Biomarkery roztroušené sklerózy –  současné možnosti a perspektivy

Súhrn

Roztroušená skleróza je chronické onemocnění centrálního nervového systému neznámé etiologie s projevy autoimunitního zánětu a neurodegenerace. Onemocnění je heterogenní s nepředvídatelnou prognózou. Průběh choroby lze monitorovat klinickými parametry a sledováním vývoje patologických změn na magnetické rezonanci. I když máme znalosti o efektu nově zaváděných léků na základě klinických studií, není možné předvídat jejich účinnost u konkrétního pa­cienta. Proto se v posledních letech prosazuje snaha najít takové laboratorní markery, které by co možná nejspolehlivěji odpověděly na otázky spojené se subklinickou aktivitou onemocnění, jeho progresí a usnadnily terapeutické rozhodnutí na základě personifikované medicíny.

Klíčová slova:
roztroušená skleróza – terapie – biomarkery

Úvod

Roztroušená skleróza (RS) je chronické zánětlivé onemocnění centrálního nervového systému s projevy degenerace, které je nejčastější netraumatickou příčinou invalidity mladých lidí. Předpokládá se, že celosvětově je chorobou postiženo kolem 2,3 mil. lidí. Akutní perivaskulární léze v oblasti bílé, ale i šedé hmoty jsou charakterizovány autoimunitním zánětem. Demyelinizace, axonální ztráta a gliové jizvy jsou typické pro chronické léze. Reparativní procesy jsou omezené, zejména v pokročilejší fázi nemoci.

Prvním klinickým příznakem RS je klinicky izolovaný syndrom (Clinically Isolated Syndrome; CIS). Po určité době se rozvíjí u 85 % pa­cientů období střídání relapsů a remisí s různě výrazným neurologickým deficitem (relaps remitující RS;  RR RS). Během 10– 15 let dochází k rozvoji sekundárně progresivní fáze choroby (SP RS). U části pa­cientů onemocnění progreduje od samého počátku (primárně progresivní RS;  PP RS) [1]. Klinická progrese souvisí s axonální degenerací, mikrogliální aktivací, mitochondriální dysfunkcí a oxidativním stresem [2]. Tyto jevy nejsou postižitelné zobrazovacími metodami.

Příčina RS není jednoznačně známá. Předpokládá se zapojení různých patogenetických mechanizmů, mezi něž patří hlavně genetické a environmentální faktory. Významná genetická predispozice k onemocnění souvisí s hlavním histokompatibilním systémem II. třídy (Human Leukocyte Antigen; HLA), konkrétně s HLA DRB1)*1501 alelou za účasti dalších alel, např. pro receptor interleukinu 2 (IL2R) a receptor interleukinu 7 (IL7R) [3]. Mezi environmentální faktory podílející se na rozvoji RS se řadí expozice viru Epstein‑Barrové, hypovitaminóza D, kouření a pravděpodobně antigenní determinanty ve střevní mikroflóře [4].

Zásadní terapeutické opatření je co nejefektivněji zasáhnout v počáteční, zánětlivé fázi onemocnění tak, aby došlo k oddálení progrese choroby a zabránění invalidizace [5]. V současné době jsme svědky narůstající palety léků ovlivňujících průběh onemocnění (Disease Modifying Drugs; DMD). Kromě klasických interferonů beta (IFNβ), glatirameracetátu, natalizumabu a fingolimodu se do léčebné praxe dostávají alemtuzumab a další perorální léky (teriflunomid a dimetyl fumarát). Při rozhodování o optimální léčbě musíme zvážit poměr benefitu oproti efektu terapie, nikterak však nebývá zohledněna výrazná heterogenita onemocnění [6]. Situaci navíc komplikuje nepředvídatelný účinek DMD.

V současné době je efekt léčby hodnocen pomocí aktivity onemocnění (roční relaps rate), škálou invalidity (Expanded Dis­ability Status Scale; EDSS) a parametry hodnocené pomocí magnetické rezonance (MR). Tyto údaje mají omezenou vypovídající hodnotu a nejsou schopny postihnout subklinickou aktivitu onemocnění. Existuje tedy potřeba citlivých, specifických, dostupných a relativně levných bio­markerů, které mohou přesněji detekovat aktivitu onemocnění a mohou sloužit jako náhradní (surrogate) markery pro hodnocení terapeutické účinnosti. Přes nezpochybnitelnou vypovídající hodnotu MR jsme svědky snahy využít měřitelné hodnoty ně­kte­rých proteinů, lipidů, nukleových kyselin a dalších bio­markerů v séru a mozkomíšním moku (MM) k vyhodnocení a předvídání léčebných výsledků u konkrétního pa­cienta s RS v rámci personalizované medicíny [7]. Následný přehled by měl sloužit k orientaci v problematice méně či více nadějných bio­markerů, které by mohly být zavedeny do klinické praxe. Řada z nich je limitována nutností opakovaného odběru MM.

Neutralizační protilátky a jiné potenciální bio­markery ke zhodnocení terapeutického efektu

Detekce neutralizačních protilátek (NAbs) je nejčastější používaná metoda, jak prokázat bio­logickou účinnost DMD. IFNβ redukuje u RR RS klinické relapsy o 30 %. Klinické zkušenosti svědčí o tom, že 60 % pa­cientů odpovídá na léčbu IFNβ tak, že RS je při dlouhodobé léčbě pod kontrolou. Zbývajících 40 % jsou non respondéři [8]. Někteří pa­cienti vyvinou tvorbu NAbs, které snižují terapeutický efekt po 4– 6 měsících od zahájení léčby [9]. Výskyt NAbs souvisí s typem IFNβ a způsobem jeho podání. Při intramuskulární aplikaci IFNβ 1a se NAbs vyvíjejí u 4 % pa­cientů, při subkutánním podání IFNβ 1a a 1b se mohou objevit NAbs až u 47 % nemocných [10]. Spolu s následným vyšetřením MxA proteinu (Myxovirus resistence protein A) a v případě negativního indukčního testu se u pa­cientů s pozitivními protilátkami doporučuje zvážit ukončení léčby kvůli nedostatečné terapeutické odpovědi.

Ačkoliv je natalizumab humanizovaná monoklonální protilátka, je podobně jako IFNβ také imunogenní. Nejčastěji se NAbs mohou vyskytovat během prvních šesti měsíců léčby [11]. U 4,5– 14,1 % pa­cientů se NAbs vyskytují kdykoliv v průběhu léčby, u 1– 4,7 % léčených se mohou objevit přechodně, 3,5– 9,4 % pa­cientů má protilátky trvale [12,13]. Kromě snížené terapeutické odpovědi se u nemocných s pozitivním výskytem NAbs objevují projevy hypersenzitivity při aplikaci infuzí [14].

Dalším kandidátním bio­markerem pro posouzení účinnosti léčby natalizumabem je stanovení fetuinu A v MM. Fetuin A je alfa‑2- HS‑ glykoprotein syntetizovaný v játrech [15]. Za fyziologických okolností se nevyskytuje v mozku dospělých, je však nacházen ve fetálním MM, což podporuje teorii o jeho roli při vyzrávání CNS [16]. Jeho zvýšená hladina v MM se objevovala u nemocných s RS proti zdravým kontrolám [17]. Hladina fetuinu A byla vyšetřena v kohortě 77 pa­cientů léčených natalizumabem po dobu jednoho roku. Pokles jeho hladiny v MM byl vysoce signifikantní při jeho vyšetření po 6 a 12 měsících léčby u pa­cientů, kteří odpovídali na léčbu oproti těm, kteří z léčby neprofitovali [18]. Tyto nálezy ukazují relativně přesný laboratorní průkaz účinnosti léčby, což by mohlo kromě klinických a morfologických nálezů napomoci v terapeutickém rozhodovacím procesu. Při stanovení hladiny fetuinu A je nutné kromě určení specificity i provedení validizačních studií a ověření, zda se jeho pokles v MM vyskytuje i u jiných DMD. Jiným potenciálním bio­markerem se ukázaly cirkulující mononukleární buňky se znakem CD49d. Jejich neklesající počet predikuje sníženou terapeutickou odpověď na natalizumab [19].

Tau protein a S100b protein byly statisticky významně zvýšeny u pa­cientů s RS v porovnání s kontrolní skupinou. Hladina S100b proteinu poklesla po 24 měsících léčby mitoxantronem [20].

Ně­kte­ré kandidátní bio­markery jsou uvedeny v tab 1.

Biomarkery aktivity onemocnění

Naše současné znalosti o aktivitě RS se opírají o analýzu klinických parametrů a MR monitoring. MR je přitom málo senzitivní pro průkaz lézí v míše, v oblasti mozkové kůry nebo normálně vypadající bílé hmotě. Laboratorní bio­markery mají proto silný potenciál k tomu, aby se staly zástupnými markery aktivity choroby nejen v klinických studiích, ale i v klinické praxi.

Již zmiňovaný fetuin A se ukázal jako spolehlivý marker rychlé konverze z CIS do RR RS nebo dokonce do SP RS [21,22]. Fetuin A je zvýšen u pa­cientů se SP RS, ale nikoliv u PP RS [23].

Dalším studovaným bio­markerem aktivity RS je osteopontin. Je to prozánětlivý cytokin produkovaný aktivovanými zánětlivými buňkami a exprimovaný v zánětlivých lézích [24]. Hladiny osteopontinu jsou zvýšené u aktivní RS oproti kontrolám a snižují se při léčbě DMD [25]. Následující studie však prokázaly, že hladiny osteopontinu v séru nejsou dostatečně specifické pro odlišení jiných, paralelně probíhajících změn CNS, takže jeho sledování není zcela užitečné [26,27]. Bez ohledu na nízkou specificitu však hladiny osteopontinu v MM velmi silně korelovaly s klinickou závažností RS [28,29]. Snížení jeho hladiny bylo zřejmé u pa­cientů úspěšně léčených natalizumabem [30]. Předpokládá se, že sledování osteopontinu by mohlo mít význam spolu s monitorováním jiných bio­markerů.

Specifický protein S 100 se ukázal v experimentu jako citlivý ukazatel poškození hematoenfalické bariéry, která je často přítomna u zvýšené zánětlivé aktivity onemocnění [31].

Růstový faktor pro hepatocyty (Hepatocyte Growth Factor; HGF), který potlačuje projevy autoimunity, negativně koreloval s aktivitou RS [32]. Hladiny HGF v MM mohou reflektovat endogenní reparační pochody CNS a tím se mohou stát zástupným markerem pro sledování neuroprotekce, což by mělo význam zejména u progresivních forem RS. 

Biomarkery oxidativního stresu

Mozková aktivita je spojena s vysokou spotřebou kyslíku. Vzhledem k vysokému podílu lipidů v myelinu stoupá produkce kyslíkových radikálů, která vede k oxidativnímu stresu a peroxidaci lipidů [33]. Zánět, demyelinizace a neurodegenerace zvyšují metabolický a oxidační stres, což vede k progresi RS. Nalezení indikativních markerů by mohlo kvantifikovat vliv oxidativního stresu na progresi onemocnění.

Isoprostane 8- iso‑ prostaglandin F2a (8- iso‑ -PGF2a) je marker oxidativního stresu a peroxydace lipidů, který je tvořen volnými radikály kyseliny arachidonové nacházející se v membránových fosfolipidech. Zvýšené hladiny 8- iso‑ PGF2a byly zjištěny v moči a séru pa­cientů s RS [34]. Recentní studie prokázala jeho zvýšenou hladinu v MM zejména u pa­cientů se SP RS [35]. Tyto nálezy podporují možnost, že oxidativní stres je výsledkem zánětlivé degenerace. Další markery oxidativního stresu jsou otázkou výzkumu, výsledky recentních studií nejsou zatím použitelné v praxi. 

Biomarkery B buněčné aktivity

CXCL13 (C‑ X‑ C motif ligand 13) je chemokin a silný chemoatraktant B buněk. Řada studií popsala jeho zvýšenou hladinu v MM u RS, ale i u jiných zánětlivých onemocnění CNS [36,37]. Jeho hladina koreluje se zvýšenou humorální imunitní odpovědí. Je známo, že ektopická meningeální germinativní centra jsou zdrojem autoreaktivních B lymfocytů, které hrají významnou úlohu v progresi onemocnění a rozvoji kortikální patologie [38]. Důležitým poznatkem je, že CXCL13 je prognostický marker, který se vyskytuje ve zvýšené míře u pa­cientů s CIS s časnou konverzí do RR RS [39]. Hladina tohoto chemokinu úzce koreluje s počtem B lymfocytů, oligoklonálních pásů a IgG indexem v MM [40]. Podobným prediktivním ukazatelem je průkaz oligoklonálních IgM pásů v MM [41]. Reprodukovatelnost těchto dat ukazuje, že CXCL13 může být spolehlivým indikátorem humorální imunitní odpovědi CNS. Jeho monitoring predikuje možnou klinickou odpověď na léčbu cílenou na B buňky, např. rituximabem [42]. 

Biomarkery axonálního poškození

Neurofilamenta jsou cytoskeletální proteiny. Podle molekulové hmotnosti jednotlivých podjednotek se označují jako neurofilamenta s lehkou (NFL), střední (NFM) a těžkou složkou (NFH). V důsledku axonálního poranění se uvolňují do extracelulárního prostoru, takže jejich množství odráží stupeň poškození axonů [43]. U RS dochází ke zvýšení NFL i NFH zejména během akutního relapsu v důsledku axonálního poškození zprostředkovaného zánětem [44]. U pa­cientů s CIS korelují hladiny NFL s morfologickými projevy zánětu (gadolinium enhancující léze na MR) a predikují konverzi do klinicky definitivní RS s horší prognózou [45,46]. U progredující RS jsou hladiny NFH zvýšené trvale a významně korelují s fyzickou disabilitou a změnami v objemu mozku, nikoliv však s počtem a objemem lézí. NFH mohou indikovat probíhající neurodegeneraci [47].

Za další ukazatel axonální patologie je považován 14- 3- 3 protein. Z nedávno publikované studie vyplývá, že jeho vyšetření v likvoru může být užitečným markerem identifikujícím pa­cienty s vyšším rizikem nástupu časné disability [48].

U pa­cientů léčených natalizumabem došlo během 6– 12 měsíců léčby k trojnásobnému poklesu NFL, což svědčí, že dochází nejen k efektu imunomodulačnímu, ale i ke snížení axonálního poškození [49]. Tyto nálezy byly pozorovány i u pa­cientů se SP RS léčených rituximabem nebo mitoxantronem [50]. Provedené studie ale nebyly schopny jednoznačně prokázat, že pokles axonálního postižení není sekundární. Vyšetření hladiny antineurofilamentových protilátek nijak nekoreluje s klinickými variantami RS [51,52].

Prognostické bio­markery

Chitinase 3‑like 1 (CHI3L1 –  YKL 40) je chitin vázající protein, který se účastní chronických zánětlivých dějů a poškození tkáně [53]. Comabella et al zjistili, že zvýšené hladiny CHI3L1 v MM predikovaly u pa­cientů s CIS rychlejší konverzi do klinicky definitivní RS [54]. Jiná studie dokonce prokázala, že hladina CHI3L1 úzce korelovala s diseminací lézí na MR v prostoru tak, že stanovení CHI3L1 může predikovat tíži disability po prodělané atace [55]. Z exprese CHI3L1 na reaktivních astrocytech v RS lézích lze usuzovat na jeho účast v astroglióze [56]. Pokles zvýšené hladiny CHI3L1 v MM byl pozorován po roční léčbě natalizumabem a mitoxantronem u pa­cientů v klinické remisi, takže je možné jeho monitorací zjistit terapeutickou odpověď na DMD [57].

Berger et al vyšetřili u 103 pa­cientů s CIS hladinu protilátek proti myelinovému bazickému proteinu (MBP) a myelinovému oligodendrocytárnímu glykoproteinu (MOG) v likvoru. Zjistili, že pa­cienti s pozitivními protilátkami konvertovali do klinicky definitivní RS mnohem dříve než séronegativní pa­cienti [58]. V jiné studii byla nalezena v likvoru snížená hladina cystatinu C u RS a neuromyelitis optica v porovnání s kontrolní skupinou pa­cientů s nezánětlivými neurologickými afekcemi. Autoři předpokládají zapojení cystatinu C do patogeneze demyelinizačních onemocnění [59]. V práci sledující rozdíly mezi zánětlivými a degenerativními markery u RR RS a CIS bylo nalezeno snížení cystatinu C u pa­cientů s RR RS ve srovnání s nemocnými s CIS a kontrolní skupinou [60]. Jiní autoři roli cystatinu zpochybňují [61]. Další prognostické bio­markery byly uvedeny v předchozím textu.

Perspektivní bio­markery

Převratný výzkum v oblasti proteogenomiky a transkriptomiky umožnil v posledních letech další vývoj v oblasti hledání vhodných bio­markerů pro stanovení aktivity a progrese onemocnění a monitoring účinnosti terapie [62]. Byly prokázány rozdíly v genové expresi B buněk, CD8+ buněk a monocytů i pa­cientů s RS a zdravými kontrolami, nikoliv však RR RS, SP RS a PP RS [63].

Výzkum se v této oblasti směřoval zejména k objasnění genetických vlivů na účinnost IFNβ. Profilováním rozsáhlých genových expresí u pa­cientů neodpovídajících na léčbu IFNβ byla zjištěna výrazná interindividuální odpovídavost na signalizaci IFNβ. Tyto studie prokázaly rozdíly v genech souvisejících s IFNβ signalizací, jako např. u aktivátoru transkripce 1.92 kD (Signal Transducer and Activator of Transcription; STAT 1) stejně jako u genů souvisejících se signalizací Tool‑like receptoru 4 (TLR4) na monocytech [64]. Recentní studie IMPROVE hodnotila účinnost podkožně aplikovaného IFNβ u 180 pa­cientů s RR RS. Kromě klinického hodnocení a vyšetření MR bylo zkoumáno 39 bio­markerů. Triplet genů pro CASP2/ IRF4/ IRF6 (Caspase 2 –  CASP2, Interferon Regulatory Factor 4 –  IRF4, Interferon regulatory factor 6 –  IRF 6) se ukázal jako indikátor suboptimální léčebné odpovědi [65]. V poslední době byly zavedeny nové technologie spočívající v sekvenování RNA, což umožnilo zjistit snížení ribozomálního proteinu S6 u IFNβ respondérů [66]. Další možnou cestou k poznání specifických bio­markerů jsou mikrovezikuly uvolňující se do tělních tekutin, které mají aktivní roli v mezibuněčné komunikaci a indukují antigen‑ specifikou imunitní odpověď. Myeloidní mikrovezikuly se ukázaly v experimentu jako marker terapeutického účinku fingolimodu, který redukuje jejich hladinu v MM [67]. 

Závěr

Rozšiřující se spektrum terapeutických možností přineslo nové otázky spojené s terapeutickým efektem u konkrétního pa­cienta. Cílem je dosáhnout situace, kdy dojde k potlačení aktivity, zastavení progrese onemocnění a stacionárnímu nálezu na MR (koncept NEDA; No Evidence of Disease Activity). Naše současné znalosti svědčí o tom, že může docházet k subklinické aktivitě a progresi choroby bez morfologického korelátu na MR.

Rozvoj molekulární bio­logie přináší možnost nalezení nových bio­markerů, které by dokázaly včas predikovat další rozvoj onemocnění a navíc odhalit včas pa­cienty neodpovídající na konkrétní léčbu by byl dalším krokem k individualizovanému léčebnému přístupu, což má pochopitelně i nezanedbatelné socioekonomické aspekty. Vzhledem k heterogenitě patogeneze RS se zdá, že k monitorování onemocnění bude třeba celé řady markerů. Současný trend směřuje k validizaci již definovaných bio­markerů včetně jejich využití v klinických studiích a k vývoji bio­markerů nových, nejspíše s využitím genomiky a transkriptomiky. Ně­kte­ré z uvedených bio­markerů mají již v současné době potenciál se uplatnit v klinické praxi, další je třeba ověřit ve větších klinických studiích.

Autor deklaruje, že v souvislosti s předmětem studie nemá žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Přijato k recenzi: 2. 1. 2015

Přijato do tisku: 24. 3. 2015

MUDr. Jiří Piťha

Neurologické oddělení

Krajská zdravotní, a.s. – Nemocnice Teplice o. z.

Duchcovská 53

415 29 Teplice

e-mail: pithaj@seznam.cz