DNA diagnostika najčastejších monogénových foriem diabetu na Slovensku

Súhrn

Monogénový diabetes je typom cukrovky, u ktorého je genetická porucha rozhodujúca pre vznik ochorenia. Ide o etiologicky veľmi rôznorodú skupinu ochorení, pričom v súčasnosti poznáme viac ako 20 génov zodpovedných za jeho vznik. Pre jeho klinickú podobnosť s majoritnými typmi diabetu, odlíšenie a definitívne stanovenie diagnózy umožňujú len metódy analýzy DNA. Identifikácia ľudí s týmto typom diabetu je dôležitá aj pre špecifickú liečbu a prognózu diabetu.

Klíčová slova:

analýza DNA – monogénový diabetes mellitus MODY

Úvod

Monogénové formy jednotlivých ochorení sú charakteristické tým, že porucha vzniká na základe defektu v jednom géne. Ide o rôzne mutácie DNA, ktoré stačia na klinické prejavenie sa ochorenia. Monogénové ochorenia ale môžu mať často veľmi podobné prejavy ako polygénové (napríklad podobnosť s diabetom 1. alebo 2. typu). Typickým rozdielom je rodinný výskyt ochorenia (najčastejšie s autosómovo-dominantným typom dedičnosti). Mutácie spôsobujúce diabetes sa môžu vyskytovať nielen v jadrovej DNA, ale aj v mitochondriál­nej DNA s matrilineárnym typom dedičnosti. Monogénovým formám ochorení sa venuje stále veľká pozornosť, a to najmä pre nové možnosti ich diagnostiky, kauzálnej liečby a prevencie.

Monogénový diabetes mellitus je rôznorodá skupina ochorení líšiacich sa etiológiou, patogenézou, liečbou a prognózou. Spoločnou črtou je chronická hyperglyk­émia, ktorú vyvoláva mutácia génu zasahujúceho do vylučovania alebo účinku inzulínu. V klasifikácii z roku 2008 podľa Murphyovej sa monogénová cukrovka rozdeľovala do 4 podskupín:

1. neonatálny diabetes mellitus
2. diabetes s rodinným výskytom a skorým začiatkom
3. hyperglykémia nalačno s rodinným výskytom
4. diabetes s extrapankreatickými príznakmi

Problémom tejto klasifikácie bolo, že diabetes typu MODY bol rozdelený až do 3 podskupín (2, 3 a 4), pričom z klinického hľadiska ide o pomerne dobre definovanú a používanú skupinu ochorení. V aktuálnej modifikácii klasifikácie monogénového diabetu podľa organizácie International Society for Pediatric and Adolescent Diabetes (ISPAD) [1] sa zlúčili kategórie 2 a 3, a navyše sa vytvorila samostatná skupina monogénových syndrómov inzulínovej rezistencie:

1. neonatálny diabetes mellitus
2. hyperglykémia alebo diabetes s rodinným výskytom a autosómovo-dominantným typom dedičnosti (Maturity Onset Diabetes of the Young – MODY)
3. genetické syndrómy asociované s diabetom (mito­chondriálny diabetes, diabetes s renálnymi cystami, Wolframov syndróm)
4. monogénové syndrómy inzulínovej rezistencie (mutácie inzulínového receptora, lipoatrofický diabetes)

Epidemiológia monogénového diabetu nie je ani v súčasnosti presne známa [2]. Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) je najčastejším typom monogénového diabetu a tvorí približne 1 % pacientov mladších ako 45 rokov, s pôvodnou klasifikáciou diabetes 1. typu (DM1T) a približne 4 % spomedzi pacientov mladších ako 45 rokov s diabetom 2. typu (DM2T) [3]. Ako druhý najčastejší typ sa odhaduje mitochondriálny diabetes (cca 0,5 % spomedzi všetkých pacientov s diabetom) [4]. Výskyt ostatných typov monogénového diabetu vrátane syndrómových foriem sa odhaduje ako nižší. Presná incidencia a prevalencia je známa len v prípade permanentného neonatálneho diabetu, ktorá sa opiera o celonárodné registre detského diabetu a pohybuje sa medzi 1 : 200 000–300 000 živo narodených detí [5–7].

Gény zodpovedné za monogénový diabetes

Najčastejšou príčinou monogénového diabetu sú mutácie v jednom zo 4 génov. Ide o gény, ktoré kódujú transkripčné faktory: hepatálny nukleárny faktor 1α (HNF1A), 4 α (HNF4A), 1β (HNF1B) a enzým glukokinázy (GCK). Od odhalenia týchto 4 génov sa objavujú nové vzácne formy monogénového diabetu, ktoré rozšírili spektrum jeho genetickej etiológie (tab).

Diagnostika pacientov s monogénovým diabetom

Diagnostika sa skladá z klinickej a laboratórnej časti, ktorá zahŕňa zisťovanie mutácií cieľových génov metódami DNA-analýzy (v SR dostupná od roku 2003 v laboratóriu DIABGENE).

Klinická diagnostika neonatálneho DM sa opiera o včasný začiatok do 6. mesiaca života a negativitu auto­protilátok. Jeho diagnostika je v SR veľmi dobre podchytená aj vďaka celonárodnému registru detí s DM. Vo svete je aj snaha o jeho skríning využitím glykémie v prvých dňoch po narodení [8].

Klinická diagnostika diabetu transkripčných faktorov je ale oveľa akútnejší diferenciálno-diagnostický problém, keďže je nielen častejší, ale aj klinicky a laboratórne ťažšie odlíšiteľný od DM1T aj DM2T. Najčastejšími podtypmi v skupine diabetu transkripčných faktorov sú HNF1A-MODY (spôsobený mutáciami HNF1A, označovaný aj ako MODY3) a HNF4A-MODY (spôsobený mutáciami HNF4A a označovaný aj ako MODY1). Ochorenie má progresívny charakter a vekom sa zhoršuje [9,10], pričom neadekvátna kompenzácia sa spája s vysokým rizikom vzniku chronických komplikácií. Obe ochorenia môžu mať aj novorodeneckú fázu s hyperinzulinemickými hypoglykémiami (liekom voľby je diazoxid) [11–13]. Hyperglykémia sa manifestuje zvyčajne až po 10. roku života, najčastejšie počas puberty a adolescencie, miernymi alebo žiadnymi príznakmi [14]. Pri manifestácii sa nikdy nevyskytuje keto­acidóza. Klinická časť diagnostiky sa opiera o klinické diagnostické kritériá. Pôvodné diagnostické kritériá navrhnuté v 70. rokoch Fajansom a Tattersallom [15–17] zahŕňali: viacgeneračný výskyt DM s dominantným typom dedičnosti, začiatok do 25. roku života a merateľný C-peptid. Nakoľko tieto kritériá nie sú špecifické pre jednotlivé podtypy MODY, bola navrhnutá ich modifikácia. V roku 2008 sa vypracovali Európske odporúčania na diagnostiku diabetu typu MODY [18]. DNA-diagnostiku génov HNF1A a HNF4A odporúčajú vykonať u pacientov, ktorí majú súčasne:

• rodinný výskyt DM s autosómovo-dominantným typom dedičnosti v minimálne 2 generáciách
• začiatok do 25. roku života
• merateľný C-peptid minimálne 3 roky od manifestácie diabetu
• neprítomnosť autoprotilátok proti štruktúram B-buniek a neprítomnosť znakov metabolického syndrómu
• podporné kritériá sú vzostup glykémie v 120. minúte orálneho glukózového tolerančného testu (oGTT) od bazálnej hodnoty o ≥ 5 mmol/l, alebo glykozúria pri normoglykémii

Tieto kritériá majú vyššiu špecificitu ako pôvodné, navrhnuté Fajansom a Tattersallom, ale v niektorých prípadoch môžu byť falošne negatívne. Senzitivita týchto kritérií je približne 50–75 % [3,16]. Problémom sú de novo mutácie, ktorých nosiči nemajú rodinný výskyt DM, ako aj vysoký výskyt obezity a metabolického syndrómu v bežnej populácii (ľudí s MODY nevynímajúc), ktoré spôsobujú tiež falošnú negativitu diagnostických kritérií, pretože neprítomnosť obezity a metabolického syndrómu patrí medzi podporné diagnostické znaky.

Od roku 2011 je na webovej stránke Exeterskej Univerzity (www.diabetesgenes.org) dostupná on-line kalkulačka MODY, ktorá vypočíta pravdepodobnosť MODY na základe vloženia klinických prejavov konkrétneho pacienta. Hranicu, od ktorej sa indikuje analýza DNA, si tak každý môže upraviť sám. Celý systém je veľmi jednoduchý a má viaceré výhody oproti spomínaným diagnostickým systémom. Bol ale vypracovaný na základe regresného modelu s použitím údajov z Exeterskej databázy, v ktorej sa primárne analyzovali pacienti, ktorí spĺňali vyššie uvedené klinické diagnostické kritériá z roku 2008. Preto má tiež nižšiu senzitivitu pre de novo mutácie a tiež pre pacientov s neskorším začiatkom ochorenia.

Klinická diagnostika glukokinázového diabetu (GCK-MODY). Ochorenie patrí tiež do skupiny MODY a vzniká na podklade inaktivačnej mutácie génu pre glukokinázu. Diagnostikuje sa zvyčajne do 30. roku života, má rodinný výskyt a veľmi dobrú prognózu [19]. Odhaduje sa, že GCK-diabetes tvorí približne 0,5 % spomedzi všetkých ľudí s diabetom [20]. GCK-MODY sa prejavuje bezpríznakovou hyperglyk­émiou nalačno, zvyčajne medzi 5,5 a 8,5 mmol/l [21–23]. Hyperglykémia nalačno je stacionárna a vekom sa nezhoršuje. Hyperglykémia je prítomná už v prvých mesiacoch po narodení, nemá ale žiadne príznaky, preto jej diagnostika je náhodná (preventívne prehliadky, skríning glykémie v 11. a 17. roku života, predoperačné vyšetrenia, skríning tehotných žien) [24]. Klinická časť diagnostiky sa opiera o súčasné Európske odporúčania [18], ktoré odporúčajú vykonať DNA analýzu GCK génu u pacientov, u ktorých sú súčasne prítomné:

• stabilná, opakovane nameraná hyperglykémia nalačno 5,5–8,5 mmol/l
• mierny priebeh diabetu s HbA_1c do 7,5 % (DCCT)
• neprítomnosť autoprotilátok proti štruktúram B-buniek a neprítomnosť znakov metabolického syndrómu
• rodinný výskyt diabetu alebo hyperglykémie nalačno s autosómovo-dominantným typom dedičnosti v minimálne 2 generáciách
• vzostup glykémie v 120. minúte oGTT od bazálnej hodnoty o < 3 mmol/l

Nižšiu špecificitu majú u ľudí s neskorším záchytom hyperglykémie, vyššími hodnotami glykémie počas oGTT, ako aj u obéznych ľudí [25]. Podobne aj kalkulačka MODY má nižšiu senzitivitu u ľudí s neskorým záchytom hyperglykémie nalačno.

Laboratórna diagnostika tranzientného neonatálneho diabetu sa zameriava najmä na poruchy imprintingu viazané na chromosomálnu oblasť 6q24. Pri permanentnej forme neonatálneho DM sú to najmä gény KCNJ11 a ABCC8 kódujúce podjednotky draslíkového kanála B-buniek a inzulínový gén. DNA-diagnostika MODY diabetu zahŕňa zisťovanie mutácií v génoch GCK, HNF1A alebo HNF4A, pričom cieľový gén sa indikuje podľa klinického priebehu. V prípade špecifického fenotypu, ako je napr. GCK-MODY (izolovaná hyperglykémia nalačno) alebo HNF1B-MODY, indikujeme Sangerovo sekvenovanie (metóda sekvenovania jedného génu). V prípade ostatných typov MODY-génov je zložitejšie určiť konkrétny gén na základe klinického priebehu, preto sa indikuje priamo panelové sekvenovanie, v rámci ktorého analyzujeme 13 génov súčasne. Postup DNA analýzy MODY realizovaný v súčasnosti v laboratóriu DIABGENE je uvedený na schéme.

Určenie patogenity identifikovaného génového variantu

Určenie, či je nájdený génový variant patogénny, je v súčasnosti veľkou výzvou pri interpretácii výsledkov získaných najmä zo sekvenovania novej generácie. Nesprávna interpretácia génových variantov môže viesť až k vážnym klinickým konzekvenciám. V rámci diagnostiky monogénového diabetu je častokrát veľmi problematické zistiť, aký má daný variant vplyv na funkciu proteínu, či spôsobuje ochorenie, alebo je neutrálny [26]. Tento stav je v prípade MODY diabetu často komplikovaný vysokým výskytom iných typov diabetu v populácii, čo sťažuje napríklad stanovenie kosegregácie ochorenia s variantom v rodine.

Práve preto boli vypracované odporúčania, ktorých cieľom je štandardizovať spôsob určovania patogenity génových variantov, a to najmä pomocou rôznych prístupov, ako je predikcia in silico, funkčné štúdie in vitro, populačné štúdie a klinické údaje. Najčastejšie používané kritériá definovala Richards et al [27] a podľa nich rozdeľujeme varianty na 5 tried: 1. benígne, 2. pravdepodobne benígne, 3. varianty s nejasným významom, 4. pravdepodobne patogénne a 5. patogénne, pričom iba varianty triedy 4 až 5 sú podľa odporúčaní uvedené v písomnom výsledku odosielanom klinickým pracovníkom. Varianty triedy 3, o ktorých je buď nedostatok informácií alebo sú protichodné, môžu byť reportované s cieľom získať ďalšie informácie na ich charakterizáciu, nie sú však potvrdením ani vyvrátením diagnózy.

Nato, aby sme zatriedili variant do jednotlivých kate­górií, je potrebná znalosť širokého spektra informácií, medzi ktoré patria napríklad:

frekvencia variantu v zdravej populácií MAF (Minor Allele Frequency): v súčasnosti najpoužívanejšou populačnou databázou je gnomAD databáza (Genome Aggregation Database, ktorá obsahuje sekvenciu > 125 000 exómov a >15 700 genómov). Najväčšiu výhodu majú tzv. in-house populačné databázy, ktoré sú produkované analýzou dát daného laboratória a obsahujú údaje získané v rámci populácie s najbližším evolučným pôvodom. V laboratóriu DIABGENE k dnešnému dňu evidujeme údaje zo 178 exómov, a vytvárame tak postupne vlastnú databázu.

• typ variantu (napr. zámena aminokyseliny, narušenie zostrihového miesta, posun čítacieho rámca, zavedenie predčasného STOP-kodónu)
• lokalizácia variantu vo funkčných doménach proteínu
• informácie o iných známych variantoch v danej pozícii
• in silico predikcie pomocou softvérov, ktoré zohľadňujú evolučnú konzervovanosť na úrovni DNA i proteínu, funkčné zmeny v proteíne, „chemickú závažnosť“ zámeny aminokyselín (napr. SIFT, polyfen-2, provean), či metaprediktory, ktoré berú do úvahy väčší počet jednotlivých prediktorov (napr. CADD, REVEL)
• miera podobnosti klinického fenotypu pacienta s fenotypovým prejavom typickým pre daný gén
• kosegregácia génového variantu s ochorením a v súlade s typom dedičnosti, pričom sa sleduje prítomnosť variantu ako u zdravých, tak aj u postihnutých geneticky príbuzných osôb
• in vitro štúdie sledujúce dopad variantu na funkciu proteínu (viď nižšie)

In vitro funkčné štúdie

V prípade, že pomocou dostupných informácií nie je možné určiť, či je daný variant patogénny, je potrebné vykonať in vitro funkčné štúdie. Typ funkčnej štúdie závisí od skúmaného proteínu, v prípade monogénového diabetu sú to najmä transkripčné faktory, enzýmy alebo podjednotky od ATP závislého draslíkového kanála. V prípade transkripčného faktora HNF1α sa funkčné štúdie zameriavajú na sledovanie jeho bunkovej lokalizácie, schopnosti dimerizovať a viazať sa s DNA, a taktiež sa stanovuje jeho transaktivačná aktivita [28–30]. Výsledky funkčných štúdií prinášajú odpoveď na otázku, akým spôsobom ovplyvňuje HNF1A variant funkciu proteínu, a teda či je skutočne zodpovedný za manifestovanie ochorenia u pacienta. Pre jednoznačný dôkaz poškodenia funkcie mutovaného proteínu sú potrebné výsledky z minimálne dvoch rôznych typov funkčných štúdií.

Funkčné štúdie enzýmu glukokinázy sa zameriavajú hlavne na stanovenie kinetiky a tepelnej stability enzýmu [19]. Variant v géne pre glukokinázu môže mať, okrem kinetiky a stability, aj iný mechanizmus, akým dôjde ku ovplyvneniu aktivity glukokinázy. Variant môže napríklad ovplyvniť viazanie iných regulačných molekúl ako glukokinázového regulačného proteínu [31] alebo bifunkčného enzýmu PFK-2/FBPase-2, prípadne nejakého iného zatiaľ neznámeho endogénneho alosterického aktivátora.

Patogenita podjednotiek génov KCNJ11 a ABCC8 kódujúcich od ATP závislého draslíkového kanála sa študuje pomocou elektrofyziologických metód, ktoré umožňujú určiť, či variant je neutrálny alebo spôsobí uzavretie alebo otvorenie kanálu. Práve poznanie týchto skutočností má významný vplyv na terapiu monogénového diabetu [32].

Manažment ľudí s monogénovým diabetom

Identifikácia kauzálnej mutácie spôsobujúcej MODY umožňuje voľbu liečby šitej na mieru pacienta. V prípade väčšiny mutácií génov KCNJ11 a ABCC8 spôsobujúcich neonatálny diabetes sú to deriváty sulfonyl­urey vo vysokých dávkach (0,1–1,0 mg/kg/deň pre glibenkamid), pričom preferujeme neselektívne preparáty (glibenklamid) pre podporu poškodených draslíkových kanálov aj mimo B-buniek pankreasu. V prípade HNF1A-MODY a HNF4A-MODY sú liekom voľby tiež deriváty sulfonylurey, ale v nízkych dávkach [33]. Pre HNF1A-MODY liečbu sú v súčasnosti testované aj iné terapeutické postupy. Naproti tomu GCK-MODY zvyčajne medikamentóznu liečbu nevyžaduje s výnimkou gravidných žien v 3. trimestri gravidity [34]; ak plod rastie rýchlejšie a je riziko makrozómie a diabetickej feto­patie, indikuje sa liečba inzulínom) [35]. Neonatálny diabetes, ako aj HNF1A-MODY a HNF4A-MODY, majú pomerne vysoké riziko vzniku mikrovaskulárnych komplikácií, preto dobrá kompenzácia diabetu je nevyhnutnosťou. GCK-MODY má nízke riziko mikrovaskulárnych komplikácií a nevyžaduje ani ich skríning.

Záver

Monogénové typy diabetu majú svoje diagnostické aj terapeutické špecifiká. Ich DNA-diagnostika je v SR dostupná už viac ako 15 rokov. Napriek tomuto sú tieto ochorenia stále výrazne poddiagnostikované. Kľúčom k zlepšeniu tejto situácie je myslieť na tieto ochorenia aj v každodennej diabetologickej praxi.

Táto práca bola podporená projektom VEGA1/0211/18, APVV-187–12.

RNDr. Daniela Gašperíková, DrSc.

daniela.gasperikova@savba.sk

www.sav.sk

Doručené do redakcie 23. 4. 2019

Prijaté po recenzii 8. 5. 2019