myelomem vyšetřených při diagnóze nemoci před nasazením léčby. K vyšetření sérových hladin byla použita radioenzymatická metoda (thymidinkináza), metoda imunoradiometrie (IGF‑1), technika enzymoimunoeseje (osteokalcin, osteoprotegerin, ICTP), metoda elektrochemiluminiscence (PINP), technika kvantitativní sendvičové enzymatické imunoeseje (MIP‑1α a MIP‑1β, IL‑17, osteopontin, HGF, VEGF, angiogenin, endostatin, syndekan 1/ CD₁₃₈) a systém Freelite^TM pro vyhodnocení sérových hladin volných lehkých řetězců κ a λ. Statistické šetření bylo provedeno s pomocí Pearsonova χ²- testu a U- testu dle Manna- Whithneye (p < 0,05).

Výsledky:
Statisticky vysoce významné rozdíly sérových hladin mezi monoklonální gamapatií nejistého významu a mnohočetným myelomem byly zjištěny v případě TK (0,0002), ICTP (0,001), MIP‑1α (0,002), osteopontinu (< 0,0001), HGF (< 0,0001), syndekanu- 1 (< 0,0001) a poměru volných lehkých řetězců κ/ λ (0,0002), v méně významné míře při srovnání sérových hladin angiogeninu (0,031) a endostatinu (0,011). Statisticky nevýznamně vyznělo srovnání souborů monoklonální gamapatie nejistého významu a mnohočetného myelomu při vyšetření IGF‑1, osteokalcinu, bALP, PINP, OPG, MIP‑1β, IL‑17, parathormonu a VEGF.

Závěr:
Statistická analýza odhalila významnou rozdílnost hladin u 9 z 18 vyšetřených ukazatelů, ale vzhledem k výraznému překrývání naměřených hodnot u monoklonální gamapatie nejistého významu a mnohočetného myelomu se nevyznačuje žádný z těchto parametrů schopností spolehlivého rozlišení obou srovnávaných stavů. Určitým příspěvkem k diskriminaci mnohočetného myelomu od monoklonální gamapatie nejistého významu je nález enormně zvýšených sérových hladin TK, MIP‑1α, OPN, HGF a výrazná patologie indexu VLŘ κ/ λ.

Klíčová slova:
monoklonální gamapatie nejistého významu –  mnohočetný myelom –  angiogeneze –  cytokiny –  metabolizmus

Úvod

Problematice spolehlivé diagnostiky jed-notlivých typů monoklonálních gamapatií (MG) jako východiska specificky pojaté léčby je věnována v současnosti značná pozornost. Dokládá to nejen koncepce „multistep“ etiopatogeneze mnohočetného myelomu (MM) zahrnující plejádu postupných změn od monoklonální gamapatie nejistého významu (MGNV) k rozvinuté formě MM [1,2], ale i vypracování IMWG (International Myeloma Working Group) kritérií MGNV a MM [3]. Tato diskriminační kritéria jsou v podstatě založena na kvantitativním hodnocení konvenčních parametrů vyjadřujících zejména nálož plazmocelulární populace s vynecháním ukazatelů vyjadřujících vnitřní bio­logické vlastnosti plazmatických buněk i změny v mikroprostředí kostní dřeně. Takto pojatý diagnostický systém je tedy neúplný, nereflektuje současný stav poznání a neumožňuje vždy spolehlivé diagnostické rozlišení hraničních stavů.

Cílem předložené práce bylo vyšetření sérových hladin 18 bio­logických působků uplatňujících se v patobio­logii MM a posouzení jejich případného přínosu pro rozšíření dosavadních znalostí o rozdílnosti MGNV a MM, a případně i pro odlišení obou stavů. Vlastní pozornost se soustředila jednak na ukazatele se vztahem k proliferačním vlastnostem plazmatických buněk (TK – thymidinkináza a IGF-1, tj. inzulinu podobný růstový faktor-1), dále na markery kostního obratu (OC – osteokalcin, bALP – kostní izoenzym alkalické fosfatázy, PINP – N-terminální propeptid prokolagenu typu-I, OPG – osteoprotegerin, ICTP – karboxy-terminální telopeptid kolagenu typu-I, MIP‑1α -1β –  zánětlivý makrofágový faktor typu -1α a - 1β, OPN –  osteopontin, IL‑17 –  interleukin‑17 a PTH –  parathormon), na ukazatele s významným vztahem k angiogenezi (HGF –  hepato-cytární růstový faktor, VEGF –  vaskulární endotelový růstový faktor, ANG –  angiogenin, ES –  endostatin), ale i na zhodnocení významu vyšetření hladiny syndecanu‑ 1/ CD₁₃₈ a indexu monoklonality plazmocytů založeného na stanovení poměru koncentrací volných lehkých řetězců v séru (VLŘ) κ/ λ. Předložená studie si tedy vytkla ve srovnání s našimi předchozími analýzami podstatně širší cíl s důrazem na bio­logické ukazatele, kterým nebyla, a to ani ve světovém odborném písemnictví, věnována dostatečná pozornost [4– 8].

Soubor pacientů a metody

Analyzovanou sestavu 119 nemocných tvořilo 59 jedinců s MGNV a 60 nemocných s MM splňujících IMWG kritéria myelomu, kteří byli vyšetřeni při diagnóze nemoci před zahájením cytostatické léčby [3]. Věkový medián souboru MGNV byl 67 (31– 84) let, poměr muži/ ženy (M/ Ž) byl 0,88. V souboru nemocných s MM byl věkový medián 68 (32– 86) let a poměr M/ Ž byl 1,0. Standardní charakteristiky obou souborů, včetně zastoupení jednotlivých imunochemických typů, vyplývají z tabelárního přehledu (tab. 1). Je zřejmé, že mezi oběma porovnávanými soubory byly statisticky významné rozdíly v parametrech používaných v diagnostice a stážování MM [3,9– 11]. Při hodnocení stupně pokročilosti nemoci s pomocí stážovacího systému dle Durieho‑ Salmona (D‑ S) [9] bylo stadium 1 zastoupeno ve 12 % (n– 7), stadium 2 ve 35 % (n–21) a stadium 3 v 53 % (n– 32); podstadium A v 83 % (n– 50) a B v 17 % (n– 10), při použití IPI indexu (International Prognostic Index) [10,11] bylo stadium 1 zastoupeno ve 40 % (n– 24), stadium 2 ve 30 % (n– 18) a stadium 3 ve 30 % (n– 18).

K vyšetření hladiny thymidinkinázy v séru (TK) (0– 10 IU/ L) byla použita radioenzymatická metoda (REA kit, Immunotech, Praha), k vyšetření hladiny inzulinu podobného růstového faktoru‑ 1 (IGF‑1) (< 269 ng/ mL) bylo použito imunoradiometrické stanovení kitem Immunotech, Praha. Sérová hladina osteokalcinu (OC) (> 50 let 14– 46 ng/ mL) byla vyšetřena kitem Cobas 6000, Roche Diagnostic, osteoprotegerinu (OPG) (1,8– 6,4 pmol/ L) kitem ELISA BioVendor GmbH, C‑terminální telopeptid kolagenu typu‑ 1 (ICTP)  (0,3– 6,0 mg/ L) byl vyšetřen kitem ELISA, Orion Diagnostica Espoo, Finland, hladina kostní alkalické fosfatázy (bALP) (muži 7,3– 15,9 mg/ L, ženy 7,8– 17,2 mg/ L) byla vyšetřena s pomocí kvantitativní imunoradiometrie soupravou Immunotech, Beckman Coulter Company, zatímco sérová hladina aminokoncového propeptidu prokolagenu typu‑ 1 (PINP) (16,3– 73,9 mg/ L) byla vyšetřena s pomocí elektrochemiluminiscenčního imunostanovení ECLIA, soupravou Cobas, Roche Diagnostic. Sérová hladina parathormonu (PTH) (10– 69 ng/ L) byla stanovena oboustrannou chemiluminiscenční enzymovou imunochemickou reakcí na analyzátoru IMMULITE 2000, soupravou Siemens. Analýza sérové hladiny makrofágového zánětlivého faktoru- 1 (CCL3/ MIP‑1α) (< 46,9 pg/ mL), MIP‑1β (< 212 pg/ mL), osteopontinu (OPN) (49,2– 175 ng/ mL), interleukinu- 17 (IL‑17) (< 31,2 pg/ mL), he­patocytárního růstového faktoru (HGF) (671– 1992 pg/ mL), vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF) (62– 707 pg/ mL), angiogeninu (ANG) (196 000– 437 000 pg/ mL), endostatinu (ES) (58– 232 ng/ mL) a syndecanu- 1/ sCD₁₃₈ (Syn‑ 1) (37– 123 ng/ mL) byla provedena technikou kvantitativní sendvičové enzymatické imunoeseje, kity Quantikine R&D Systems, Minneapolis, USA. K vyhodnocení sérových hladin VLŘ v séru typu κ a λ byl použit systém Freelite^TM (The Binding Site^LTD) s rozmezím poměru řetězců κ/λ 0,26– 1,65 [12].Veškerá měření byla prováděna podle doporučení výrobce duplikátním způsobem a byla reprodukovatelná. Ke statistickému hodnocení byl použit Pearsonův χ²- test, neparametrický pořadový U- test dle Manna- Whitneye a Studentův dvouvýběrový t‑test na hranici významnosti p < 0,05.

Výsledky

Z analýzy vyplynulo, že jedinci s MGNV se vyznačují ve srovnání s nemocnými s nově stanovenou diagnózou MM odlišnými, většinou nižšími sérovými hladinami 9 z 18 vyšetřených ukazatelů, zatímco u zbývajících 9 analyzovaných působků nebyly zjištěny zřetelné rozdíly. Výskyt patologicky zvýšených hodnot vyšetřených ukazatelů v souborech 59 jedinců s MGNV a 60 pacientů s MM vyplývá z grafu 1. Je zřejmé, že z hlediska procentuálního výskytu abnormálně zvýšených hodnot byla zaznamenána jasná rozdílnost mezi MGNV a MM především v případě osteopontinu (2 vs 33 %) a MIP‑1α (0 vs 9 %), v menší míře při porovnání TK, HGF, syndekanu- 1, angiogeninu a endostatinu. Vysoký, více než 50% výskyt abnormálních hodnot byl zaznamenán u nemocných s MM v případě ICTP, TK a HGF, zatímco nízká, < 10 % frekvence, byla zaznamenána v případě MIP‑1α, MIP‑1β, VEGF a IGF‑1. Neočekávaným nálezem bylo zjištění častějšího výskytu patologicky zvýšené sérové hladiny VEGF ve skupině MGNV než MM (11 vs 4 %). K zajímavému nálezu patří i velmi podobná frekvence zvýšené hodnoty sérové hladiny bALP, PTH, OPG a IL‑17 u obou srovnávaných diagnostických skupin. Podrobná statistická analýza zaznamenala vysoce významné rozdíly sérových koncentrací vyšetřených působků mezi souborem MGNV a souborem s MM především v případě TK, ICTP, MIP‑1α, OPN, HGF, syndekanu- 1/ CD₁₃₈ a indexu VLŘ κ/ λ, v méně významné míře i v případě angiogeninu a endostatinu (tab. 2). Statisticky významný rozdíl nebyl zaznamenán při srovnání hladin MGNV vs MM v případě IGF‑1, OC, bALP, PINP, OPG, MIP‑1β, IL‑17, PTH a VEGF (tab. 2). Hlubší analýza ukázala, že i v případě statisticky vysoce významných rozdílů sérových koncentrací (< 0,0001) mezi MGNV a MM, tj. u TK, OPN, HGF a Syndekanu‑ 1 je přítomno význačné překrývání jednotlivě naměřených hodnot omezující uvažované obohacení standardně využívaných IMWG diskriminačních kritérií v odlišení MGNV od MM (graf 2). Z hlubšího rozboru navíc vyplynulo, že v případě sérové hladiny TK > 26 IU/ L, MIP‑1α >37,4 pg/ mL, OPN > 288 ng/ mL, HGF > 7 234 pg/ mL a indexu VLŘ κ/ λ < 0,11 nebo > 74,2 je možno pomýšlet s vysokou naléhavostí na MM, neboť hodnoty nad tuto mez nebyly v námi analyzovaném souboru MGNV zachyceny (tab. 2, graf 2). Tento závěr se ovšem týká jen malé části nemocných s MM, protože hodnoty vyšší než nejvyšší hodnoty zachycené v souboru MGNV byly pozorovány u MM v případě TK ve 13,7 %, u MIP‑1α ve 12 %, u OPN ve 12,7 %, u HGF v 9,1 %, ale v případě indexu VLŘ κ/ λ ve 49,1 %. Analýza zaměřená na srovnání výskytu ukazatelů hodnot vyjadřujících intenzitu kostní novotvorby snížených naopak pod dolní hranici referenčního rozmezí prokázala určité rozdíly mezi jedinci s MGNV a nemocnými s MM. U MGNV byl zaznamenán vesměs častější výskyt snížené kostní novotvorby s vyšší frekvencí subnormální hladiny příslušných působků než u MM: OC –  25 % vs 20 %, bALP –  30,5 % vs 13,5 %, PINP –  13,5 % vs 3,3 %, ale v případě OPG 15,2 % vs 15 %.

Diskuze

Je všeobecně známo, že v rámci rozlišení MGNV od MM neexistuje žádný spolehlivý ukazatel, který by umožňoval v případě hraniční situace při použití IMWG kritérií jednoznačně odlišit oba prognosticky a léčebně zásadně odlišné stavy [4,7,13]. Zatímco MGNV je pouze potenciálně maligní diskrétní klonální expanze plazmocelulárních elementů vyznačující se stabilitou a klinicky asymptomatickým průběhem, jenž nevyžaduje cytostatickou léčbu, je MM i v současnosti vesměs progresivní, stále nevyléčitelné onemocnění. Předložená studie se proto soustředila na analýzu 18 ukazatelů se vztahem k patogenezi MM a/ nebo k jeho integrálním klinickým a laboratorním projevům.

Rozvoj MM se vyznačuje progredující monoklonální proliferací a diseminací patologických plazmocytů s poklesem jejich apoptózy, přičemž v expanzi nádorové tkáně se uplatňují i změny aktivity řady působků vytvářených samotnými maligními plazmatickými buňkami a/ nebo elementy mikroprostředí kostní dřeně ovlivňující proliferační a apoptotickou homeostázu plazmatických buněk [14]. VEGF zasahuje do patogeneze MM modulací účinku nukleárního faktoru κB (NF- κB) podílejícího se na vzestupu resorpční aktivity osteoklastů, zatímco podpora angiogeneze se podílí na zvýšení proliferace, migrace a přežití myelomových buněk [15,16]. HGF, pleiotropní cytokin, podporuje proliferaci a diseminaci myelomových buněk v kostní dřeni (KD), zatímco v důsledku navozené inhibice osteoblastů se uplatňuje v rozvoji myelomové kostní nemoci i na vzrůstu denzity kapilární sítě v KD [6,17]. Syndekan‑ 1 (CD₁₃₈), exprimovaný myelomovými buňkami a uvolňovaný z jejich povrchu do oběhu, ovlivňuje migraci a invazivitu myelomových buněk prostřednictvím modulace metaloproteinázy 2 a 9 [18]. Diferenciace a aktivita osteoblastů závisí na výši poměru RANKL/ osteoprotegerin (liganda aktivátoru receptoru nukleárního faktoru- κB). Mezi uznávané, i když nepříliš spolehlivé předpovědní faktory neoplastické transformace MGNV používané v klinické praxi patří mimo vysokou hodnotu M- proteinu v séru a/ nebo v moči, sníženou koncentraci normálních imunoglobulinů, rozvoj anémie, zvýšený výskyt atypických plazmocytů v KD, výskyt cirkulujících monoklonálních plazmocytů v obvodové krvi i vyšetření imunofenotypického profilu se srovnáním zastoupení normálních- polyklonálních plazmocytů v KD včetně buněčné expanze N‑ CAM/ CD₅₆ (cytoadhezivní molekula nervových buněk), rovněž ale i zvýšení proliferačního indexu plazmatických buněk, známky zvýšené kostní remodelace zjistitelné na podkladě elevace hodnot ukazatelů kostního obratu (ICTP, izoenzymu 5b- tartarát rezistentní kyselé fosfatázy) či patologického nálezu při vyšetření skeletu a kostní dřeně s pomocí ¹⁸FDG- PET/ CT, celotělové MRI i nálezu patologické hodnoty indexu monoklonality VLŘ κ/ λ [4,11– 13,19– 21]. V současnosti platí, že molekulární mechanizmy, uplatňující se při přechodu MGNV v MM zůstávají přes podstatné dílčí pokroky stále do značné míry neobjasněny, takže v klinické praxi je nezbytné, aby v hraniční situaci rozhodlo při odlišení MGNV od MM dlouhodobé sledování stability klinicko‑laboratorního obrazu [2,4].

Z předložené studie vyplynulo, že z 18 analyzovaných bio­logických působků uplatňujících se v patobio­logii MM byly zjištěny statisticky významné rozdílné sérové koncentrace v souborech MGNV a MM pouze u 9 ukazatelů. I nynější, stejně jako předchozí analýza [5,6], ověřila významnost rozdílných hladin TK u MGNV oproti MM. Prakticky reálné využití má však omezený prostor nejen pro významné překrývání naměřených hodnot, ale i pro nízkou specifitu tohoto ukazatele s možností zvýšených sérových hladin v rámci přidruženého imunopatologického a/ nebo zánětlivého stavu. Nutno ovšem upozornit na skutečnost, že v případě hodnoty TK > 26 IU/ L nešlo v našem souboru nikdy o MGNV, ale o MM. Je nasnadě, že tento poznatek vyžaduje ověření na rozsáhlejším souboru nemocných.

Již z definice MGNV a MM vyplývá, že naprosto stěžejním kritériem v rozlišení obou stavů jsou projevy myelomové kostní nemoci (MKN) jako následku poruchy funkční homeostázy osteoklastů a osteoblastů v důsledku disharmonie osy RANKL/ OPG [19,22,23]. Myelomové elementy podílející se na vzestupu poměru RANKL/ OPG v mikroprostředí KD indukují rozvoj osteoklastogeneze, takže lze očekávat, že již v iniciální fázi MM a v předstihu změn prokazatelných na skeletu s pomocí sofistikovaných zobrazovacích metod lze počítat se zvýšenou hladinou působků se vztahem k osteoresorpci a osteoformaci. Ověřeným a citlivým indikátorem rozdílnosti intenzity kostní resorpce u MGNV a MM je ICTP [23– 25]. I tato, obdobně jako předchozí studie [5,6,8], zaznamenala abnormálně zvýšené hladiny ICTP u 73 % nemocných s MM, překvapivě ale i u 40 % jedinců s MGNV. Přes statisticky významnou rozdílnost sérových hladin ICTP u MGNV a MM nelze tohoto ukazatele pro značné vzájemné překrývání zvýšených hodnot v diskriminaci obou stavů využít.

MIP‑1α a MIP‑1β jsou nízkomolekulární pluripotentní chemokiny s prozánětlivými vlastnostmi, jež hrají významnou roli v bio­logii, patogenezi a klinickém obraze MM [19,26]. Vedle stěžejní úlohy v diferenciaci osteoklastů z preosteoklastických buněk stromatu a jejich aktivaci vedoucí k osteoklastické resorpci a rozvoji MKN se podílejí na snížení syntézy imunoglobulinů. MIP‑1α jako potentní modulátor hematopoézy indukuje útlum erytropoézy, zatímco MIP‑1β indukuje apoptózu pre‑B buněk [27– 29]. Biologické účinky MIP‑1α jsou regulovány prostřednictvím FGFR3 (receptor č. 3 fibroblastického růstového faktoru) a spojeny s aktivací RAS- MAPK signální dráhy, což ovlivňuje mj. proliferaci, migraci a přežití myelomových buněk a rychlost nádorového růstu. Byl rovněž zaznamenán vztah k délce celkového přežití [30,31]. MIP‑1α je i chemoatraktivním působkem monocytů uplatňujícím se v rozvoji neoangiogeneze KD [28,32]. Vysoká exprese MIP‑1α v myelomových plazmocytech byla prokázána u 59 %, střední u 13 % a chybějící u 28 % nemocných s MM, a to s dobrou korelací k hladině MIP‑1α v séru i ke stupni denzity kapilární sítě v KD [32]. Bylo prokázáno, že chemokiny MIP‑1α a MIP‑1β secernované myelomovými plazmocyty mají úzký vztah k tíži kostních změn [19,27,28,33]. Nemocní s MM se vyznačují zvýšenou sérovou hladinou nejen MIP‑1α, ale i angiogeninu a VEGF oproti zdravým jedincům, zatímco v případě hladin bALP a OC bylo pozorováno jejich snížení [32]. Exprese MIP‑1α i MIP‑1β myelomovými plazmocyty stejně jako koncentrace MIP‑1α v plazmě KD byla podstatně vyšší v aktivní než ve stabilní fázi myelomu stadia III i než ve stadiu I [28]. Bylo popsáno, že u nemocných s projevy MKN byla vysoká sekrece MIP‑1α a MIP‑1β myelomovými plazmocyty provázena zvýšenou ex­krecí deoxypyrolidinu močí bez zvýšení hladiny bALP a OC v séru [33]. V určitém souladu se závěry Terpose [34], který nalezl chybějící expresi MIP‑1α v plazmocytech u MGNV, vyzněl i výsledek naší studie prokazující statisticky významně nižší hodnoty MIP‑1α v séru u MGNV oproti nemocným s MM. Avšak z hlediska odlišení MM od MGNV by mohl hrát určitou diskriminační roli pouze nález neobyčejně zvýšené hodnoty MIP‑1α.

Osteopontin (OPN) je fosfoglykoprotein extracelulární matrix chovající se jako multifunkční cytokin s širokou škálou bio­logických účinků. Je exprimován a secernován buňkami kostní tkáně, ledvin, endoteliálními elementy, T‑lymfocyty, makrofágy i buňkami řady nádorů. OPN se uplatňuje v procesu adheze, chemotaxe, invaze, migrace, růstu a zábraně apoptózy normálních i neoplastických buněk, v regulaci aktivace T‑lymfocytů a syntézy imunoglobulinů B‑lymfocyty, v produkci prozánětlivých i protizánětlivých cytokinů. Rovněž byla prokázána jeho role v angiogenezi a remodelaci kostí a tkáně. Byla popsána i jeho významná úloha v regulaci buněčných signálních cest v procesu neoplastické transformace jako mediátoru nádorové progrese a metastatického šíření [35]. Stupeň imunohistochemické exprese i zvýšená hladina OPN v plazmě je významným bio­markerem klinického stadia, léčebné odezvy, prognózy a délky celkového přežití u mnoha neoplastických stavů, včetně akutní myeloidní leukémie [36]. OPN byl původně izolován z extracelulární kostní matrix a identifikován v osteoblastech jako protein modulující mineralizaci kosti. Je zapojen do procesu osteoresorpce, inhibice krystalogeneze, avšak za klíčovou je považována jeho úloha v procesu osteoklastogeneze. Podílí se na zvýšené expresi MMP- 9 (matrixové metaloproteinázy- 9) v nádorových buňkách mající úzký vztah k nádorové progresi, takže je v současnosti testován jako jeden z terčů protinádorové léčby [35]. Při analýze angiogenního potenciálu myelomových buněk podle intenzity imunohistochemické exprese VEGF a OPN byla zjištěna dobrá korelace exprese VEGF ke stupni neoangiogeneze a OPN k aktivaci NF- κB/ p65 [37]. OPN spolu s IL‑6 hraje stěžejní úlohu v růstu a přežití myelomových buněk a v rozvoji myelomové kostní nemoci [38]. Imunocytochemická analýza prokázala výraznou pozitivitu OPN v plazmatických buňkách u nemocných s rozvinutou formou MM, nikoliv u MGNV. Kultury plazmatických buněk nemocných s pokročilou formou MM produkovaly více OPN než plazmocyty nemocných s doutnající formou MM nebo MGNV, rovněž hladina OPN v plazmě byla u pacientů s MM významně vyšší než u jedinců s MGNV [39]. Výše uvedené poznatky, ale i nedostatečná dosavadní pozornost věnovaná úloze OPN u MM nás vedla k porovnání jeho sérových hladin u MGNV a MM. Za významné považujeme zjištění, že v souboru s MGNV byla přítomna zvýšená koncentrace OPN v séru pouze u 2 % jedinců, zatímco u MM u 33 % nemocných, přičemž průměrná hladina OPN v séru byla u MGNV dvojnásobně nižší než v souboru s MM, což přináší v případě významně zvýšených hladin OPN v séru i jistý diferenciálně‑diagnostický potenciál.

Mezi nálezy odlišující MGNV od MM patří i hustota kapilární sítě v KD, neboť MGNV je považována za stav „preangiogenní“, zatímco MM za stav „vaskulární“, v němž angiogeneze kostní dřeně je kritickým mechanizmem v patogenezi MM [15,40]. Stupeň neoangiogeneze je pak výsledkem souboje mezi pozitivními a negativními regulátory novotvorby kapilární sítě [41]. Zvýšená denzita kapilární sítě v KD u MM je vyvolána zejména nadměrnou produkcí potentních proangiogenních cytokinů typu VEGF, HGF a bazického fibroblastického růstového faktoru (bFGF) klonálními plazmocyty [15,16,40], stimulujícími vaskulogenní diferenciaci CD34+ buněk, zatímco migrace a proliferace endotelových buněk je tlumena produkcí antiangiogenních cytokinů [2,42,43]. Koncentrace HGF v plazmě periferní krve i v plazmě kostní dřeně nemocných vyšetřených při diagnóze MM je u nemocných s dosažením kompletní nebo velmi dobré parciální remise významně nižší než u nemocných s dosažením pouze částečné léčebné odezvy, a to jak s použitím vysocedávkované terapie s autologní transplantací krvetvorných buněk, tak i ve skupině relabujících nemocných léčených bortezomibem [41,42]. Tento závěr platil i pro vysokou hodnotu trombospodinu‑ 1 v plazmě KD, nikoliv ale pro VEGF, bFGF, endostatin a angiostatin [41,42]. Z nynější stejně jako z předchozích našich studií vyplynulo, že sérové hladiny HGF byly zvýšeny u nadpoloviční části nemocných s MM, zatímco v souboru s MGNV pouze u jedné pětiny nemocných [5,6,44]. Přestože statistická analýza vyzněla při srovnání hladin HGF mezi MGNV a MM vysoce významně, je diferenciálnědiagnostický přínos pro odlišení obou stavů v důsledku vzájemného překrývání hodnot velmi omezený. Pozitivním vkladem pro odlišení obou stavů je u určité části jedinců nález vysoké koncentrace HGF u MM, který se u MGNV nevyskytuje.

Angiogenin (ANG), neglykosylovaný polypeptid patřící do skupiny ribonukleáz s angiogenní a ribonukleázovou aktivitou, se uplatňuje v procesu nádorového růstu, hojení kostí i dalších patologických stavech. Je exprimován buňkami endotelu cév, fibroblasty, lymfocyty i elementy ně­kte­rých zhoubných tumorů. V procesu angiogeneze se uplatňuje prostřednictvím vazby na aktin a stimulaci aktivátoru tkáňového plazminogenu. Tvorba plazminu vede k degradaci membránového lamininu a fibronektinu a k narušení struktury bazální membrány cév, což disponuje k migraci endoteliálních buněk v průběhu neovaskularizace. Cirkulující ANG je přítomen v normálním séru, avšak podstatně zvýšené hodnoty se vyskytují např. u tepenných uzávěrových procesů a nádorů pankreatu, nebyl však prokázán vztah hladiny ANG ke stupni pokročilosti karcinomu ledviny [45]. Zato u primární makroglobulinémie koreluje výše ANG v séru s klinickým obrazem a u non‑hodgkinských lymfomů byly prokázány zvýšené hodnoty bez poklesu po chemoterapii [46]. Prakticky jediné předchozí sdělení věnované poměrům u MM prokázalo zvýšené sérové hladiny ANG, VEGF, angiopoetinu a bFGF v krvi u nemocných s MM a jejich významný pokles po absolvování léčby [34]. V námi analyzovaném souboru byla sérová hladina ANG zvýšena u 44 % nemocných s MM, ale i u 17 % jedinců s MGNV, přičemž průměrné hladiny i rozmezí naměřených hodnot se podstatně nelišily, takže statistické šetření prokázalo pouze lehkou odlišnost. Vyšetřování sérové hladiny ANG tedy neosvědčilo přínos pro odlišování MGNV od MM.

Endostatin (ES), C‑ koncový proteolytický fragment kolagenu XVIII, je specifický endogenní ihibitor angiogeneze nacházející se v bazální zóně membrány cév různých orgánů. Vstupuje do interakce s různými molekulami endoteliálních buněk, což vede v důsledku snížení anti‑apoptotických proteinů Bcl‑ 2 a Bcl‑ XI k jejich apoptóze. Molekulární mechanizmus jeho účinku není doposud plně objasněn, pravděpodobně však souvisí s vazbou heparin/ heparan sulfátu na integriny. ES je produkován endotelovými buňkami a stejně jako ostatní inhibitory angiogeneze, tj. fibronectin, thrombospodin‑1, angiostatin a destičkový faktor‑ 4, se spolu s proangiogenními faktory podílí na udržování angiogenní rovnováhy a přiměřené tvorbě cévních struktur [47]. ES inhibuje novotvorbu cév prostřednictvím svého antiproliferativního a antimigratorního účinku na endoteliální buňky, což vede ke stabilizaci cévní stěny a k útlumu nádorového růstu, takže je považován za negativní bio­marker nádorové progrese [47,48]. Úloha ES u MM je doposud nejasná a této problematice byla věnována v odborných publikacích prozatím jen omezená pozornost [16]. Zvýšené sérové hodnoty endostatinu v naší studii byly zjištěny u 15 % jedinců s MGNV a u 31 % pacientů s MM. I v této analýze bylo zjištěno významné vzájemné překrývání hodnot, přičemž průměrná koncentrace ES v séru se mezi oběma stavy lišila jen s mírnou, ale statisticky vyjádřenou významností. Vyšetřování sérových hladin ES se tedy jeví z pohledu praktického přínosu pro odlišení MGNV a MM jako nepřínosné.

Syndekan‑ 1 (sCD₁₃₈), tento transmembránový glykoprotein uvolňovaný z povrchu neoplastických plazmocytů, je jedním z ústředních regulačních působků uplatňujících se v patogenezi MM, neboť se podílí na vazbě komponent extracelulární matrix, v modulaci mnoha působků cytokinové sítě i na zpětném ovlivnění chování myelomových buněk i na stimulaci aktivity osteoblastů a útlumu činnosti osteoklastů [49– 51]. Předchozí studie prokázaly vztah zvýšené hodnoty syndekanu‑ 1 v séru k hodnotě β²- mikroglobulinu, MIG v séru, k výši odpadu Bence- Jonesovy bílkoviny močí, k prognóze MM, k rozsahu nádorové masy, k tíži infiltrace KD myelomovými plazmocyty i k aktivitě nemoci [49,51,52]. Výskyt zvýšených hodnot syndekanu- 1 v séru nemocných s MM kolísá v rozmezí 35– 79 % [6,7,49,51], v hodnoceném souboru byly zvýšené hodnoty u 44 % nemocných. Předložená analýza prokázala statisticky vysoce významný rozdíl v hladinách syndekanu‑ 1 mezi MGNV a MM, jeho využití v diferenciální diagnostice ovšem brání v souladu s předchozími zjištěními výrazné vzájemné překrývání naměřených hodnot [53,54].

Sérové hladiny VLŘ a/ nebo poměr κ/ λ u MGNV jsou u ~ 81 % mimo rozmezí normálních hodnot [12,55]. Na podkladě analýzy 1 148 nemocných s MGNV bylo zjištěno, že nemocní s abnormálním indexem VLŘ κ/ λ měli významně vyšší riziko progrese než nemocní s normální hodnotou, přičemž riziko maligní transformace narůstalo s výší κ/ λ poměru [56,57]. Výše abnormality κ/ λ indexu, tj. poměru dominantního a suprimovaného VLŘ, zřejmě odráží klonální evoluci plazmatických buněk [12]. Je nasnadě, že vzhledem k výskytu patologického indexu κ/ λ u převážné většiny jedinců s MGNV a normálním hodnotám indexu κ/ λ u ~ 4– 6 % nemocných s MM [12,58,59] není vyšetření tohoto indexu vhodné k diferenciaci MGNV od MM. I když v námi analyzované sestavě se patologické hodnoty indexu κ/ λ vyskytovaly u MGNV v 75 % a u MM v 89 %, statistické vyhodnocení celé sestavy přesto prokázalo vysoce významný rozdíl mezi výší tohoto indexu u obou srovnávaných stavů. Zjištěný rozdíl je zřejmě podmíněn převažujícím zastoupením nemocných s MM, u nichž patologická výše nebo naopak patologické snížení indexu monoklonality κ/ λ překračovaly okrajové hodnoty naměřené v souboru s MGNV (v naší sestavě κ/ λ > 74,2 a < 0,11). Z uvedeného vyplývá, že pozitivním příspěvkem k diferenciální diagnostice mezi MGNV a MM je pouze nález významně patologické hodnoty indexu κ/ λ.

Při srovnání sérové hladiny VEGF u MGNV a MM nebyla zjištěna statisticky významná rozdílnost, přestože tento vysoce potentní proangiogenní peptid se uplatňuje nejen v akceleraci angiogeneze, rozvoji myelomové kostní nemoci a celkové progrese choroby [21,34]. Naše analýza prokázala překvapivou, statisticky významně sníženou hodnotu VEGF v séru u MM oproti MGNV. K obdobnému závěru dospěla rovněž i studie Sezera [43], jež zaznamenala klesající koncentraci VEGF se stupněm pokročilosti MM (stadia 1– 3), jiné analýzy ovšem pozorovaly opačný trend [21]. Mezi příčiny tohoto úkazu lze vedle chybění přirozené rozdílnosti obou srovnávaných stavů přiřadit i použitý typ analytické metody a možnost ovlivnění hladin VEGF z jiných zdrojů, např. z krevních destiček.

Pátrání po případné rozdílnosti sérových hladin působků zasahujících do kostního metabolizmu, tj. IGF‑1, OC, bALP, PINP, OPG, MIP‑1β, IL‑17 a PTH u MGNV a MM, se ukázalo jako nepřínosné. Naše výsledky nepotvrdily předchozí pozorování, že nemocní s MM mají význačně nižší hladinu osteokalcinu než jedinci s MGNV [20,60], ani nález význačně vyšší koncentrace bALP v séru u MGNV než u MM [60]. Nutno ale uvést, že podrobnější analýza prokázala vyšší hladiny bALP a PICP u nemocných s MM především v případě přítomnosti kostních fraktur, což ale neplatilo pro hladinu OC [20].

IGF‑1, tento cytokin charakteru inzulinu podobného růstového faktoru‑ 1, je parakrinním růstovým faktorem myelomových buněk indukujícím jejich proliferaci, pokles apoptózy, invazi a migraci, případně i lékovou rezistenci, podílí se ale i na afinitě myelomových plazmocytů ke KD [61,62]. Interakce IGF‑1/ IGF‑1R hraje důležitou roli v patogenezi MM a účinek IGF‑1 je stejně jako v případě IL‑6 zprostředkován aktivací ras‑ MAPK a PI3K/ Akt‑ 1 signální kaskády a setrvalou aktivací NF‑ kB [62]. Je zajímavé, že imunohistochemická analýza prokázala aktivaci AKT‑ kinázy v plazmatických buňkách u MM, nikoliv ale u MGNV [63]. V předchozí studii bylo prokázáno významné snížení hladiny IGF‑1 v séru u MM a MGNV oproti zdravým jedincům, přičemž nemocní s MM měli podstatně nižší hladiny než jedinci s MGNV [64]. Do tohoto pilotního zjištění zapadá i námi pozorované pouze sporadické zvýšení sérové hladiny jak u MGNV, tak u MM, i chybějící rozdílnost úrovně sérových hladin. Je zřejmé, že vyšetřování sérových hladin IGF‑1 není pro odlišení MGNV a MM přínosné a je vysvětlitelné nesouladem mezi nízkou hladinou sérových hodnot a vysokou expresí IGF‑1 myelomovými plazmocyty prokázanou v předchozích studiích.

V případě PINP, tedy ukazatele vyjadřujícího stupeň osteoblastické aktivity a kostní novotvorby, odpovídají dosažené výsledky závěrům předchozích studií s chybějící rozdílností sérových hladin mezi MGNV a MM. Výskyt subnormálních hodnot byl ale u MGNV čtyřikrát častější než u MM (13,5 % vs 3,3 %), což napovídá, že nízký stupeň osteoblastické aktivity je u MGNV zřetelně častější než u MM [5,6,20,24].

I nadále existuje poměrně nepřehledná situace v hodnocení sérových hladin OPG, neboť bylo popsáno, že u MM jsou sérové hladiny OPG sníženy [65,66], ale v ně­kte­rých studiích v souladu s našimi závěry zvýšeny (32 % MM), a to i u MGNV (25 %), přičemž nebyl zjištěn mezi oběma stavy žádný významný rozdíl [5,6,67]. Mezi příčiny rozdílných nálezů patří zřejmě i skutečnost, že stanovení sérové hladiny cirkulující solubilní formy OPG není pouze odrazem aktivity OPG v mikroprostředí KD, ale i důsledkem možného původu OPG v kapilární síti a závislosti sérové hladiny na stavu renální funkce.

Interleukin‑17 je z chemického hlediska disulfidický homodimer vytvářený aktivovanými paměťovými T‑ buňkami považovaný za prostředníka mezi imunním a hematopoetickým systémem. Tento prozánětlivý cytokin stimuluje fibroblasty k tvorbě IL‑6, IL‑8, ICAM‑1 a G‑CSF a podporuje proliferaci a aktivaci T‑ buněk. Indukce polyfunkčních T‑ pomahačských buněk vytvářejících IL‑17 v kostní dřeni nemocných s MM je zprostředkována dendritickými buňkami. Ačkoliv většina cirkulujících Th‑ 17 buněk produkuje pouze IL‑17, případně IL‑2, buňky indukované dendritickými buňkami jsou polyfunkční s koexpresí IL‑17 a IFN‑gama (Th‑ 17- 1 buňky) [68]. Bylo zjištěno, že kostní dřeň nemocných s MM obsahuje oproti MGNV vysoký podíl Th‑ 17- 1 buněk. Interakce apoptotických myelomových buněk s dendritickými elementy vede k vysoké indukci Th‑ 17- 1 buněk. Naše analýza neodhalila žádné odlišnosti v hodnocení sérových hladin IL‑17 u MGNV a MM, a to jak z hlediska zastoupení jedinců s patologicky zvýšenou hodnotou, tak i z hlediska koncentrace tohoto cytokinu v séru.

Závěr

Z předložené studie vyplývá, že rozšíření IMWG kritérií o další ukazatele, které by prohloubily a zjemnily diagnostiku MGNV a MM, zůstává i nadále problémem, a to zřejmě i proto, že mezi MGNV a iniciální, asymptomatickou („dřímající“) formou MM existuje přirozená, plynulá linie přechodných stavů, vyznačujících se různou fází maligní proměny. Z širokého setu 18 bio­logických ukazatelů, jejichž sérové koncentrace byly porovnány mezi MGNV a MM, prokázaly statisticky vysoce významnou rozdílnost pouze 4 molekuly, tj. OPN, HGF, syndekan- 1 a index VLŘ κ/ λ, ve zřetelně menší míře i TK, ICTP, MIP‑1α, ANG a ES a chybějící rozdíl IGF‑1, OC, bALP, PINP, OPG, MIP‑1β, IL‑17, PTH a VEGF. Praktické využitelnosti ukazatelů s prokázanou, vysoce významně odlišnou hodnotou sérových hladin u MGNV a MM ovšem brání význačné vzájemné překrývání individuálně naměřených hodnot. Z tohoto rezervovaného hodnocení potenciálního přínosu pro zlepšení rozpoznání MM se do jisté míry vymyká pouze 5 z 18 analyzovaných ukazatelů, v případě použití horní hranice mezní koncentrace zaznamenané v souboru MGNV, tj. TK (> 26 IU/ L), MIP‑1α (> 37,4 pg/ ml), OPN (> 288 ng/ mL), HGF (> 7 234 pg/ mL) a odchylné hodnoty indexu VLŘ κ/ λ (< 0,11 nebo > 74,2). Vzhledem k tomu, že pouze u velmi malé části nemocných s MGNV bylo zjištěno zvýšení hodnoty OPN (u 2 %), osteokalcinu (4 %) a u MIP‑1α dokonce chybění zvýšené sérové hladiny, lze jako podpůrné kritérium pro diagnózu MM rozšiřující standardní IMWG kritéria [3] považovat i výrazně vysoké sérové hladiny těchto působků. Je nasnadě, že molekuly, které s mnohem významnější diskriminační schopností přispějí k rozlišení MGNV od iniciální/ asymptomatické fáze MM, snad odhalí teprve budoucí studie založené na použití molekulárně‑bio­logických technik, genové expresní analýzy či proteomiky. Ze studie vyplynulo, že snaha zaměřená na vyšetření v současnosti snadno metodicky dostupných sérových ukazatelů se neukázala v reálném světle, neboť jde o ukazatele „odvozené“, reagující nepřímo na vnitřní buněčné bio­logické děje, procesy v mikroprostředí kostní dřeně, nebo rozsah plazmocelulární masy, a nevystihuje proto klíčové rozdílnosti mezi MGNV a MM.

Podpora grantu IGA MZ ČR NR 9489, NR 9500 a VVZ MSM 6198959205.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.
The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, pruducts, or services used in the study.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.
The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers.

prof. MUDr. Vlastimil Ščudla, CSc.
III. interní klinika LF UP a FN Olomouc
I. P. Pavlova 6
775 20 Olomouc
e-mail: vlastimil.scudla@fnol.cz