Sérové koncentrace S100P proteinu u pacientů s kolorektálním karcinomem

Súhrn

Úvod:
Kolorektální karcinom (CRC – colorectal cancer) je třetí nejčastější nádorové onemocnění celosvětově a v ČR. S100P protein hraje významnou roli v kancerogenezi CRC a v jeho metastatické progresi. Cílem prospektivní studie bylo posoudit asociaci sérové koncentrace S100P s CRC.

Metodika:
Studie zahrnovala 79 jedinců – 36 kontrol (normální pankoloskopický nález; bez anamnézy kolorektální neoplazie) a 43 pacientů s CRC. Skupina s CRC byla rozdělena do jednotlivých podskupin: 1. dle lokalizace nádoru – 13 subjektů s karcinomem pravého tračníku (CRC-R skupina) a 30 osob s karcinomem levého tračníku (CRC-L skupina); 2. dle klinického stadia onemocnění – 9 pacientů ve stadiu I, 7 ve stadiu II, 13 ve stadiu III a 13 ve stadiu IV; 3. dle gradingu nádoru – 5 nemocných s dobře diferencovaným karcinomem (G1), 24 se středně diferencovaným karcinomem (G2) a 11 s nízce diferencovaným karcinomem (G3). Sérové koncentrace S100P proteinu byly hodnoceny ELISA metodou ze vzorků periferní žilní krve.

Výsledky:
Sérové koncentrace S100P byly signifikantně vyšší v CRC skupině (medián 1 251, interkvartilové rozpětí – IQR 731–1 749 ng/l) ve srovnání s kontrolní skupinou (medián 765, IQR 545–1 158 ng/l); p = 0,012. Ve srovnání s kontrolní skupinou byly sérové koncentrace S100P významně vyšší v CRC-L skupině (medián 1 426, IQR 739–1 925 ng/l); p = 0,005, u pacientů v klinickém stadiu IV (medián 1 622, IQR 778–2 154 ng/l); p = 0,008, a u pacientů se středně diferencovaným karcinomem (medián 1 318, IQR 853–1 879 ng/l); p = 0,005. Nebyl prokázán signifikantní rozdíl u skupiny CRC-R ve srovnání s kontrolami ani ve srovnání s CRC-L skupinou; p > 0,05.

Závěr:
Studie potvrdila asociaci sérové koncentrace S100P proteinu s CRC. Významně vyšší koncentrace S100P byly potvrzeny u pacientů v klinickém stadiu IV a pacientů s levostranným CRC.

Klíčová slova:
S100P protein – biomarker – kolorektální karcinom

Úvod

Kolorektální karcinom (CRC – colorectal cancer) představuje v celosvětovém měřítku třetí nejčastější nádorové onemocnění u mužů (po karcinomu plic a prostaty) a druhé nejčastější nádorové onemocnění u žen (po karcinomu prsu) [1]. V ČR byla v roce 2014 roční incidence 79 na 100 000 (přibližně 8 000 nově diagnostikovaných pacientů ročně; 95 na 100 000 u mužů, 64 na 100 000 u žen) a mortalita 38 na 100 000 (45 na 100 000 u mužů, 31 na 100 000 u žen) [2]. Dle dostupných statistických dat má incidence CRC trvale vzestupný charakter, zatímco mortalita onemocnění v posledních letech klesá [2,3]. I přes významný pokrok v diagnostice CRC a efektivitě screeningového programu v ČR v populaci s nově diagnostikovaným CRC má téměř 50 % pacientů pokročilé klinické stadium onemocnění (34 na 100 000 v klinickém stadiu III + IV) [4].

S100P protein patří do rodiny S100 proteinů, která je tvořena více než 20 malými bílkovinami s nízkou molekulární hmotností (9–13 kD). Název skupiny je odvozen od rozpustnosti S100 proteinů ve 100% roztoku síranu amonného [5]. S100 proteiny se vyskytují výhradně u obratlovců a jejich struktura je vysoce konzervativní. Jsou schopny vazby s ionty vápníku, hořčíku a zinku, což vede ke strukturálním změnám uvnitř S100 proteinu, a umožní tak jeho interakci s cílovými bílkovinami [6]. S100P protein byl poprvé izolován v roce 1992 z buněk lidské placenty [7,8]. Protein S100P se fyziologicky vyskytuje ve vysoké koncentraci v plicích, srdci, slezině, příčně pruhovaných svalech a v leukocytech. V nižších koncentracích byl také prokázán v jaterní tkáni, thymu, prostatě a ovariu [9]. Parkkila et al ve své práci demonstrovali zvýšenou expresi S100P proteinu v epiteliálních buňkách všech etáží sliznice tlustého střeva, přičemž klesající imunohistochemická pozitivita byla přítomna směrem k bázi Lieberkühnových krypt [10].

Funkce S100P v mediaci buněčné proliferace a migrace je zprostředkována zejména vazbou s ezrinem a RAGE (receptor for advanced glycation endproducts). Ezrin/radixin/moezin je transmembránový protein, který je schopen interakce mezi aktinovými filamenty cytoplazmy a plazmatickou membránou, a tím ovlivňuje migrační schopnost buňky [11,12]. V přítomnosti iontů vápníku vede vazba intracelulárně lokalizovaných homodimérů S100P k aktivaci ezrinu. Na druhé straně vazba s RAGE je zprostředkována extracelulární frakcí S100P a vede k aktivaci ERK1/2 a MAPK signální dráhy a zvýšené expresi onkogenní miRNA-21 [13–15]. V regulaci exprese S100P u CRC se uplatňuje prostaglandin E2 [16] a Trx-1 (thioredoxin-1) [17]. Trx-1 je cytoplazmatický protein s nízkou molekulární hmotností, jehož zvýšená exprese je asociována s inhibicí apoptózy, produkcí volných kyslíkových radikálů uvnitř buňky a proliferací nádorových buněk. Lin et al [17] prokázali, že Trx-1 zvyšuje expresi S100P genu v buňkách CRC. Zvýšená tkáňová exprese S100P u CRC je doložena v mnoha pracích [16,18–24].

Při plánování studie jsme vycházeli z práce Wang et al, kteří jako první prokázali významně vyšší koncentrace S100P proteinu v séru pacientů s CRC [25].

Cílem naší práce bylo posouzení sérové koncentrace S100P proteinu u pacientů s CRC a její asociace s pokročilostí nádorového onemocnění a stupněm diferenciace tumoru.

Metodika

Charakteristika souborů

Studie zahrnovala celkem 79 jedinců, kteří byli do studie zařazeni v letech 2013–2016. Celkem bylo zařazeno 43 pacientů s CRC (CRC skupina; 20 mužů a 23 žen, věk 46–86 let, průměr 67 ± 11) a 36 kontrol – osoby s normálním pankoloskopickým nálezem a negativní osobní anamnézou kolorektální neoplazie (14 mužů, 22 žen, věk 23–80 let, průměr 55 ± 14). CRC skupina zahrnovala 30 % (13 z 43) pacientů s CRC v pravé části tračníku (CRC-R skupina) a 70 % (30 z 43) pacientů s CRC levého tračníku (CRC-L skupina). Za hranici mezi pravým a levým tračníkem byla považovaná lienální flexura. Nemocní CRC skupiny byli klasifikováni dle TNM klasifikace, NCCN guidelines version 2.2017 [26] a stupně diferenciace (gradingu) tumoru. Stupeň diferenciace byl hodnocen u 74 % (32 z 43) pacientů z chirurgického resekátu, 19 % (8 z 43) nemocných nebylo indikováno k radikální chirurgické resekci a stupeň diferenciace byl u těchto pacientů hodnocen z odebraných bioptických vzorků. U 7 % (3 z 43) pacientů nebyl stupeň diferenciace karcinomu z odebraných bioptických vzorků primárně hodnotitelný – u dvou pacientů došlo ke kompletní regresi karcinomu po neoadjuvantní léčbě (v resekčním materiálu karcinom nebyl přítomný), jeden pacient je v době přípravy publikace před plánovaným resekčním výkonem. Tito tři pacienti nebyli do jednotlivých subanalýz CRC skupiny dle gradingu onemocnění zahrnuti. Při rozdělení CRC skupiny dle gradingu přítomného karcinomu jednotlivé podskupiny zahrnovaly 11 % (5 z 43) nemocných s dobře diferencovaným karcinomem (G1), 56 % (24 z 43) se středně diferencovaným karcinomem (G2) a 26 % (11 z 43) s nízce diferencovaným karcinomem (G3). U 7 % (3 z 43) nebyl stupeň diferenciace hodnotitelný (viz výše). Při rozdělní CRC skupiny dle stagingu onemocnění jednotlivé podskupiny zahrnovaly 20 % (9 z 43) nemocných v klinickém stadiu I, 16 % (7 z 43) v klinickém stadiu II, 30 % (13 z 43) v klinickém stadiu III a 30 % (13 z 43) v klinickém stadiu IV. Základní popisná statistika je shrnuta v tab. 1.

Odběr vzorků a měření sérové koncentrace S100P

Ke stanovení sérové koncentrace S100P proteinu bylo u každého jedince odebráno 6 ml srážlivé krve. Vzorky byly odebrány při standardním zavádění periferní žilní kanyly před plánovanou diagnostickou koloskopií na endoskopické jednotce II. interní gastroenterologické kliniky LF UK a FN Hradec Králové a následně transportovány na Ústav klinické imunologie a alergologie LF UK a FN Hradec Králové. Zde byly vzorky centrifugovány a získaná séra byla uchována při –30 °C do doby stanovení S100P proteinu. Měření sérových koncentrací S100P bylo provedeno ELISA metodou za použití souprav CircuLex S100P ELISA Kit CY-8060 (CycLex Co., Nagano, Japonsko).

Všechny osoby zařazené do studie podepsaly informovaný souhlas schválený Etickou komisí Univerzity Karlovy v Praze, Lékařské fakulty v Hradci Králové. Realizace studie a zpracování získaných dat bylo provedeno v souladu s Metodickým návodem Ministerstva zdravotnictví (MZ) ČR (k zabezpečení a ochraně údajů v informačních systémech provozovaných ve zdravotnických zařízeních, uveřejněný ve Věstníku MZ ČR, částka 6/1994 s odvoláním na ustanovení § 55 odstavec 2 písmeno d) zákona 230/1996 Sb., o péči o zdraví lidu v platném znění).

Statistické zpracování

Ke statistickému hodnocení byly použity metody popisné statistiky a neparametrický Mann-Whitneyův test (nebyla potvrzená normalita naměřených dat). Hodnocení proběhlo na statistickém softwaru STATISTICA, ver.13, Tulsa OK, USA.

Výsledky

Sérové koncentrace S100P proteinu byly statisticky významně vyšší v CRC skupině (medián 1 251, interkvartilové rozpětí – IQR 731–1 749 ng/l) ve srovnání s kontrolní skupinou (medián 765, IQR 545–1 158 ng/l); p = 0,012. Ve srovnání s kontrolní skupinou byly sérové koncentrace S100P významně vyšší v CRC-L skupině (medián 1 426, IQR 739–1 925 ng/l); p = 0,005. Sérové koncentrace S100P skupiny CRC-R (medián 1 113, IQR 469–1 406 ng/l) nevykazovaly statisticky významné rozdíly ve srovnání s kontrolní skupinou; p = 0,396. Nebyl prokázán statisticky významný rozdíl při srovnání sérových koncentrací S100P mezi oběma testovanými podskupinami (CRC-L a CRC-R); p = 0,135 (graf 1).

Při rozdělení CRC skupiny dle stagingu onemocnění byly sérové koncentrace S100P proteinu signifikantně vyšší u pacientů s CRC v klinickém stadiu IV (medián 1 622, IQR 778–2 154 ng/l) ve srovnání s kontrolní skupinou (medián 765, IQR 545–1 158 ng/l); p = 0,008. Podskupiny s nižším klinickým stadiem nevykazovaly signifikantní rozdíly ve srovnání s kontrolní skupinou: p = 0,086 pro klinické stadium I (medián 1 391, IQR 644–2 508 ng/l); p = 0,565 pro klinické stadium II (medián 868, IQR 650–1 544 ng/l) a p = 0,282 pro klinické stadium III (medián 1 112, IQR 680–1 470 ng/l) (graf 2).

V CRC skupině byly sérové koncentrace S100P signifikantně vyšší ve srovnání s kontrolami (medián 765, IQR 545–1 158 ng/l) u pacientů se středně diferencovaným karcinomem (G2, medián 1 318, IQR 853–1 879 ng/l); p = 0,005. Nebyl prokázán statisticky významný rozdíl ve skupině G1 (dobře diferencovaný karcinom, medián 812, IQR 582–1 570 ng/l); p = 0,678, a ve skupině G3 (nízce diferencovaný karcinom, medián 1 113, IQR 581–2 260 ng/l); p = 0,253, ve srovnání se skupinou kontrolní (graf 3). Byl pozorován statisticky významný rozdíl ve skupině G2 + G3 (medián 1 251, IQR 742–1 883 ng/l) ve srovnání s kontrolní skupinou (medián 765, IQR 545–1 158 ng/l); p = 0,007.

Diskuze

Naše studie potvrdila asociaci sérových koncentrací S100P s CRC. Prokázali jsme významně vyšší sérové koncentrace S100P u pacientů v klinickém stadiu TNM IV [26]. Prokázali jsme významně vyšší sérové koncentrace S100P u pacientů se středně diferencovaným karcinomem. I přesto, že jsme u nízce diferencovaných karcinomů signifikantní rozdíly neprokázali, při srovnání skupin G2 + G3 s kontrolní skupinou byl rozdíl ve srovnání s kontrolní skupinou statisticky významný. Důvodem může být malá velikost souboru G3 skupiny. Předpokládáme proto, že při větším počtu měření by rozdíl mohl být prokazatelný.

Nepotvrdili jsme závěry dřívějších prací, které dokumentují vyšší tkáňovou expresi S100P u nádorů v pravém tračníku [18,20]. V našem souboru byly sérové koncentrace S100P vyšší u pacientů v CRC-L skupině. Vysvětlením může být především skutečnost, že CRC-L skupina byla zastoupena ve 37 % (11 z 30) pacienty v TNM stadiu IV. Ve srovnání se skupinou s levostranným CRC obsahovala skupina CRC-P pouze 3 jedince (3 z 13) mající CRC ve IV. stadiu nemoci. Dalším vysvětlením může být nemožnost přesně korelovat sérové koncentrace S100P proteinu s tkáňovou expresí S100P proteinu. Na tuto otázku bude nutné odpovědět studií zabývající se expresí S100P proteinu ve tkáni karcinomu nemocného, u kterého by byla současně stanovena hodnota S100P v séru.

Role S100P proteinu v kancerogenezi a nádorové progresi je nepochybná a v literatuře je dobře dokumentovaná [19,25,27–34]. Vzhledem k tomu, že časná stadia CRC probíhají asymptomaticky, je v současné době snahou kromě optimalizace screeningových metod identifikovat takový biomarker, který by umožnil: 1. časnou detekci nádoru, 2. predikovat chování nádoru, 3. lépe určit prognózu onemocnění, 4. stratifikovat odpověď karcinomu na podanou protinádorovou terapii a 5. pomoci časně detekovat lokální recidivu nebo metastatický proces. Vyšší exprese S100P ve tkáni CRC a v séru pacientů s CRC je asociována s horší prognózou a kratším 5letým přežíváním [23,25]. Výsledky naší studie ukazují, že sérový S100P protein by mohl být vhodným biomarkerem u pacientů s CRC.

Závěr

Studie potvrdila asociaci sérových koncentrací S100P proteinu s CRC. Sérová koncentrace S100P byla významně vyšší u CRC v klinickém stadiu IV a u karcinomů se středním stupněm diferenciace.

Studie vznikla v rámci řešení projektu PROGRES Q40-15 (z Univerzity Karlovy) a s Institucionální podporou výzkumu SVV-2016-260286 Lékařské Fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Doručeno: 7. 6. 2017

Přijato: 31. 7. 2017

MUDr. Darina Kohoutová, Ph.D.

II. interní gastroenterologická klinika

LF UK a FN Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

darina.kohoutova@fnhk.cz