Přehled problematiky hodnocení tumor infiltrujících lymfocytů u karcinomu prsu v rutinní diagnostické praxi

Súhrn

Hodnocení tumor infiltrujících lymfocytů (TIL) nabývá u řady nádorových onemocnění na důležitosti v souvislosti nejen s ohledem na prognózu, ale i na jejich prediktivní význam. Jedním z nádorů, u kterého má hodnocení TIL kromě stanovení prognózy i potenciální dopad na modifikaci léčebných postupů, je karcinom prsu, zejména jeho tzv. triple negativní a HER2 pozitivní varianta. Cílem následujícího sdělení je podat přehled problematiky hodnocení TIL u karcinomu prsu se zaměřením nejen na praktické uplatnění tohoto hodnocení, ale zejména na metodické aspekty hodnocení a reportování výsledků.

Klíčová slova:

karcinom prsu – tumor infiltrující lymfocyty – prognóza – predikce

Hodnocení přítomnosti a rozsahu kulatobuněčné zánětlivé celulizace (tzv. tumor infiltrujících lymfocytů – TIL) nabývá poslední dobou na významu u diagnóz různých nádorových onemocnění, a to zejména s ohledem na prediktivní a prognostické aspekty (1,2). V rutinní praxi je hodnocení TIL zatím omezeno na několik solidních nádorů zahrnujících zejména melanom, kolorektální karcinom a karcinom prsu (3-8). Obecně však v současné době u žádné diagnózy nepředstavuje hodnocení TIL povinný parametr, jehož stanovení je vyžadováno, spíše se jedná o parametr, jehož hodnocení je u určitých diagnóz doporučené. Hodnocení TIL zahrnuje několik problematických aspektů, mezi které patří zejména metodika hodnocení a praktický klinický význam hodnocení TIL. S ohledem na metodiku je situace odlišná u různých typů nádorů. Např. u melanomu existuje několik způsobů evaluace TIL, přičemž s ohledem na prognostický význam mezi těmito způsoby není úplný překryv (5). Stejně tak u kolorektálního karcinomu existuje více možných přístupů, nicméně u této diagnózy je poměrně intenzivní snaha o standardizaci a zavedení hodnocení TIL do praxe (3,4). Postupy hodnocení TIL se obecně poměrně liší a zahrnují semikvantitativní hodnocení v barvení hematoxylin-eozinem, využití imunohistochemické typizace TIL i postupy využívající softwarové řešení (obrazovou analýzu). Vzhledem k uvedenému je snahou vytvořit jednotný systém, který by byl univerzální pro všechny typy solidních nádorů a dostupný bez potřeby využití speciálního, často nákladného, software a imunohistochemických metod. Takový systém představuje způsob hodnocení navrhovaný „International Immuno-Oncology Biomarker Working Group“ (1,2). Jedná se o systém vycházející ze standardizované metodiky pro hodnocení TIL u karcinomu prsu vypracované stejnou pracovní skupinou v minulosti. Systém hodnotí procentuální rozsah (denzitu) lymfocytární infiltrace samostatně v oblasti nádorového stromatu a vlastního nádoru intraepiteliálně (9,10).

Cílem následujícího sdělení je podat přehled problematiky TIL a jejich hodnocení u karcinomu prsu, a to se zaměřením nejen na klinický význam TIL, ale zejména na praktické aspekty testování využitelné v rutinní bioptické diagnostice.

TIL U INVAZIVNÍHO KARCINOMU PRSU

Hodnocení TIL se u karcinomu prsu stává významnou součástí histologického vyšetření a v současné době se jedná o robustní biomarker, jehož validita byla s ohledem na prognostický i prediktivní význam prokázána ve více studiích i na velkých souborech pacientek (11-13). U časných stádií triple-negativního (TNBC) a HER2-pozitivního karcinomu prsu se jedná o prognostický parametr, u kterého je patrná lineární souvislost mezi úrovní TIL a dobou přežívání pacientek bez nemoci – tzv. DFS („disease-free survival“) a uvedené nádory s výraznou přítomností TIL mají obecně velmi dobrou prognózu (11). TIL lze tedy u TNBC a HER2-pozitivních karcinomů prsu použít jako prognostický parametr. Hodnocení TIL je u časného stádia TNBC uvedeno i v doporučení St. Gallen z roku 2019 (14). V rámci hlasování panelu expertů na poslední koferenci St. Gallen v březnu letošního roku (2021) se však pro rutinní testování TIL u časného TNBC vyslovilo jen 39 % panelistů (dosud nepublikované sdělení) a tato problematika aktuálně není zcela dořešena. Důvodem je nejasná implementace této informace do klinické praxe, kdy nevíme, zda můžeme nemocné, jejichž nádory jsou bohaté na TIL, léčit méně (kratší dobu či vůbec) a jakou léčbou (standardní režimy založené na atracyklinech a taxanech +/- anti-HER2 léčbě nebo založené na platinové chemoterapii či imunoterapii). Přítomnost TIL je u TNBC spojena se zvýšenou pravděpodobností odpovědi na neoadjuvantní chemoterapii s dosažením kompletní patologické odpovědi, a také s lepší prognózou onemocnění po adjuvantní léčbě antracykliny (12,15-18). Jak je však zdůrazněno v recentním St. Gallen guideline, aktuálně se jedná o prognostický marker. K tomu, aby bylo možné TIL doporučit jako prediktivní test ovlivňující rozhodnutí o (neo)adjuvatní léčbě, nejsou v tuto chvíli dostatečná data (14). Prognostický význam TIL stoupá, zdá se, se stádiem nemoci (19), v retrospektivním hodnocení byla prokázána výborná prognóza i u pacientek s časným TNBC, které nebyly léčeny adjuvantní chemoterapií (20). Jednalo se o pacientky stadia I, u kterých byl při TIL >30 % pětileté období přežití bez metastáz D-DFS (distant disease free survival) 97 % a celkové přežití - overall survival (OS) 98 % bez nutnosti podání adjuvantní chemoterapie. U HER2-pozitivních nádorů byla prokázána souvislost mezi vyšší mírou TIL a lepší odpovědí na anti-HER2 léčbu, což deklaruje kooperaci imunitní odpovědi a monoklonálních protilátek cílících receptory z rodiny HER (11,13,21,22). Další významnou oblastí, ve které může hrát přítomnost TIL roli, je predikce odpovědi na imunoterapii (terapii tzv. check-point inhibitory). V současné době se však nejedná o marker, který by byl v této indikaci validován (23-25). Obecně platí, že TNBC a HER2-pozitivní karcinomy vykazují vyšší intenzitu TIL, která bývá v rozsahu udávaném jako hranice pro tzv. karcinomy prsu s predominancí lymfocytů („lymphocyte- -predominant breast cancer“), tedy 50 % (60 %) TIL, přítomna u 20 % TNBC a 16 % HER2-pozitivních karcinomů, oproti karcinomům hormonálně dependentním, u kterých se vyskytuje jen v asi 6 % případů (26). Praktický význam hodnocení TIL u hormonálně dependentních karcinomů je diskutabilní, prognostický význam TIL u těchto nádorů nebyl ve většině studií prokázán, jiné práce však ukazují, že hodnocení TIL může být prognosticky významné i u těchto nádorů (27-29) a je zjevně zapotřebí dalšího výzkumu. V literatuře je také diskutován i potenciální význam hodnocení TIL u hormonálně dependentních nádorů s ohledem na účinnost adjuvantní léčby tamoxifenem, kdy výsledky některých studií poukazují na lepší efekt této léčby u nádorů s nízkým počtem TIL, tedy jejich negativní prognostický význam (27).

TIL se mohou vyskytovat jak v nádorovém stromatu, tak i přímo v nádorovém epitelu, tedy intratumorózně (v užším a poněkud nepřesném slova smyslu - nádorové stroma je integrální a důležitou součástí nádoru, správnější termín by tedy byl intraepiteliálně)(18). Historicky byly používány různé metodiky skórování TIL, i přesto bylo s ohledem na prognostický i prediktivní význam TIL dosaženo obdobných výsledků při samostatném hodnocení intratumorózních a stromálních TIL (30, 31). Nicméně v multivariantních modelech se ukazuje, že hodnocení intratumorózních lymfocytů nemá další prognosticky významnou přidanou hodnotu (32,33). Z praktických důvodů se proto u karcinomu prsu hodnotí pouze přítomnost stromálních a nikoliv intratumorózních lymfocytů. V současné době používá většina studií při hodnocení TIL u karcinomu prsu metodiku vypracovanou „International Immuno-Oncology Biomarker Working Group“, která je doporučována jako způsob hodnocení TIL i v poslední edici WHO klasifikaci nádorů prsu (34,35). Tato metodika má několik výhod, to zejména v poměrné jednoduchosti, relativně vysoké interpersonální shody při hodnocení a zejména pak v tom, že vychází pouze ze standardního barvení hematoxylinem- eozinem. Klinicky relevantní cut-off, který by rozdělil nádory na „TIL pozitivní“ a „TIL negativní“, však nebyl stanoven a je tedy doporučeno TIL uvádět jako kontinuální proměnnou (tedy konkrétní číselný údaj). Někdy se pro nádory s vysokým množstvím TIL (obvykle je za hranici pokládáno 50 % nebo 60 % stromálních TIL) používá označení „karcinom prsu s lymfocytární predominancí“ (26, 36). Podle terminologie poslední WHO klasifikace nádorů prsu jsou však nádory s hojnými TIL klasifikovány jako „invazivní karcinom NST“ (invazivní duktální karcinom) s medulární úpravou („pattern“)(35). Podle této klasifikace se tedy nejedná o samostatný histologický typ (subtyp), ale pouze o morfologické rysy zahrnující nádory v minulosti klasifikované jako medulární karcinom, atypický medulární karcinom a invazivní (duktální) karcinom NOS s medulárními rysy. V molekulární klasifikaci triple negativního karcinomu prsu byl subtyp bohatý na TILS označen jako imunomodulační (37).

V kontextu testování TIL je důležité si také uvědomit, že mezi primárními nádory a metastázami je poměrně vysoké procento neshodných (diskordantních) případů, které se podle recentní metaanalýzy u karcinomu prsu pohybuje na úrovni 37 % (38). Podstatně častější je změna z vysokého stupně infiltrace TIL na nízký. V současnosti se také studuje význam TIL u pacientek s reziduální chorobou po neoadjuvantní chemoterapii u TNBC a HER2-pozitivních karcinomů prsu, což by v budoucnu mohlo v této klinické situaci ovlivnit volbu další systémové léčby (39).

TIL U DUKTÁLNÍHO KARCINOMU IN SITU (DCIS)

V případě duktálního karcinomu in situ (DCIS), kterému bylo doposud věnováno méně pozornosti, se ukazuje, že TIL pravděpodobně nemají prognostický význam, ale jsou častěji asociovány s určitými klinicko-patologickými znaky, jako jsou zejména vyšší grade, přítomnost komedoniformní nekrózy, větší velikost nádoru a nižší věk (40). V jedné recentní studii však bylo prokázáno, že DCIS s vyšším počtem TIL recidivují dříve a TIL v tomto případě tedy představuje prognosticky nepříznivý faktor (41). Jako problematické se nicméně v této studii ukázalo použití metodiky hodnocení stromálních TIL. Jiná studie se zaměřila na hodnocení tzv. „touching TILs“ (tedy TIL v kontaktu s periferií vývodů osídlených DCIS nebo intraepiteliálně nad bazální membránou, avšak pouze do šíře 1 lymfocytu) a „circumferential TILs“ definovaných jako cirkumferenciální (či téměř cirkumferenciální, tedy > 75 % obvodu) přítomnost lemu lymfocytů a plazmatických buněk v zóně širší než 3 buněčné vrstvy (42,43). Výsledky byly srovnávány s výsledky Oncotype DCIS skóre, vyhodnocení tohoto srovnání však nebylo signifikantní. Data ale poukazují na fakt, že TIL u DCIS mohou být prediktorem rekurence, nutný je však další výzkum.

Postup hodnocení TIL u karcinomu prsu podle „International Immuno-Oncology Biomarker Working Group“

Metodika vychází z původní práce Denkerta et al. z roku 2010, je standardizovaná a vychází z barvení hematoxylinem-eozinem bez nutnosti využití imunohistochemických metod či obrazové analýzy (9, 15). Hodnotí se stromální lymfocyty, konkrétně celkový procentuální rozsah denzity lymfocytární infiltrace stromatu v oblasti vymezené hranicemi invazivního nádoru. Metodika je kromě příslušných publikací přesně popsána na webových stránkách zmíněné pracovní skupiny, kde jsou k dispozici i výukové sady a další materiály (https://www.tilsinbreastcancer. org/).

Základní body hodnocení

1) Preferováno je hodnocení resekátů před punkčními biopsiemi, hodnocení z punkčních biopsií zejména před neoadjuvantní terapií je však možné. Preference resekátů před punkčními (či jinými diagnostickými) biopsiemi primárně souvisí hlavně s heterogenitou distribuce TIL. Studie, které se věnovaly problematice srovnání mezi primárními diagnostickými biopsiemi a následnými resekáty, prokázaly signifikantně vyšší hodnoty TIL v resekátu oproti diagnostické biopsii (44,45). V rámci hodnocení resekátu je však nutné vyloučit oblasti po předchozím odběru, ve kterých se vyšší počet zánětlivých elementů může vyskytovat v souvislosti s reaktivními a následnými reparativními procesy.

2) Obecně je jako dostatečné doporučováno hodnocení 1 řezu při zvětšení 200-400x.

3) TIL se hodnotí pouze ve stromatu invazivního nádoru a udávají se jako % plochy stromatu infiltrované TIL (obr. 1). Při hodnocení se musí zohlednit i to, že lymfocyty u nádorů obvykle nevytvářejí splývající plochy a je mezi nimi určitý prostor, tj. i při 100 % stromálních TIL nebude stroma lymfocyty zcela vyplněno. Stromální TIL z definice představují buňky lokalizované ve stromatu nádoru, které nejsou v přímém kontaktu („cell-to-cell“) s nádorovými buňkami, a to nejen v hnízdech nádorových buněk, ale ani v jejich okolí. Nádorové stroma je omezeno na vlastní nádorové struktury, peritumorální stroma se do hodnocení nezapočítává.

4) TIL v okolí nádoru či v oblasti DCIS a přilehlých benigních strukturách se nehodnotí.

5) Oblasti zhmožděné, nekrotické a regresivně změněné včetně oblastí s hyalinizacemi se nehodnotí.

6) Mezi TIL se počítají všechny tzv. mononukleáry (zahrnující lymfocyty, plazmatické buňky, makrofágy, dendritické buňky). Neutrofilní granulocyty a další elementy (eozinofily, basofily, žírné buňky) se nepočítají.

7) Hodnotí se celý řez, nikoliv pouze oblasti se zvýšenou infiltrací zánětlivých elementů – tzv. „hot spots“.

8) TIL jsou reportovány jako kontinuální parametr a v současné době nejsou přesně stanovené, klinicky relevantní hranice pozitivity. Doporučováno je reportování zcela dle uvážení patologa s tím, že v praxi je obvyklé spíše zaměření se na určité hraniční hodnoty např. s 5% či s 10% rozmezím, než uvádění přesného čísla.

Nejčastější příčiny diagnostických neshod

Do současné doby proběhly dvě větší studie, které se zaměřily na hodnocení diagnostické shody při hodnocení TIL (10). První studie měla 2 kola (se 32 hodnotiteli na 60 případech a se 28 hodnotiteli na 60 případech) s celkovou konkordancí 88 % v prvním kole a 92 % ve druhém kole. Druhá studie probíhala na 100 případech (46). V této studii byla konkordance mezi hlavním hodnotitelem a 6 dalšími patology 90,8 %. V následné recentní reanalýze uvedených studií byly vyhodnoceny nejčastější příčiny diagnostických neshod, na které je vhodné se při hodnocení speciálně zaměřit (47). Tyto příčiny zahrnovaly: nádorovou heterogenitu, technické faktory, zahrnutí pro hodnocení nevhodných oblastí nádoru či hodnocení nesprávných buněk, a případy s malým množstvím stromatu. Jak autoři zdůrazňují, při dodržení všech definovaných základních principů hodnocení se jako klíčové body jeví hodnocení více oblastí u heterogenních nádorů a používání referenčních obrázků usnadňujících správné hodnocení („naprahování“) denzity pozitivity. Tyto referenční obrázky a aplikace, která umožní srovnání vlastních případů s referenčními obrázky, jsou po bezplatné registraci k dispozici na webových stránkách https://www.tilsinbreastcancer.org/. Jednotlivé potenciálně problematické aspekty hodnocení jsou diskutovány níže. Problematické případy a jejich hodnocení jsou také dostupné na již zmíněných stránkách (https://www.tilsinbreastcancer. org/pitfalls/).

Nicméně i při použití referenčních obrázků dochází k diskrepancím, a to zejména u nádorů s nižšími hodnotami TIL, jak ukázaly výsledky evropské studie na 84 vzorcích hodnocených celkem 19 mamárními patology (48).

1. Nádorová heterogenita

Jedná se o faktor, který byl jednou z nejčastějších příčin neshody. Problematické bylo hodnocení nádorů, které vykazovaly heterogenitu TIL v celém rozsahu nádoru - v těchto případech je nutné skórovat odlišné oblasti nádoru a ty pak zprůměrovat. Dalším problémem byly nádory, které měly výrazné množství TIL v oblasti invazivního okraje – u těchto nádorů se hodnotí TIL pouze v případě, že jsou přítomny v periferii nádoru, nikoliv v přilehlém stromatu bez nádorových struktur.

2. Technické faktory

Tyto faktory zahrnovaly špatnou kvalitu histologických preparátů v souvislosti s prolongovanou ischemií, špatnou fixací, a problémy při zpracování tkáně (včetně zalévání a krájení na mikrotomu). Technické aspekty byly významné zejména ve studii 100 případů, které představovaly excizní biopsie z více center. Naopak v dalších 2 srovnávacích studiích tyto faktory nehrály podstatnější roli, což může souviset i s tím, že se jednalo o punkční bioptické vzorky. Na obecné úrovni a v rutinní diagnostické praxi je však s těmito faktory nutné počítat a hodnocení TIL provádět z technicky co nejlepších řezů.

3. Zahrnutí nevhodných oblastí nádoru a hodnocení nesprávných buněk

Hodnocení probíhá pouze v oblastech invazivního karcinomu. Vyloučit je tedy nutné in situ léze, jako je DCIS či opouzdřený papilární karcinom. Problematické může v některých případech být stanovení hranice nádoru, protože dochází k započítání nesprávných oblastí, které jsou mimo vlastní nádorové stroma. Již zmíněná složka DCIS může být zaměněna za invazivní složku a způsobit problémy při hodnocení ať už kvůli vlastnímu hodnocení lymfocytů v této oblasti, nebo chybnému vymezení hranic invazivního nádoru. Stejně tak přítomnost zánětlivých infiltrátů v lobulech a v oblasti reziduálních struktur nenádorového parenchymu prsu může vést k chybnému vymezení hranice nádoru a tím pádem být příčinou chybného vyhodnocení jako TIL v oblasti nádoru. Nutné je v tomto kontextu opět zdůraznit, že se hodnotí pouze TIL ve stromatu, nikoliv tedy TIL v nádorovém epitelu (intraepiteliální TIL) a ani TIL, které jsou na rozhraní stromatu a epitelu v přímém kontaktu s nádorovými buňkami.

Hodnocení nesprávných buněk zahrnuje započítání dalších zánětlivých elementů jiných než mononukleárů. Další elementy, které mohou být chybně započítány, jsou apoptoticky zanikající či regresivně změněné nádorové buňky. S ohledem na správný výběr započítávaných elementů je tedy často nutné použít velké zvětšení, které spolehlivě umožní zhodnocení složení přítomného infiltrátu.

4. Limitovaná přítomnost stromatu pro hodnocení

Výsledky mohou být zkresleny i z tohoto důvodu. Nejčastěji tato situace nastává u nádorů s výraznými regresivními změnami s nekrózami, po jejichž vyloučení zbývá minimum hodnotitelné vitální tkáně. Problematické může být i hodnocení nádoru, který obsahuje minimální množství stromatu i přes absenci regresivních změn, jako jsou například mucinózní karcinomy.

ZÁVĚR

Hodnocení TIL u karcinomu prsu se stává důležitou součástí diagnostického procesu zejména u TNBC a HER2-pozitivního karcinomu prsu, u kterých má prognostický význam, zejména s ohledem na predikci kompletní patologické odpovědi (pCR) po neoadjuvantní terapii a odpovědi na adjuvantní chemoterapii. U ostatních typů invazivního karcinomu prsu je význam hodnocení TIL diskutabilní. Některé recentní studie však prokázaly prognostický význam i u hormonálně dependentních nádorů, zejména těch s vysokou proliferací, na které je vázána přítomnost TIL. Pro efekt hormonální terapie jsou TIL spíše negativním prediktorem (27). Hodnocení TIL je u karcinomu prsu doporučováno dle St. Gallen guideline (2019) u TNBC, kde má prognostický význam, a je doporučováno i podle nové WHO klasifikace nádorů prsu (14,35). Metodicky by se měl používat způsob hodnocení vypracovaný „International Immuno-Oncology Biomarker Working Group“, který je standardizován a aktuálně představuje nejlepší způsob hodnocení TIL. Jeho výhodou je kromě jednoduchosti (vychází pouze z barvení hematoxylinem- -eozinem) a dostupnosti výborných edukačních a tréninkových materiálů i to, že užíváním standardizované metodiky umožňuje srovnatelnost napříč různými studiemi. Aktuálně nejsou přesně definovány hranice pozitivity umožňující jednoznačnou stratifikaci do jakýchsi definovaných kategorií a TIL tedy představuje kontinuální proměnnou. Pro praktické účely je sice možné vyčlenění skupiny nádorů s nízkou přítomností TIL (jako cut-off se v některých studiích používá hranice < 10 %), nutné je však zdůraznit, že toto dělení je arbitrární a některé práce prokázaly jako signifikantní jiné prahové hodnoty (např. > 20 % TIL) (15,22). Obecně platí, že prognostický význam přítomnosti TIL narůstá se zvyšujícím se procentem stromální infiltrace. V několika studiích bylo prokázáno, že s každým zvýšením TIL o 10 % se zlepšují parametry jako je DFS („disease free survival“) a OS („overall survival“) (19). Jako nádory s lymfocytární predominancí („lymphocyte-predominant breast cancer“), které by dle nové WHO klasifikace karcinomů prsu spadaly do kategorie invazivního karcinomu NST s medulárními rysy či úpravou („medullary pattern“), jsou označovány nádory s TIL přesahujícími 50 či 60 %. Hodnocení TIL má svá úskalí, ale při jejich vědomí a standardizaci postupů hodnocení lze dosáhnout vysoké míry interobservační shody. K tomu dopomáhají i výukové a tréninkové materiály zveřejněné on line. I přesto, že hodnocení TIL není v rámci bioptického nálezu mandatorní, jedná se o klinicky významný parametr s prognostickým a potenciálně i prediktivním významem, jehož hodnocení u TNBC a HER2-pozitivního karcinomu prsu by mělo být součástí vyšetření.

PODĚKOVÁNÍ

Práce byla podpořena MZČR (projekt RVO VFN 64165) a Univerzitou Karlovou (projekt Progres Q28/LF1 a SVV 260516).

PROHLÁŠENÍ

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Adresa pro korespondenci:
Prof. MUDr. Pavel Dundr, Ph.D.
Ústav patologie 1. LF UK a VFN v Praze
Studničkova 2
128 00, Praha 2
pavel.dundr@mailbox.org