Kmenové buňky a karcinom ovaria
Charakteristika, význam a potenciální aplikacev klinické praxi

Súhrn

Nejzhoubnější a druhé nejběžnější gynekologické nádorové onemocnění – karcinom ovaria – je heterogenní skupinou nádorů s rozdílnou etiologií. Přestože dosud není jednotný názor na způsob jeho vzniku, ukazuje se, že roli mohou hrát extra-ovariální tkáně. Onemocnění je provázeno silnou chemorezistencí a tendencí k recidivě, současně s často asymptomatickým průběhem onemocnění v časných fázích. Efektivní screeningové markery dosud nebyly objeveny. Při vzniku nádoru i při ustavení chemorezistentní populace nádorových buněk v pooperačním období a po aplikaci chemoterapie hrají podle nejnovějších výzkumů roli nádorové kmenové buňky. Nádorové kmenové buňky jsou multipotentní buňky s neomezenou schopností se dělit, které mají schopnost experimentálně indukovat vznik nádorů u imunodeficientních myší. Detailní charakteristika těchto buněk je stále otevřenou záležitostí, ale již byly identifikovány jejich typické markery. Dosud identifikované hlavní markery těchto buněk jsou CD133, ALDH, CD44, CD117, CD24 a EpCAM. Zvýšený výskyt určitých populací těchto buněk u primárních nádorů může být asociován s prognózou vývoje nemoci, ale jednoznačná interpretace neexistuje vzhledem ke stále nedostatečnému množství dat. Dynamika karcinogeneze a asociovaných procesů vede také k tomu, že kmenové buňky mohou měnit své fenotypy v závislosti na měnících se podmínkách prostředí. Kmenové buňky jsou tedy schopny uvedené markery získat nebo ztratit, jak bylo prokázáno experimentálně. Zatím omezené možnosti také existují v souvislosti s cílenou specifickou terapií proti kmenovým buňkám, ačkoli některé předběžné výsledky naznačují, že by to mohla být vhodná cesta. Další charakterizační a funkční studie nádorových kmenových buněk budou nezbytné pro pochopení procesů spojených s karcinogenezí, chemorezistencí a tvorbou metastáz, a stanou se patrně základem nových diagnostických, prognostických a terapeutických postupů u karcinomu ovaria. V článku přinášíme přehled nejnovějších poznatků o roli nádorových kmenových buněk u karcinomu ovaria.

Klíčová slova:
karcinom ovaria – diagnostika – léčba – nádorové kmenové buňky– CD133 – ALDH – CD44 – CD24 – CD117 – EpCAM

ÚVOD

Karcinom ovaria představuje po karcinomu endometria druhé nejběžnější a současně nejzhoubnější gynekologické nádorové onemocnění. Jde o heterogenní skupinu nádorů patrně rozdílné etiologie, jež jsou ve většině případů diagnostikovány v pozdních stadiích, především díky neexistujícím screeningovým markerům a často asymptomatickému průběhu onemocnění v časných stadiích. Chirurgické odstranění nádoru a aplikace kombinované adjuvantní chemoterapie (obvykle paklitaxel a karboplatina/cisplatina) vedou k pozitivní odezvě a aktuálnímu potlačení onemocnění, které je ovšem ve většině případů následováno propuknutím chemorezistentní recidivy, spojené s vysokou mortalitou pacientek.

Recentně byly publikovány přehledové práce zabývající se karcinomem ovaria z hlediska celkového přehledu, charakterizace onemocnění a faktorů asociovaných s chemorezistencí [1, 2], předoperační diagnostiky [3], diagnostické role markeru CA125 [4], potenciálního významu stanovení exprese mikroRNA pro diagnostické účely [5] a primární chirurgické léčby [6].

Význam kmenových buněk v karcinogenezi u karcinomu ovaria je předmětem mnoha nejnovějších vědeckých studií. Tyto buňky patrně přímo souvisí se vznikem karcinomu ovaria, a především se vznikem chemorezistentní populace buněk při vzniku recidivujícího a metastatického onemocnění. Jejich výzkum bude možná základem pro vývoj efektivnější léčby, nalezení dalších prognostických faktorů, popřípadě nalezení nových diagnostických nástrojů. V tomto článku se zabýváme přehledem toho nejdůležitějšího, co je o kmenových buňkách a jejich významu u karcinomu ovaria dosud známo.

CHARAKTERISTIKA NÁDOROVÝCH KMENOVÝCH BUNĚK

V rámci tumoru existují různé buněčné sub-populace, lišící se schopností růstu, přežití, metastatickým potenciálem a rezistencí k chemoterapii. Nádorové kmenové buňky tvoří jen velmi malou část maligních buněk nádoru (uvádí se typicky 0,01–1 %, ačkoli procentuální zastoupení může být mnohem vyšší), ale mají neomezenou schopnost symetrického i asymetrického buněčného dělení. Vyskytují se v klidovém nebo dělícím se stavu v závislosti na buněčném prostředí a buněčných stresech (např. chemoterapie) [7]. Jde o multipotentní buňky, které jsou schopny diferencovat se ve funkčně rozdílné buňky [8]. Experimentálně jsou schopny způsobit vznik tumoru u myší se suprimovaným imunitním systémem. Anglicky se obvykle označují cancer stem cells (CSCs), případně tumor initiating cells (TICs), cancer initiating stem cells (CICs) či tumor propagating cells (TPCs) [7, 9]. Pozornost vědeckého výzkumu přitahují především na základě předpokládané schopnosti přežít chemoterapeutický zásah a zachovat si potenciál opět indukovat tvorbu tumoru. Podle teorie nádorových kmenových buněk jsou tedy tyto buňky odpovědné nejen za vznik primárního nádoru, ale také za chemorezistenci, radiorezistenci a za schopnost vyvolat recidivu nádorového onemocnění.

V posledních letech přibývají doklady o extra-ovariálním původu různých histologických typů karcinomu ovaria (např. z fimbrií vejcovodu, z endometria či endometriózy, blíže viz [5]). Metastatický potenciál buněk karcinomu ovaria je spojován s procesy epiteliálně mezenchymální tranzice a mezenchymálně epiteliální tranzice, blíže viz [5]. Přesné souvislosti nádorových kmenových buněk a extra-ovariálního původu karcinomu ovaria však dosud nejsou známy z důvodu nedostatečné charakteristiky specifických buněčných markerů u buněk příslušných tkání.

U karcinomu ovaria byly identifikovány vlastnosti kmenových buněk u populací CD44⁺, CD133⁺, barvivo Hoechst 33342 vylučujících buněk (tzv. side population) a ALDH1A1⁺ buněk [10]. Patrně hrají roli i další zkoumané markery s rozporuplnými výsledky u různých studií (např. CD24, CD117) [7], ale za hlavní konzistentně exprimované markery jsou považovány především CD133 a aldehyddehydrogenáza [11]. V mnoha nejnovějších studiích se k hlavním rozlišovacím markerům přidávají i další charakteristiky z důvodu nízké vypovídací hodnoty při použití pouze jednoho nebo několika málo markerů.

HLAVNÍ MARKERY NÁDOROVÝCH KMENOVÝCH BUNĚK U KARCINOMU OVARIA

CD133 (prominin) patří mezi nejčastěji uváděné markery. Doklady o asociaci tohoto markeru s vyšším proliferačním potenciálem byly nalezeny nejen u CD133⁺ buněk izolovaných z primárních nádorů [12], ale také u stabilizovaných buněčných linií, kde byla nalezena vyšší schopnost iniciovat tvorbu tumorů a zvýšená rezistence k chemoterapii [13]. Přestože u buněčných linií může docházet k ovlivnění exprese experimentálními podmínkami, podobné výsledky byly zjištěny i za použití jiného experimentálního modelu. U tohoto přístupu byly aplikovány buňky z primárních ovariálních nádorů NOD/SCID imunodeficientním myším, u kterých vyvolaly tvorbu nádorů. Jejich buňky byly resuspendovány, cytometricky roztříděny a byl opět zjištěn vyšší potenciál CD133⁺ buněk k tvorbě tumorů po aplikaci těchto buněk NOD/SCID myším [14].

Zajímavé jsou kontroverzní výsledky v případech, kdy byla sledována exprese CD133 s dalšími markery. Takto byly zjištěny rozdíly u CD133⁺ buněk z hlediska CD117, který nebyl nalezen ve studii Curley et al. [14], na rozdíl od předchozích výzkumů [15]. CD133⁺ buňky se mohou vyskytovat v kombinaci s ALDH (CD133⁺ALDH⁺) s vysokým potenciálem tvorby tumorů, ale také v kombinaci CD133^-ALDH⁺ s podobnými účinky. Kombinace CD133⁺ALDH^- se však lišila účinky v závislosti na původním zdroji buněk – takové buňky izolované z primárních nádorů neměly schopnost vyvolat tvorbu nádorů u myší na rozdíl od buněk pocházejících z buněčné linie [16].

ALDH (aldehyddehydrogenáza) je marker zkoumaný v několika vědeckých studiích. Ukázal se její velký význam ve zvýšení tumorigenicity (50násobné) za použití buněčných linií a NCr-nu myší, a také její zvýšená exprese v souvislosti s chemorezistencí k taxan-platinové léčbě, potvrzená experimentálně (ALDH1A1 gene silencing) [17].

Existuje studie, jejímž cílem bylo potvrzení v literatuře uváděných markerů CD24, CD44, CD117, CD133, the G subfamily of ATP-binding cassette transporters (ABCG), epithelial specific antigen (ESA) a aldehyddehydrogenázy (ALDH). Výsledkem je právě potvrzení markerů CD133 a ALDH jako markerů s vysokou tumorigenicitou. Za použití buněk z čerstvě zpracovaných primárních nádorů byly zjištěny překryvy obou markerů a také ABCG2. Např. u CD133⁺ buněk bylo 10krát více ALDH⁺ buněk než u CD133^- buněk. Ukázalo se však, že i ALDH^-, CD133^- a ALDH^-CD133^- buňky mohou vyvolat tvorbu nádorů, ale ty byly menší než nádory vyvolané pozitivními buňkami, jež měly navíc rychlejší růst [11]. Význam CD133 a ALDH potvrzuje také další studie [16], ve které ALDH⁺ buňky z buněčných linií tvořily nádory rychleji a větší než ALDH^- buňky a vykazovaly vyšší odolnost vůči cisplatině. Byl nalezen rozdíl ve schopnosti indukovat tvorbu nádorů u myší u ALDH^- buněk pocházejících z buněčné linie (viz výše) a takovýchto buněk izolovaných z primárních nádorů, které ani při dávce 50 tisíc buněk tvorbu nádorů neindukovaly. Při studiu kombinací obou markerů u buněčných linií měla kombinace ALDH⁺CD133⁺ podobnou schopnost iniciovat tvorbu tumorů jako ALDH^-CD133⁺. Naproti tomu ALDH⁺CD133^- a ALDH^-CD133^- buňky měly omezenou tumorigenicitu u nízkých koncentrací aplikovaných buněk. U buněk odvozených přímo z nádorů byly získány indukované nádory pouze u kombinace ALDH⁺CD133⁺, kombinace ALDH^-CD133⁺ ani ALDH^-CD133^- buněk nebyly schopny při stejných koncentracích buněk vyvolat tvorbu nádorů [16]. Navíc se ukázalo, že pacienti s ALDH⁺CD133⁺ nádory mají zhoršenou prognózu vývoje nemoci spojenou s vyšší úmrtností [16]. Vztah ALDH1 k chemorezistenci zjistila i další práce, která dále identifikovala asociaci tohoto markeru s CD44 a potvrdila negativní vliv vyšší exprese ALDH1 na celkové přežití pacientek [18].

CD44 (receptor pro hyaluronovou kyselinu) je dosud kontroverzní marker kmenových buněk u karcinomu ovaria, který je často uváděn společně s markerem CD117, popřípadě s markerem ALDH1 [18]. CD44 je transmembránový glykoprotein, který je zvažován v souvislosti s buněčnou adhezivitou, aktivací a migrací lymfocytů, tumorigenicitou a tvorbou metastáz [19]. CD44 se může překrývat s dalšími markery. Např. 40–80 % ALDH⁺, ABCG2⁺ a CD133⁺ buněk pocházejících z tumorů exprimovalo CD44 [11].

CD44⁺ buňky v kombinaci s CD117⁺ jsou uváděny ve spojitosti se schopností indukovat tvorbu nádorů a rezistencí k chemoterapii [15]. Nejnovější experimentální studie ukázala, že mikroRNA miR-199a reguluje expresi tohoto proteinu a experimentálně došlo při umělém zvýšení exprese této mikroRNA u CD44⁺CD117⁺ buněk k potlačení proliferace a schopnosti invazivity a ke zvýšení chemosenzitivity k cisplatině, paklitaxelu a adriamycinu [20].

CD44⁺CD24⁺EpCAM⁺ buňky s charakteristikami kmenových buněk se ukázaly být stimulovány doxorubicinem a cisplatinou, a inhibovány MIS (Müllerian inhibiting substance) (viz dále) v jedné z nejnovějších studií [21].

Nutno podotknout, že exprese CD44 je příkladem velmi sporných výsledků především u buněčných linií, s rozdíly jak mezi různými liniemi, tak u stejných linií, ale různých výzkumných skupin [22].

CD117 (c-kit) je samostatně zřídka studovaný marker nádorových kmenových buněk, který je rovněž markerem pro embryonální kmenové buňky, hematopoetické kmenové buňky a mezenchymální kmenové buňky. Byl identifikován u různých nádorů, kde jeho zvýšená exprese přispívá k horší prognóze pro pacienty [23].

Metodicky podobný přístup, jako byl použit ve studii [14], byl aplikován u markeru CD117. Výsledkem bylo zjištění, že CD117⁺ buňky mají potenciál indukovat nádory u myší a tento tumorigenní potenciál byl 100násobně vyšší v porovnání s CD117^- buňkami. Dalšími imunohistochemickými analýzami bylo zjištěno, že pozitivita pro expresi CD117 v nádorech je asociována s rezistencí vůči chemoterapii (platina-paklitaxel) [23]. Marker CD117 je často uváděn ve spojitosti s CD44 (např. [7, 15]).

CD24 je mucinový glykoprotein, identifikovaný jako marker kmenových buněk u karcinomu pankreatu a jater [7], který má význam v mezibuněčných interakcích, ale jeho přesné funkce nejsou stále známy [22].

Ve dvou recentních studiích byl ukázán význam CD24 jako dalšího z markerů kmenových buněk pro karcinom ovaria. Bylo identifikováno 20 klonů, které obsahovaly buňky exprimující CD24 (0,4–69,2 %), CD117 (0,1–1 %) a CD133 (1,2–53,2 %). CD24⁺ buňky vykazovaly znaky kmenových buněk, včetně vyšší chemorezistence (zde k cisplatině). Rovněž byla zvýšena exprese ABCG2 transportéru, který souvisí s vylučováním nejen barviva Hoechst 33342 u tzv. side populations, ale může souviset s procesy vylučování lipofilních chemoterapeutik nádorovými buňkami [24]. Aplikace 5000 CD24⁺ buněk byla schopna vyvolat tvorbu nádorů u myší (CD24^- buňky při stejné koncentraci nádory neindukovaly). CD24⁺ buňky měly vyšší expresi (mRNA) nestinu, beta-kateninu, Bmi-1, Oct4, Oct3/4, Notch1 a Notch4, tedy genů asociovaných s kmenovými buňkami [24].

Předpokládaná prostorová heterogenita tumorů s odlišením přední zóny (vedoucí zóna s předpokládaným vyšším podílem kmenových buněk) a zadní zóny (epicentrické) se prokázala v jiné studii, kde byly produkovány buněčné linie z buněk těchto zón (F1-F3 z přední, R1-R2 z epicentrické) [25]. Inhibiční účinnost u cisplatiny byla výrazně vyšší u linií R1 a R2. U přední zóny byla kromě vyšší odolnosti vůči cisplatině nalezena také vyšší exprese CD24 a CD117 (mRNA, pomocí RT-PCR). Další cytometrická analýza zaměřená na povrchové markery u F klonů ukázala rozdíly mezi klony a u tzv. side population (SP) vyšší zastoupení CD24⁺, CD117⁺ a CD117⁺CD24⁺ buněčných fenotypů. Např. CD117⁺CD24⁺ buňky byly u SP klonů F1 a F3 zastoupeny více než trojnásobně [25].

Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM, CD326) je typický epiteliální marker mnoha karcinomů (především adenokarcinomů). Jde o transmembránový glykoprotein s předpokládanou rolí v buněčné adhezi, signalizaci, migraci, proliferaci a diferenciaci [26]. U karcinomu ovaria vykazuje EpCAM zvýšenou expresi, a u kmenových buněk u buněčných linií byl nalezen ve funkčním propojení společně s markery CD24 a CD44. Navíc se ukázalo, že počty CD24⁺CD44⁺EpCAM⁺ kmenových buněk rostou po aplikaci chemoterapeutik (doxorubicin, cisplatina, paklitaxel), a naopak jsou inhibovány MIS (Müllerian inhibiting substance) [27]. Toto se potvrdilo i v nejnovější studii [21].

VÝZNAM NÁDOROVÝCH KMENOVÝCH BUNĚK PRO PROGNÓZU VÝVOJE NEMOCI

Stejně jako jsou kontroverzní data o charakteristických markerech nádorových kmenových buněk [22], často existují také rozporuplné údaje o souvislosti jejich exprese a klinického průběhu onemocnění s jasnou prognózou pro pacientky s karcinomem ovaria. Vyšší exprese ALDH tak byla asociována se zhoršenou prognózou, nebo naopak se zlepšenou prognózou [7]. Exprese CD133 v nádorových buňkách může fungovat jako samostatný negativní prognostický faktor [28], případně v kombinaci CD133⁺ALDH⁺ [16]. Zhoršená prognóza byla také nalezena u pacientek s tumory v časném stadiu, které obsahovaly více než 20 % CD44⁺ kmenových buněk [29].

ZTRÁTA NEBO ZISK MARKERŮ

Vzhledem k dynamické povaze procesů karcinogeneze a účastnících se buněk a složek mikroprostředí tumoru dochází k selekci buněk a jejich různému funkčnímu (hierarchickému) uspořádání. Buňky různých klonů odvozených z jednoho nádoru tak mohou mít např. různou schopnost růstu i různou fázi buněčného cyklu [24].

Kmenové buňky zřejmě hrají roli iniciátoru nádorového bujení, v dalším růstu a vývoji se neúčastní a zůstávají v klidu do okamžiku dalších podnětů, které je mohou aktivovat. Z hlediska buněk identifikovaných na základě jednoho markeru to může znamenat, že takové buňky mohou generovat buňky, jež daný marker neexprimují. Naopak buňky, které daný marker nemají, jej mohou získat. Toto bylo ukázáno např. u CD44^- buněk u buněčné linie OVCAR5, které daly vzniknout buňkám s CD44⁺ a CD44^- fenotypem [22].

Takové „přepínání markerů“ a tvorba heterogenních populací s různými kombinacemi markerů z původně jasně definovaných buněk byla ukázána i u markerů ALDH a CD133, ačkoli jednoznačná interpretace těchto výsledků neexistuje. Přestože je možné, že jde o technickou chybu a kontaminaci materiálu, možné jsou i jiné výklady jako de-diferenciace buněk (viz [7]) nebo asymetrické buněčné dělení, mutace apod. Byl navržen model, který předpokládá, že existuje společná ovariální kmenová buňka, která se dělí asymetricky a dá vzniknout buď ALDH⁺CD133⁺ (CD24^+/-) časné progenitorové nádorové kmenové buňce, nebo CD44⁺CD117⁺ (CD24^+/-) časné progenitorové buňce [7]. Každá z těchto buněk prodělá následná asymetrická dělení a vzniknou další progenitorové buňky, které jsou základem tumoru s diferencovanější histologií.

Pokud jde o dynamiku výskytu markerů kmenových buněk, lze říci, že při porovnání primárních nádorů, nádorů bezprostředně po aplikaci chemoterapie a recidivujících nádorů z hlediska CD133, ALDH1A1 a CD44 se ukázala nižší exprese u primárních vzorků, vzestup po aplikaci chemoterapie a návrat na původní hodnoty u recidivy [10]. Je možné, že právě časoprostorová funkční variabilita buněk v rámci tumoru, spojená s aktivací či inaktivací různých buněčných procesů, je zdrojem rozdílných výsledků v různých studiích.

NÁDOROVÉ KMENOVÉ BUŇKY A NOVÉ TERAPEUTICKÉ POSTUPY

Existuje mnoho studií zaměřených na nádorové kmenové buňky z hlediska cílení specifické léčby [7]. Pro CD44, který se váže na hyaluronovou kyselinu (HA), byla použita kombinovaná aplikace in vitro a in vivo (kombinovaná chemoterapie s HA nebo HA analogy), zvyšující účinnost léčby v několika studiích [7]. Další látka, syntetický derivát daidzeinu, tj. N-t-boc-Daidzein, se ukázal účinný při aplikaci na CD44⁺ kmenové buňky i na buňky z buněčných linií odvozených z buněk ascitu pacientek s karcinomem ovaria. V této studii došlo k inhibici růstu uvedených buněk, aktivaci kaspázy a apoptózy (programované buněčné smrti) [30].

CD117, považovaný za onkogen, je tyrozin kináza, jejíž inhibitory byly účinné u jiných typů nádorů, ale u karcinomu ovaria selhaly (např. Imatinib). Cílení na CD133⁺ buňky je komplikované, neboť tento marker je exprimován hematopoetickými kmenovými buňkami. ALDH inhibitory jsou účinné u několika typů nádorů (např. karcinom prsu a prostaty) a předběžné výsledky in vitro ukazují účinnost u kmenových buněk ovariálního karcinomu (Disulfiram) [7].

Vzhledem k rozporuplnosti výsledků studií zaměřených na identifikaci jednoznačných markerů nádorových kmenových buněk a chybějících informací o jejich fungování je zřejmě předčasné na jejich základě v nejbližší době očekávat zavedení účinné léčby.

BUDOUCNOST VÝZKUMU KMENOVÝCH BUNĚK

Pro identifikaci procesů spojených s ovariální karcinogenezí, včetně mechanismů vzniku chemo/radiorezistence a tvorby metastáz, bude výzkum nádorových kmenových buněk nezbytným základem. Dosavadní výsledky nejsou jednoznačné a trpí značnými metodickými problémy. Mnoho studií však ukazuje velký potenciál tohoto typu výzkumu pro efektivnější boj s nádorovými onemocněními.

Poděkování

Vznik tohoto článku byl podpořen projektem PRVOUK-P27/LF1/1.

RNDr. Luděk Záveský, Ph.D.

Ústav biologie a lékařské genetiky

1. LF UK a VFN

Albertov 4

128 00 Praha 2

e-mail: ludek.zavesky@vfn.cz