Analytický profil 1-[3-(3-propoxyfenylkarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]-4-(3-trifluórmetylfenyl)piperazíniumchloridu

Súhrn

Predmetom práce bolo doplnenie niektorých experimentálne stanovených fyzikálno-chemických deskriptorov 1-[3-(3-propoxyfenylkarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]-4-(3-trifluórmetylfenyl)piperazíniumchloridu (pracovne označeného ako 8e), účinnej, relatívne vysokolipofilnej zlúčeniny proti netuberkulóznemu M. kansasii My 235/80. Identita látky 8e bola potvrdená ¹H- a ¹³C-NMR spektrami, spektrometriou v IR oblasti ako aj elementárnou analýzou. Výstup z hmotnostnej spektrometrie potvrdil existenciu molekulového iónu [M + H⁺]⁺. Čistota hodnotenej zlúčeniny 8e bola overená pomocou adsorpčnej chromatografie na tenkej vrstve, stabilita jej vodných a metanolových roztokov bola hodnotená pri pôsobení UV/VIS žiarenia. Hodnoty niektorých základných fyzikálno-chemických charakteristík molekuly 8e stanovených v redchádzajúcich publikáciách (pK_a, log P_exp) boli korelované s konštantami, ktoré prislúchajú niektorým v praxi používaným antimykobakteriálne aktívnym molekulám (izoniazid, pyrazínamid, kyselina para-aminosalicylová, etiónamid, streptomycín). Pre stanovenie obsahu molekuly 8e sa použila RP-HPLC (reversed-phase HPLC) metóda vnútorného štandardu a UV/VIS spektrofotometria pri vlnovej dĺžke 238 nm (vodné prostredie) a 244 nm (prostredie metanolu).

Kľúčové slová:
netuberkulózne mykobaktérie - analytické hodnotenie - fenylkarbamáty - N-fenylpiperazín

Úvod

Netuberkulózne formy mykobaktérií (non-tuberculous mycobacteria, NTM) sú voľne žijúce saprofyty, ktoré pôsobia pri „vhodných“ podmienkach ako iniciátor mnohých vážnych, prevažne infekčných ochorení, akými sú napríklad infekcie pľúc, mäkkých tkanív, kostí, svalov, ale aj cystickej fibrózy¹⁾. NTM sú tradične delené na tzv. pomaly rastúce (slowly growing Mycobacteria), kde patrí napríklad Mycobacterium (M.) avium, M. kansasii, M. malmoense, M. entiflavium alebo M. enopi a tzv. rýchlo rastúce (rapidly growing Mycobacteria), ktoré reprezentuje M. fortuitum, M. abscessus, M. smegmatis, M. ucogenicum alebo M. chelonae²⁾. V ostatných rokoch sa zvyšuje incidencia a revalencia NTM napriek skutočnosti, že prenos NTM medzi postihnutými osobami nebol dokázaný³⁾.

V súčasnosti je známych približne 125 druhov NTM, z ktorých je asi 60 považovaných za patogénnych pre človeka. M. kansasii je oportunistickým intracelulárnym patogénom, ktorý podľa DNA analýz zahŕňa približne 5–7 podtypov, z ktorých je najrozšírenejší podtyp^{1, 4, 5)}. Tento patogén je považovaný za vysokovirulentnú formu NTM, jeho výskyt je relatívne častý aj u osôb s neporušenou imunitou, ale najmä u imunodeficientných pacientov, ďalej sa objavuje pri chemoterapeutickej liečbe, pri orgánovej transplantácii alebo u pacientov na dialýze^{1, 6, 7)}.

Komplex M. avium (KMA) je tvorený minimálne dvoma typmi: M. avium (významný patogén „pôsobiaci“ pri diseminovaných ochoreniach) a M. intracellulare (najmä ako patogén respiračného systému) s dokázanou genetickou variabilitou. Podľa American Thoracic Society je ubikvitný KMA najčastejším mykobakteriálnym komplexom (na druhom mieste je M. kansasii) zapríčiňujúcim manifestovanie rôznych zdravotných komplikácií u obyvateľstva, akými sú pľúcne ochorenia, lymfoadenitída, abscesy poranení alebo kožné vredy, a to u pacientov s imunodeficienciou⁵⁾, zdanlivo zdravých ľudí ale aj u osôb s nenarušeným imunitným systémom^{8, 9)}.

Liečba takýchto infekčných stavov môže byť v dôsledku obmedzeného spektra v praxi aplikovateľných a účinných antimikrobík komplikovanejšia ako terapeutické zvládnutie ochorení, ktoré spôsobuje tuberkulózne M. tuberculosis^5). V súčasnosti je preto potrebné neustále projektovať, pripravovať a analyzovať nové, účinné a antimikobakteriálne rýchlo pôsobiace liečivá s vhodným toxikologickým profilom.

Predmetom predkladanej publikácie je vypracovanie, resp. doplnenie analytického profilu 1-[3-(3-propoxyfenylkarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]-4-(3-trifluórmetylfenyl)piperazíniumchloridu, vysokolipofilnej látky s pracovným označením 8e, ktorá bola pripravená v rámci syntézy, komplexného fyzikálno-chemického a biologického hodnotenia fenylkarbamátových štruktúr s inkorporovaným, variabilne substituovaným, N-fenylpiperazínovým fragmentom. Pri určovaní jej antimykobakteriálneho profilu sa ukázalo, že predstavuje efektívnejšie pôsobiacu zlúčeninu ¹⁰⁾ proti netuberkulóznemu mykobakteriálnemu kmeňu M. kansasii My 235/80 (MIC = 16 μmol.l^-1 po 14-dňovej inkubácii, resp. 32 μmol.l^-1 po 21-dňovej inkubácii) v porovnaní s použitým štandardom, izoniazidom (INH; MIC = 50 μmol.l^-1 po 14-dňovej ako aj po 21-dňovej inkubácii). Hodnoty MIC látky 8e proti M. avium My 330/88 však neboli experimentálne stanovené z dôvodu jej relatívnej nízkej rozpustnosti alebo pre minimálny rast mykobaktéria ¹⁰⁾. Molekula 8e je zároveň menej účinná proti M. tuberculosis (MIC = 6, resp. 32 μmol.l^-1) ako použitý INH¹¹⁾ (MIC = 0,5; resp. 1 μmol.l^-1).

Pre zlúčeninu 8e možno predpokladať aj niekoľko ďalších farmakologických účinkov - okrem iného antagonistické ovplyvnenie α-adrenergných receptorov a vaskulárnu blokádu β₁-adrenergných receptorov, čo navodzuje vazodilatáciu, ako je to v prípade pôsobenia karvedilolu¹²⁾. Okrem toho antagonistické pôsobenie na α₁-adrenergných receptoroch bude pravdepodobne zvýraznené prítomnosťou substituovaného N-fenylpiperazínového jadra v molekule, ktoré je prítomné aj v štruktúre naftopidilu ¹³⁾. Schopnosť látky 8e ovplyvňovať funkcie kardiovaskulárneho systému však nebola doposiaľ experimentálne skúmaná.

POKUSNA ČASŤ

SPEKTRÁLNA ČASŤ

¹H- a ¹³C-NMR spektrometria

Použité chemikálie: Deuterochloroform (rozpúšťadlo), ako vnútorný štandard bol použitý tetrametylsilán (Merck Chemicals Slovensko, Bratislava, SR). Pripravili sa roztoky hodnotenej substancie 8e s koncentráciou 2 mg/650 μl CH₂Cl.

Prístroje a zariadenia: NMR spektrometer Varian Gemini 2000 (Varian, New Jersey, USA), magnet Oxford 300 MHz (Oxford, Veľká Británia).

Parametre pri meraní ¹H-NMR spektier: Rozsah = 13 – -1 ppm, aktivačný čas = 3 s, počet akvizícií = 32, delay = 1 s, pracovná teplota = 20 °C.

Parametre pri meraní ¹³C-NMR spektier: Rozsah = 240 – -20 ppm, aktivačný čas = 1,815 s, počet akvizícií = 10 000, delay = 1 s, pracovná teplota = 20 °C.

¹H-NMR spektrálna charakteristika látky 8e bola publikovaná v práci¹⁴⁾: ¹H-NMR (300 MHz) δ (ppm): 1,01 (t, 3H, OCH₂CH₂CH₃); 2,60 (t, 4H, H-9, H-11); 2,80 (t, 4H, H-10, H-12); 3,01 (m, 2H, OCH₂CH₂CH₃); 3,28 (t, 2H, OCH₂CH₂CH₃); 4,10 (m, 1H, H-7); 4,33 (d, 2H, ^βJ_8,9 = 2,90 Hz, H-8); 4,35 (d, 2H, ^βJ_7,8 = 2,90 Hz, H-6); 6,80 (s, 1H, OH) vs. 7,00 (s, 1H, OH); 6,85 - 7,10 (m, 8H, ArH); 7,45 (s, 1H, NHCOO, H-5); 11,05 (s, 1H, NH⁺, H-17).

¹³C-NMR (75 MHz) δ (ppm): 10,35 (OCH₂CH₂CH₃); 22,33 (OCH₂CH₂CH₃); 48,81 (uhlík piperazínu); 53,15 (uhlík piperazínu); 60,01 (CH₂CH(OH)CH₂-piperazín); 65,62 (CH₂CH(OH)CH₂); 68,21 (OCH₂CH₂CH₃); 67,21 (CH₂CH(OH)CH₂-piperazín); 108,55 (ArC); 110,21 (ArC); 112,10 (ArC); 113,01 (ArC); 115,24 (ArC); 119,37 (ArC); 124,75 (ArCCF₃); 128,35 (ArC); 129,37 (ArC); (ArC); 130,51 (ArC); 136,20 (ArCNHCOO); 152,63 (ArC); 153,36 (NHCOO); 160,42 (ArCOCH₂CH₂CH₃).

IR spektrometria

Prístroje a zariadenia: Spektrometer FT-IR Impact 400D (Nicolet), merané v tabletách KBr v koncentrácii 2 - 3 mg látky 8e/800 mg KBr.

IR cm^-1: ν(N–H): 3248; ν(N⁺–H): 2605; ν_as(C–H): 2975; ν_s(C–H): 2870; ν(C=O): 1728; ν_as(C=C): 1596; δ(N–H): 1549; δ(CH₂): 1450; ν_as(CAr–O–CAlk): 1232 (1077); γ(C–H): 763, 669.

Spektrofotometria v UV/VIS oblasti

Použité chemikálie: Destilovaná voda, metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR).

Príprava roztokov: Pripravili sa roztoky študovanej látky 8e s c = 5 × 10^-5 mol.l^-1 vo vode a v metanole.

Prístroje a zariadenia, pracovný postup: Sú charakterizované v práci¹⁴⁾. Podľa Lambert-Beerovho zákona sa vypočítali hodnoty ε, resp. log ε pre všetky absorpčné maximá v obidvoch médiách.

Vodné prostredie - UV λ_max nm (log ε): 206 (4,69), 238 (4,45), 278 (3,67). Metanolové prostredie - UV λ_max nm (log ε): 212 (4,68), 244 (4,36), 282 (3,59).

Hmotnostná spektrometria

Hmotnostné spektrum (MS) molekuly 8e bolo zmerané na prístroji Agilent 1100 LC/MSD VL Trap (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Detailné informácie o podmienkach merania a pracovnom postupe sú publikované v práci¹⁴⁾. Snímané rozpätie hmôt bolo v intervale 15–800 m/z.

ANALYTICKÁ ČASŤ

Stanovenie teploty topenia

Prístroje a zariadenia, pracovný postup: Sú charakterizované v práci¹⁵⁾. Nekorigovaná hodnota teploty topenia látky 8e je uvedená v tabuľke 1.

Elementárna analýza

Prístrojové vybavenie a pracovný postup pri určení obsahu dusíka, uhlíka a vodíka (tab. 2) pre molekulu 8e je uvedený v publikácii¹⁵⁾.

Stanovenie rozpustnosti

Použité chemikálie, prístroje a zariadenia, pracovný postup: Sú publikované v práci¹⁵⁾. Rozpustnosť študovanej látky 8e bola stanovená podľa Európskeho liekopisu 6.0 ¹⁶⁾.

Stanovenie hodnoty R_f pomocou adsorpčnej chromatografie na tenkej vrstve

Použité chemikálie: Chloroform p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), dietylamín p.a. (Merck, Schudart, SRN), cyklohexán p.a. (Lach-Ner, Neratovice, ČR).

Materiál, prístroje a zariadenia: Silufol^® UV₂₅₄ s vrstvou silikagélu s rozmermi 200 × 200 mm (nastrihaný na vhodne veľké časti), sklenené komory s rozmermi 190 × 180 × 80 mm, mikrokapilára (Hamilton Bonaduz, Švajčiarsko), UV-lampa (KRUSS UV 240, 230V AC, Hamburg, SRN).

Pracovný postup: Na komerčne vyrábané fólie Silufol^® UV₂₅₄ s vrstvou silikagélu sa na vyznačený štart mikrokapilárou naniesli 2 μl 1% roztoku hodnotenej zlúčeniny 8e a medziproduktu jej syntézy, t.j. 2,3-epoxypropán-1-ylesteru kyseliny 3-propoxyfenylkarbámovej (s pracovným označením Epoxid-33), v metanole p.a. Po ukončení vyvíjania sa chromatogramy sušili pri laboratórnej teplote a detegovali sa pod UV-lampou pri vlnovej dĺžke 254 nm. Výsledné hodnoty sú priemerom zo šiestich paralelných stanovení (pozri časť Výsledky a diskusia). Ako vhodnou vyvíjacou sústavou pre TLC-hodnotenie sa ukázal systém S: chloroform : cyklohexán : dietylamín (ϕ = 6 : 3 : 1).

Stanovenie povrchového napätia a disociačnej konštanty

Použité chemikálie, prístroje a zariadenia, pracovný postup: Sú publikované v práci¹⁵⁾. Hodnoty povrchového napätia (γ) a disociačnej konštanty (pK_a) sú prezentované v tabuľke 3.

Stanovenie logaritmu retenčného (kapacitného) faktora „k“ (log k’) z RP-HPLC a rozdeľovacieho koeficientu P_exp (log P_exp) v rôznych lipohydrofilných systémoch

Použité chemikálie, prístroje a zariadenia, pracovný postup, chromatografické podmienky (RP-HPLC), výber lipofiných prostedí pre shake-flask metódu stanovenia P_exp sú publikované v prácach^{15, 17)}. Hodnoty experimentálne stanovených parametrov lipofility sú uvedené v tabuľke 3.

Štúdium stability v UV/VIS oblasti

Prístroje a zariadenia: Pozri UV/VIS spektrofotometriu v rámci spektrálnej časti.

Pracovný postup: Pripravil sa vodný a metanolový roztok látky 8e s c = 5 × 10^-5 mol.l^-1. V priebehu 1 h sa v 5-min intervaloch sledovali (prípadné) posuny vo vlnových dĺžkach absorpčných maxím ako aj (prípadné) zmeny v absorbanciách pri jednotlivých absorpčných maximách v obidvoch zvolených prostrediach.

Stanovenie obsahu

Stanovenie obsahu látky 8e v UV/VIS oblasti spektra

Prístroje a zariadenia: Pozri UV/VIS spektrofotometriu v rámci spektrálnej časti.

Pracovný postup: Pripravil sa 0,002% zásobný(-é) roztok(-y) zlúčeniny 8e vo vode ako aj v metanole, ktorého(-ých) spektrum sa zaznamenalo v oblasti 190 až 400 nm proti čistému rozpúšťadlu. Z konkrétneho zásobného roztoku sa odpipetovalo postupne 2, 4, 6, 8 a 10 ml do piatich 10-ml odmerných baniek. Všetky odmerné banky sa doplnili po značku vodou, resp. metanolom a zaznamenala sa absorbancia takto pripravených roztokov ¹⁸⁾. Z nameraných hodnôt A sa zostrojila kalibračná krivka; vo vodnom prostredí pri vlnovej dĺžke λ_max = 238 nm, v metanole pri λ_max= 244 nm. Hodnoty príslušných koncentrácií a absorbancií A sú uvedené v tabuľke 4.

Vyhodnotenie výsledkov: Obsah zlúčeniny 8e sa stanovil z funkcie priamky (y = a x + b). Po zostrojení kalibračnej krivky a štatistickom vyhodnotení v programe OriginPro ver. 8 SR0 (OriginLab Corporation, Northampton, USA) jednotlivé symboly znamenajú: y = A (absorbancia), b = a₀ (úsek na osi y), a = a₁ (smernica priamky), x = c. Z týchto vzťahov vyplýva, že koncentrácia sa vypočíta podľa vzťahu: c = (A – a₀) / a₁.

Stanovenie obsahu látky 8e pomocou RP-HPLC metódy vnútorného štandardu

Použité chemikálie: Metanol UV (Lachema, Brno, ČR), nátriumacetát tavený čistý (Spolana, Neratovice, ČR), vnútorný štandard - kyselina para-metoxyfenyloctová pre syntézu (Merck Chemicals Slovensko, Bratislava, SR).

Prístroje a zariadenia, chromatografické podmienky sú publikované v práci¹⁵⁾.

Pracovný postup: Pripravil sa 0,05 % zásobný roztok látky 8e v metanole, z ktorého sa kvantitatívne prenieslo do 25-ml odmerných baniek postupne po 1, 2, 3, 4 a 6 ml, do každej 25-odmernej banky sa pridalo 1,5 ml vnútorného štandardu (0,10% metanolový roztok kyseliny para-metoxyfenyloctovej) a doplnilo sa metanolom po značku¹⁹⁾. Pomocou dávkovacieho ventilu sa z takto pripravených roztokov nanášal na kolónu objem 20 μl.

Vyhodnotenie výsledkov: Z pamäti počítača bol vyvolaný záznam analýzy vzorky, integrovali a opísali sa plochy zodpovedajúce analyzovanej látke (P₁) a jej vnútornému štandardu (P₂). Výsledky analýz sa vypočítali z pomeru plôch píkov P₁/P₂ (tab. 5).

VÝSLEDKY A DISKUSIA

Syntéza študovanej látky bola publikovaná v práci¹⁴⁾, molekula 8e bola pripravená reakciou 2,3-epoxypropán-1-ylesteru kyseliny 3-propoxyfenylkarbámovej (pracovne označený ako Epoxid-33) a bázickej zložky, 1-(3-trifluórmetyl)fenylpiperazínu. Chemická štruktúra analyzovanej zlúčeniny 8e bola potvrdená ¹H- ako aj ¹³C-NMR spektrometriou. V ¹H- a ¹³C-NMR spektrách boli dokázané atómy vodíka a uhlíka meta-propoxysubstituenta, 2-hydroxypropán-1,3-diylového zoskupenia, karbamátovej funkčnej skupiny, piperazín-1,4-diylu, prítomných aromatických jadier spolu s atómom uhlíka trifluórmetylovej skupiny viazanej na N-fenylpiperazínové jadro. V IR spektre hodnotenej molekuly boli identifikované vlnočty zodpovedajúce meta-propoxyskupine, aromatickým kruhom v lipofilnej ako aj v solitvornej časti molekuly, NH-skupine karbamátového zoskupenia, arylalkyléteru ako aj karbonylu. Pás IR spektra valenčnej vibrácie (C=O)-skupiny pri 1728 cm^-1 sa môže pri látke 8e využiť pre kvantitatívne hodnotenie.

Schopnosť zlúčeniny absorbovať žiarenie v ultrafialovej a viditeľnej časti spektra závisí predovšetkým od jej elektrónovej štruktúry. Analyzovaná molekula 8e vykazovala v UV/VIS oblasti vo vodnom ako aj v metanolovom prostredí tri absorpčné pásy. Podobne je to aj v prípade nesubstituovaného benzénu, ktorého absorpčné maximá sú pri 184 nm (ε_1max = 60 000 m².mol^-1, log ε_1max = 4,79), 204 nm (ε_2max = 7900 m².mol^-1, log ε_2max = 3,90) a 256 nm (ε_3max = 200 m².mol^-1, log ε_3max = 2,30). Substitúcia auxochrómnymi skupinani na benzénovom kruhu znamená posun jednotlivých maxím smerom k vyšším vlnovým dĺžkam²⁰⁾. Druhý lokálne excitačný pás látky 8e bol vo vodnom prostredí pozorovaný pri 206 nm (λ_max; pri 212 nm v metanole), charge-transfer pás (C-T) pri 238 nm (λ_2max; pri 244 nm v etanole) a prvý lokálne excitačný pás pri 278 nm (ε_3max; pri 282 nm v metanole).

Hmotnostné spektrum je charakteristické pre každú látku a môže byť použité ako „odtlačok palca“ (fingerprint) na jej identifikáciu buď porovnaním s už známym spektrom alebo priamo jeho interpretáciou ²¹⁾. Analýza MS študovanej zlúčeniny 8e poukázala na existenciu zodpovedajúceho molekulového iónu [M + H⁺]⁺, ktorého hodnota m/z = 482,2.

Vypočítaný a experimentálne stanovený percentuálny obsah uhlíka, vodíka a dusíka sa pre látku 8e nelíšil o viac ako ± 0,40 (tab. 2). Z nameraných údajov súčasne nepriamo vyplynulo, že látka 8e bola pripravená ako monochlorid.

Hodnotená zlúčenina 8e je vysokolipofilnou štruktúrou, ktorá je veľmi ťažko rozpustná v destilovanej vode, dobre rozpustná v metanole, mierne rozpustná v liehu 96% a prakticky nerozpustná v chloroforme. Na orientačné hodnotenie jej čistoty bola okrem RP-HPLC použitá adsorpčná chromatografia na tenkej vrstve - delenie látok na adsorpčnom princípe sa uskutočnilo na platniach Silufolu^®, vyvíjanie prebiehalo do vzdialenosti 10 cm. Súčasne so slúčeninou 8e bol chromatograficky hodnotený aj medziprodukt syntézy - Epoxid-33. Vo vyvíjacej sústave S (pozri experimentálnu časť) nastalo jednoznačné oddelenie ohraničených škvŕn prislúchajúcich štruktúre 8e (R_f = 0,38) a Epoxidu-33 (R_f = 0,59), pričom na príslušnom „stĺpci“ látky 8e neboli pozorované iné škvrny.

Študovaná molekula 8e má schopnosť výrazným spôsobom znižovať povrchové napätie ¹⁵⁾, je teda povrchovoaktívnou látkou (tab. 3).

Hodnotená zlúčenina 8e má mierne kyslý charakter ¹⁵⁾, v jej štruktúre je protonizovaný len jeden atóm dusíka piperazín-1,4-diylového skeletu, ktorému prislúcha pK_a = 5,21. Tento údaj je vyšší ako sú prvé dve hodnoty disociačných konštánt izoniazid ²²⁾ (pK_a1 = 2,0; pK_a2 = 3,5 a pK_a3 = 10,8). Nižšie hodnoty pK_a majú aj niektoré iné v praxi používané antimykobakteriálne účinné látky ²²⁾ pyrazínamid (pK_a = 0,50), kyselina para-aminosalicylová (pK_a1 = 1,78; pK_a2 = 3,63) alebo etiónamid (pK_a = 4,37). Streptomycínu prislúchajú naopak vyššie hodnoty disociačných konštánt²²⁾ ako má látka 8e (pK_a1 = 7,84; pK_a2 = 11,54).

Skelet bunkovej steny jednotlivých mykobaktérií pozostáva, okrem iného, z troch hlavných, navzájom kovalentne pospájaných podjednotiek, ktorými sú arabinogalaktán (AG), peptidoglykán (PGN) a mykolové kyseliny. Kyselina murámová, ako časť PGN, je N-glykolylátovaná (konjugovaná) na kyselinu N-glykolylmurámovú. Najtypickejšou črtou stavby konkrétnej mykobakteriálnej bunkovej steny je však to, že až 60 % jej hmotnosti tvoria lipidy a kyselina mykolová²³⁾. Makrolidové, tetracyklínové, fluórchinolónové štruktúry alebo rifamycíny sú vysokolipofilné molekuly, ktoré pravdepodobne využívajú lipidovú dvojvrstvu cez prechod bunkovou stenou mykobaktérií²³⁾.

Preto je z hľadiska možného mechanizmu antimykobakteriálneho pôsobenia študovanej látky 8e poznanie miery jej lipofility jedným z kľúčových faktorov. Ako vyplýva z údajov sumarizovaných v tabuľke 3 (log k’, log P_exp), substancia 8e je vysokolipofilnou štruktúrou, ktorej hodnota log P_exp stanovená v systéme oktán-1-ol/TFR je vyššia ako rozdeľovací koeficient izoniazidu²⁴⁾ (-0,64), pyrazínamidu ²⁵⁾ (-1,89), kyseliny para-aminosalicylovej²⁶⁾ (1,01), etiónamidu²⁷⁾ (0,71) alebo vysokohydrofilného streptomycínu ²⁸⁾ ( -8,01).

Pri hodnotení vplyvu UV/VIS žiarenia na vodný a metanolový roztok zlúčeniny 8e bolo zistené, že v priebehu 1 h nedošlo k zmene hodnôt absorbancií pri jednotlivých absorpčných maximách a rovnakom časovom intervale ani k ich posunu.

Pre (prípadné) stanovenie obsahu zlúčeniny 8e v konkrétnej liekovej forme alebo v telových tekutinách možno využiť UV/VIS spektrofotometriu alebo RP-HPLC. Obsah látky 8e bol stanovený spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke druhého absorpčného maxima, teda pri λ_2max = 238 nm (pre vodné prostredie), resp. pri λ_2max = 244 nm (pre prostredie metanolu).

Na základe získaných údajov bola zostrojená kalibračná krivka, výsledkom stanovenia obsahu látky 8e vo vodnom prostredí (tab. 4) bolo formulovanie regresnej rovnice v tvare: y = 26724(± 372)x + 0,0229 (± 0,0095); R² = 0,999, F = 5172, n = 5, resp. pre stanovenie obsahu v prostredí metanolu platilo: y = 28526 (± 216)x + 0,0281(± 0,0055); R² = 0,9998, F = 7412, n = 5.

V uvedených koreláciách parameter y predstavuje absorbanciu, x vyjadruje koncentráciu stanovovanej látky v mol.l^-1, F je hodnota F-testu na testovanie štatistických hypotéz (štatistická indukcia), n je počet prípadov.

Pri stanovení obsahu látky 8e pomocou RP-HPLC sa vhodnou mobilnou fázou pre jej delenie ukázal metanol 94 %. Formulovaná regresná rovnica mala nasledujúci tvar: y = 111951(± 519)x – 0,0767(± 0,0728); R² = 0,994, F = 530, n = 5. Parameter y predstavuje pomer plôch píkov študovanej látky 8e a vnútorného štandardu (kyselina para-metoxyfenyloctová), x vyjadruje koncentráciu stanovovanej látky v mol.l^-1.

Experimentálne údaje sumarizované v tejto práci budú v budúcnosti slúžiť ako príspevok pre ďalšie komplexné hodnotenie vzťahov medzi chemickou štruktúrou a biologickou (antimykobakteriálnou) aktivitou (QSAR) v skupine bázických esterov alkoxyfenylkarbámovej kyseliny.

Adresa pro korespondenci:

PharmDr. Ivan Malík, PhD.

Katedra farmaceutickej chémie FaF UK

Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, Slovenská republika

e-mail: malik@fpharm.uniba.sk