XXXI. Základní, aplikovaný a klinický výzkum v onkologii

XXXI/81. Proteotypová klasifikace renálního karcinomu

Bouchal P.1, Šimoník J.1, Štefaník R.1, Bouchalová P.1, Lapčík P.1, Potěšil D.2, Podhorec J.3, Hora M.4, Poprach A.5, Fiala O.6

1 Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta, MU Brno, 2 Centrální laboratoř proteomika, CEITEC, MU Brno, 3 Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno, 4 Urologická klinika LF v Plzni UK a FN Plzeň, 5 Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno, 6 Onkologická a radioterapeutická klinika LF v Plzni UK a FN Plzeň

Renální karcinom (RCC) představuje závažné onkologické onemocnění s celosvětově druhou nejvyšší incidencí v České republice. Molekulární prognostické a prediktivní biomarkery pro RCC jsou většinově nedostupné, především pak na úrovni proteinů. Pro kvantifikaci co největšího množství proteinů spojených s tumorigenezí RCC jsme vytvořili RCC-specifickou spektrální knihovnu cílených proteomických „assays“ pro 7 960 proteinových skupin (FDR = 1 %). Následně jsme použili hmotnostní spektrometrii s datově nezávislým sběrem dat (DIA-MS) na LC-MS systému QExactive HF-X pro analýzu velmi dobře charakterizovaného souboru metastatických RCC tumorů (tréninkový soubor n = 53, validační soubor n = 22) a přilehlých nenádorových tkání (n = 17), z nichž část odpovídala a část neodpovídala na léčbu tyrosinkinázovými inhibitory (TKI). Identifikovali a validovali jsme proteinový biomarker specificky spojený se špatnou odpovědí na léčbu TKI, související rovněž s časem do dosažení nejlepší léčebné odpovědi a nesouvisející s nádorovým grade a dalšími klinickopatologickými parametry. Funkční analýzy s využitím CRISPR/Cas9 knockoutu potvrdily jeho souvislost s buněčnou migrací a invazivitou ve 2D a 3D prostředí. Podobná studie byla provedena také pro identifikaci proteinů souvisejících s relapsem lokalizovaného RCC a rovněž vedla k relevantním závěrům. Lze shrnout, že proteomika nové generace založená na DIA-MS je vysoce výkonným nástrojem pro klasifikaci tkání RCC umožňující identifikaci potenciálních prognostických biomarkerů a alternativních terapeutických cílů.

Podpořeno Ministerstvem zdravotnictví ČR, projekt č. NV19-08-00250, všechna práva vyhrazena. Podpořeno projektem Národní ústav pro výzkum rakoviny (Program EXCELES, ID Projekt č. LX22NPO5102). Financováno Evropskou unií – Next Generation EU.

XXXI/325. Establishment of glioblastoma radioresistant models for the discovery of clinically actionable therapeutic targets

JASÍK M.1, Součková K.1, Vodinská M.1, Šána J.1,2, Slabý O.1^–3

1 Central European Institute of Technology, Masaryk University Brno, Czech Republic, 2 Department of Biology, Faculty of Medicine, Masaryk University, Brno, Czech Republic, 3 Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, Czech Republic

Glioblastoma, IDH-wildtype (GBM) is the most aggressive primary brain tumor in adults, characterized by high resistance to radiation therapy and limited treatment options. Developing clinically relevant cell models that recapitulate GBM radioresistance is crucial for identifying novel therapeutic targets and improving patient outcomes. In this study, we aimed to establish and characterize GBM cell models that mimic the radioresistant phenotype observed in clinical settings, which could be leveraged to identify genes responsible for the radioresistance. Currently, the M059J and M059K cell line pair derived from a single patient is the only GBM radioresistance model available through major cell line depositors. These cell lines exhibit varying degrees of radiosensitivity attributed to deficient DNA-PK in M059J cells. However, this model represents a treatment-unrelated case of radiosensitivity as opposed to acquired radioresistance. Inspired by the existing literature, we decided to perform a comparative study by adopting two establishment approaches with a focus on the clinical relevance of these models by adhering either to radiation dose per fraction, or an administration regimen. Given that the cells in vitro would not survive 30 fractions of 2 Gy radiation over 5 weeks, which is a commonplace treatment regimen in the clinical management of GBM, these protocols have been tailored to mimic these settings as closely as possible while allowing cells to survive and develop radioresistant phenotypes. Our preliminary data show that the dose-escalation protocol (starting at 0.5 Gy with increments after each cycle and up to 2 Gy/day) is superior in establishing radioresistant phenotypes, compared to the widely utilized approach of a single dose of 2 Gy per week reported in the literature. A dose-escalation protocol is also much faster than the alternative and we believe it yields a more clinically relevant phenotype as the last two irradiation cycles consist of 2 Gy daily fractions that match the clinical practice. We have observed cell line-specific patterns of radiation response in terms of dose-dependent survival, apoptosis rates and G2/M cell cycle arrest and escape in our radioresistant models and aim to further explore driver genes driving these phenotypes by conducting functional genomics CRISPR screening complement with transcriptomic profiling and survival analysis of GBM patients in order to discover clinically actionable therapeutic targets.

XXXI/327. Vliv azacytidinu a decitabinu na expresní profil demetylačních enzymů TET u buněk mnohočetného myelomu

Němcová M.1, Minařík J.2, Smešný Trtková K.1

1 Ústav klinické a molekulární patologie, UP Olomouc, 2 Hemato-onkologická klinika LF UP a FN Olomouc

Východiska: Demetylační enzymy, kódované geny TET, jsou 2-oxoglutarát a FeII-dependentní metylcytosin dioxygenázy a jsou zodpovědné za konverzi 5-metylcytosinu na 5-hydroxymetylcytosin a jeho další oxidaci na 5-formylcytosin a 5-karboxylcytosin v procesu aktivní demetylace. Tyto enzymy hrají důležitou roli v epigenetické regulaci genové exprese, a tím i v maligních procesech. CpG oblasti v promotorových sekvencích genů TET pravděpodobně podléhají metylačním změnám, čímž může docházet k inhibici vazby transkripčních faktorů a následně snížení genové exprese. Demetylační činidla 5-azacytidin (AZA; azacytidin) a 5-aza-2’-deoxycytidin (DAC; decitabin) se v dnešní době využívají k léčbě akutní myeloidní leukemie nebo chronické myelomonocytové leukemie i dalších hematologických malignit. Vliv decitabinu a azacytidinu na expresi námi studovaných genů TET1, TET2, TET3 u buněk mnohočetného myelomu nebyl dosud detailně popsán. Materiál a metody: RNA pro analýzu cDNA expresního profilu TET enzymů byla izolována z pěti různých buněčných linií mnohočetného myelomu: RPMI8226, U266, OPM-2 a dvou sesterských linií KMS12-PE a KMS12-BM. Buňky mnohočetného myelomu byly vystaveny dvěma demetylačním činidlům: 5-azacytidin a/nebo 5-aza-2’-deoxycytidin. Analýza expresních profilů studovaných genů TET byla provedena v duplikátech ze tří nezávislých opakování pomocí kvantitativní real time PCR. Výsledky: Signifikantní zvýšení relativní exprese genu TET2 bylo detekováno u linie KMS12-PE. Změny v expresním profilu studovaných genů TET po použití demetylačních činidel však vykazují všechny testované myelomové linie, a to v závislosti na použitém činidle a jeho koncentraci. Ke změnám v expresi dochází zejména u genu TET2, což může poukazovat na přítomnost většího počtu 5-metylcytosinu promotorové oblasti tohoto genu. Závěr: Azacytidin a decitabin vykazují potenciální demetylační účinky v promotorových regulačních úsecích námi studovaných genů TET, které se projevují ve změně jejich expresního profilu. Signifikantně zvýšená exprese TET2 pak naznačuje možnost jeho využití jako markeru hypometylačního procesu spojeného s příznivou prognózou mnohočetného myelomu.

Podpořeno z: LF_2023_003 from Palacky University Olomouc; IGA_LF_2023_046; a RVO (FNOl, 00098892).

XXXI/330. Přítomnost dvojné vazby v D-kruhu struktury estronu mění jeho agonistický účinek na aktivitu estrogenového receptoru alfa na antagonistický

Voňka P.1, Tichý V.2, Kolářová T.2, Holčáková J.2, Bazgier V.3, Berka K.2, Kvasnica M.2, Oklešťková J.2, Strnad M.2, Hrstka R.1

1 MOÚ Brno, 2 UP v Olomouci

Východiska: Estrogenový receptor alfa (ERa) je klíčovým biomarkerem karcinomu prsu, který v případě hormonálně závislých karcinomů ovlivňuje jak léčebné režimy, tak prognózu pacientů. ERa je aktivován vazbou ligandu, kterým je nejčastěji steroidní molekula estradiol. Steroidy představují skupinu sloučenin, jejichž struktura obsahuje čtyřkruhový steranový skelet. Materiál a metody: Unikátní knihovna steroidních látek byla prohledána pomocí dokování s cílem nalézt nové potenciální ligandy pro ERa, které mohou mít protirakovinné vlastnosti. Účinek vybraných sloučenin na aktivitu ERa byl in vitro stanoven luciferázovým reportérovým testem, který byl za tímto účelem vyvinut. Biologický účinek po aplikaci potenciálně zajímavých látek na buňky MCF7 a MDA-MB-231 byl posléze blíže specifikován pomocí MTT testu, westernového přenosu a metod průtokové cytometrie (barvení propidium jodidem či Annexinem V). Výsledky: Hlavně dvě sloučeniny, MU-5562 a MU-5611, snižovaly aktivitu ERa srovnatelně s klinicky používanými ERa inhibitory, jako je tamoxifen či fulvestrant. Inhibiční účinek MU-5562 a MU-5611 na ERa je pravděpodobně způsoben jejich společným strukturním prvkem, kterým je dvojná vazba v D kruhu. Posléze analýza westernovým přenosem odhalila, že MU-5611 snižuje u buněk MCF7 hladinu nejen ERa jako cílového proteinu, ale také progesteronového receptoru jehož exprese je přímo regulována ERa. Kromě inhibice ERa byla také po aplikaci MU-5611 detekována změna energetického stavu mitochondrií jak u buněk MCF7, tak u buněk MDA-MB-231. Dosažené výsledky tedy ukazují, že aplikace MU-5611 vede k indukci apoptózy nezávisle na inhibici ERa, což bylo potvrzeno mimo jiné i stanovením Annexinu V pomocí průtokové cytometrie. Závěr: Dosažené výsledky dokazují, že zvolená kombinace výpočetních a experimentálních metod představuje dostatečně robustní přístup umožňující identifikaci potenciálně zajímavých sloučenin, v tomto případě se jednalo o látku MU-5611, která vykazuje dvojí mechanizmus protinádorového účinku v buňkách odvozených od karcinomu prsu.

Tato práce byla podpořena Národním ústavem pro výzkum rakoviny (Programme EXCELES, ID Project No. LX22NPO5102), MZ ČR-RVO (MOÚ, 00209805), ASCR (RVO: 61388963) a Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky prostřednictvím projektů e INFRA CZ (ID: 90140) a BBMRI.cz (identifikační kód LM2023033).

XXXI/333. Kardiovaskulární farmakoterapie u pacientek s triple negativním karcinomem prsu před a po léčbě antracykliny

Bartáková A.1, Koloušková I.2, Holánek M.2, Selingerová I.3, Stračina T.1, Kazda T.4, Nováková M.1

1 Fyziologický ústav, LF MU Brno, 2 Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno, 3 Výzkumné centrum aplikované molekulární onkologie LF MU a MOÚ Brno, 4 Klinika radiační onkologie LF MU a MOÚ Brno

Kardiovaskulární onemocnění představují v současnosti nejčastější příčinu úmrtí v rozvinutých zemích. Na druhém místě jsou v celosvětových statistikách nádorová onemocnění. U pacientů často dochází k souběhu těchto onemocnění a paralelní farmakoterapie otevírá otázku lékových interakcí, které mohou mít vliv nejen na účinky protinádorové léčby, ale i na kvalitu života a prognózu pacientů. Tato práce prezentuje retrospektivní analýzu výskytu kardiovaskulárních onemocnění a s tím související farmakoterapie u souboru 243 pacientek s diagnózou triple negativní karcinom prsu. Všechny pacientky byly léčeny v Masarykově onkologickém ústavu v letech 2015–2022 neoadjuvantní chemoterapií antracykliny. Soubor byl popsán následujícími parametry: věk, BMI, arteriální krevní tlak, ejekční frakce levé komory, EKG parametry vč. stanovení QTc, diagnostikovaná kardiovaskulární onemocnění a pravidelně užívané léčivé přípravky v době před zahájením léčby antracykliny i krátce po jejím ukončení. Analýzou bylo zjištěno, že nejčastějším kardiovaskulárním onemocněním v tomto souboru byla hypertenze (45 pacientek před a 52 po ukončení chemoterapie). Hypertenze byla před zahájením chemoterapie nejčastěji léčena blokátory vápníkových kanálů (19 pacientek), poté následovaly ACE inhibitory (18 pacientek), ATII antagonisté (17 pacientek), b-sympatolytika (16 pacientek) a diuretika (12 pacientek). Po skončení chemoterapie v léčbě hypertenze převládla b-sympatolytika (24 pacientek) následovaná blokátory vápníkových kanálů (23 pacientek), ATII antagonisty (19 pacientek), ACE inhibitory (17 pacientek) a diuretiky (11 pacientek). Výsledky analýz této retrospektivní studie sloužily k vytvoření komplexního animálního modelu umožňujícího studovat souběžné působení antracyklinů a antihypertenziv. V první části navazujícího projektu se zaměříme na účinek b-sympatolytik a blokátorů vápníkových kanálů. Navazující projekt je zacílen kromě jiného na potenciální kardioprotektivní působení antihypertenziv během antracyklinové terapie.

Práce byla realizována za podpory MUNI/LF-Sup/1064/2022, MUNI/A/1343/2022 a institucionální podpory Ministerstva zdravotnictví ČR – Koncepční rozvoj výzkumné organizace (MOÚ 00209805).

XXXI/335. Porovnání interakce proteinu HDM2 s nízkomolekulární látkou nutlin-3 a proteinem p53 metodou HDX-MS

Kučera J.1, Hárníková L.1, UHRÍK L.1, Bonczek O.1, Henek T.1, Hrabal V.1, Wang L.2, Vojtěšek B.1, Fahraeus R.3, Hernychová L.1

1 RECAMO, MOÚ Brno, 2 Department of Medical Biosciences, Umea University, Sweden, 3 INSERM, Hôpital Saint-Louis, Paris, France

Jednou z možností, jak definovat nádorová onemocnění, je nekontrolovatelné dělení buněk společně s růstem tumoru, který se může šířit napříč organizmem, a napadat tak i jeho další orgány. Protein p53 hraje důležitou roli v potlačení růstu tumoru a v organizmu tedy vystupuje jako ochránce genomu neboli senzor poškození DNA. Aktivita tohoto proteinu je však kontrolována interakcí s jiným proteinem známým jako HDM2 (z angl. human double minute). Touto interakcí dojde k ubikvitinaci p53 a jeho následné degradaci. V tumorech obvykle dochází k nadměrné expresi proteinu HDM2, a tím i k inhibici aktivity proteinu p53, což může vést k nekontrolovatelné buněčné proliferaci. Jedním z možných terapeutických přístupů je podávat látku (inhibitor), která dokáže alespoň částečně zamezit tvorbě komplexu těchto proteinů tím, že obsadí vazebné místo na HDM2 nebo vyváže p53 z proteinového komplexu s HDM2. Volný protein p53 je pak následně aktivován a zastavuje buněčný cyklus nebo odstartuje apoptózu. Jedním z těchto inhibitorů může být nízkomolekulární organická látka známá jako nutlin-3. Tato práce se zabývá konformací a dynamikou proteinu HDM2 po navázání proteinu p53 nebo látky nutlin-3. K tomuto studiu byla využita technika vodík-deuteriové výměny spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX MS). Díky HDX-MS je možné pozorovat deuteraci proteinu v různých časech a při vybraných podmínkách (volný protein, proteinový komplex apod.), což pomáhá odhalit informaci o jeho struktuře, vazebném místu, konformaci apod. V rámci těchto experimentů byla sledována a porovnávána deuterace proteinu HDM2 po interakci s p53 a s nutlin-3. Získané výsledky poukázaly, že v p53 vazebné doméně proteinu HDM2 dochází po navázání látky nutlin-3 k nižší deuteraci v porovnání s interakcí s proteinem p53. Dále byly pozorovány možné alosterické změny, které se po navázání nízkomolekulární látky objevily v neuspořádané C-koncové oblasti proteinu HDM2. Tyto výsledky potvrzují, že nutlin-3 se podobně jako p53 váže do vazebné domény proteinu HDM2, ale na rozdíl od něj pravděpodobně způsobuje změny ve strukturním uspořádání C konce tohoto proteinu. Pokračováním této pilotní studie je návrh podobných látek, jako je nutlin-3, které by mohly mít využití v léčbě rakoviny.

Podpořeno z projektů MH CZ – DRO (MMCI, 00209805), Národního ústavu pro výzkum rakoviny (Program EXCELES, LX22NPO5102, sponzorováno Evropskou unií – Next Generation EU) a Grantové agentury České republiky (19-18177Y).