Suplementácia vitamínu D₃ a bunková homeostáza vápnika u pacientov pri chronickej chorobe obličiek

Súhrn

V práci sumarizujeme výsledky našich štúdií zameraných na objasnenie patofyziologických mechanizmov zmenenej homeostázy vápnika v neexcitabilných bunkách pacientov v skorých štádiách chronickej choroby obličiek (CKD) a zistenie vplyvu suplementácie vitamínu D₃ na tieto mechanizmy. Základné mechanizmy vstupu vápnika, ako aj jeho odčerpávania z bunky sú už v skorých štádiách CKD zmenené. Tieto poruchy spôsobujú zvýšenie koncentrácie voľného cytosolového vápnika ([Ca²⁺]_i), čo môže viesť k zmene mnohých bunkových procesov a expresii rôznych signálnych molekúl. Suplementácia vitamínu D je štandardný postup korekcie nedostatku/deficitu vitamínu D u pacientov v skorých štádiách CKD, pričom pleiotropné účinky vitamínu D sa môžu podieľať na modulácii bunkovej homeostázy vápnika. Suplementácia vitamínu D₃ mala za následok zníženie [Ca²⁺]_i ovplyvnením niektorých transportných systémov vstupu katiónov vápnika do bunky a jeho odčerpávania z bunky. Normalizácia [Ca²⁺]_i môže mať priaznivý účinok na intracelulárnu signalizáciu, a tým pozitívne ovplyvňovať funkčnosť buniek, tkanív, resp. orgánov.

Kľúčové slová:
bunková homeostáza vápnika – chronická choroba obličiek – intracelulárny vápnik – vitamín D

Úvod

Nedostatok vitamínu D sa často vyskytuje v bežnej populácii aj u pacientov s chronickou chorobou obličiek (CKD) a je významným rizikovým faktorom pre rozvoj rôznych chronických ochorení. U pacientov s CKD sa odporúča podľa súčasných smerníc korigovať poruchu suplementáciou natívneho vitamínu D (cholekalciferol, ergokalciferol). U pacientov s progresívne stúpajúcou koncentráciou parathormónu sa odporúča liečba kalcitriolom alebo analógmi vitamínu D [1]. Dôležitou úlo­hou endokrinného systému vitamínu D je regulácia mine­rálového a kostného metabolizmu a udržiavanie homeostázy vápnika a fosforu v organizme [2,3]. Okrem týchto klasických účinkov má vitamín D aj nekalciotropné účinky, ktoré sú sprostredkované extrarenálnou syntézou 1,25(OH)₂D₃ v mnohých tkanivách a orgánoch, v ktorých pôsobí autokrinne/parakrinne. Väzbou na receptor vitamínu D (VDR) zabezpečuje „neklasické“ účinky vitamínu D, ako sú vplyv na proliferáciu a diferenciáciu buniek, imunitné funkcie atď. [4]. V obličkách tieto účinky vedú k zmierneniu poškodenia potlačením fibrózy, zápalu a apoptózy [5,6].

Chronická choroba obličiek je spojená s významným zvýšením koncentrácie voľného cytosolového vápnika ([Ca²⁺]_i), ktoré je pre bunky toxické a môže byť zodpovedné za multiorgánové dysfunkcie [7,8]. Vápnikové katióny (Ca²⁺) majú dôležitú úlohu v bunkovej signalizácii mnohých fyziologických procesov. V prenose subcelulárnych signálov je dôležitá distribúcia vápnikových/katiónových kanálov, Ca²⁺-ATPáz a výmenných systémov, ich vzájomná komunikácia a koordinácia. Výsledkom je prísne udržiavaná a regulovaná [Ca²⁺]_i. Prechodné zvýšenie [Ca²⁺]_i je nevyhnutným signálom pre fyziologickú funkčnosť buniek a jej odpovedí na vonkajšie podnety, pretrvávajúce zvýšenie však môže spôsobiť ireverzibilné poškodenie funkcií buniek prípadne ich smrť. Homeo­stáza Ca²⁺ je v bunkách udržiavaná mechanizmami, ktoré regulujú vstup Ca²⁺ z extracelulárneho priestoru do bunky vápnikovými/katiónovými kanálmi plazmatickej membrány. Výstup Ca²⁺ z bunky sa uskutočňuje aktívnym prenosom Ca²⁺-ATPázami a sodíkovo-vápnikovými výmennými systémami. Vápnikové katióny sa tiež môžu uvoľňovať z intracelulárnych kompartmentov alebo sa do nich transportovať (schéma) [9,10].

K zvýšeniu [Ca²⁺]_i ako aj koncentrácie Ca²⁺ v intracelulárnych kompartmentoch dochádza už v skorých štádiách CKD. Tiež mechanizmy udržiavania bunkovej vápnikovej homeostázy sú u pacientov v skorých štádiách CKD v porovnaní so zdravými subjektmi zmenené [11–14]. Je len málo informácií o regulačných mechanizmoch vápnikovej homeostázy na bunkovej úrovni a možnostiach ich ovplyvnenia v počiatočných štádiách tejto choroby. Preto sme sa v našich nedávnych štúdiách zamerali na objasnenie týchto mechanizmov, ako aj na zistenie vplyvu suplementácie vitamínu D₃ na stav intracelulárnej koncentrácie vápnika a základné regulačné mechanizmy udržiavania bunkovej homeostázy vápnika u pacientov s CKD.

Vitamín D₃ a intracelulárna koncentrácia vápnika

Intracelulárna koncentrácia vápnika zahŕňa koncentráciu voľného cytosolového vápnika ([Ca²⁺]_i), zodpovedného za prenos signálu a koncentráciu vápnika v intracelulárnych kompartmentoch. V intracelularných kompartmentoch je uchovávaný prebytočný vápnik, ktorý je za určitých podmienok uvoľňovaný do cytosolu, čím sa zúčastňuje prenosu signálov v bunke. Pre niektoré fyziologické procesy môžu mať práve tieto zásoby vápnika rozhodujúci význam [10,15,16]. Intracelulárne zásoby Ca²⁺ sú viazané na proteíny, ich prevažná časť sa nachádza v endoplazmatickom/sarkoplazmatickom retikule, menej v mitochondriách, vezikulách a jadre. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že už v počiatočnom štádiu CKD je významne zvýšená [Ca²⁺]_i ako aj koncentrácia Ca²⁺ v intracelulárnych kompartmentoch, čo poukazuje na zmeny vo vápnikovej signalizácii buniek a zmenené niektoré regulačné mechanizmy udržiavania bunkovej Ca²⁺ homeostázy [13]. Po 6-mesačnej suplementácii vitamínu D₃ poklesla [Ca²⁺]_i na hodnoty porovnateľné s hodnotami zdravých jedincov (graf 1), intracelulárne zásoby Ca²⁺ sa neznížili (graf 2). Koncentrácia 25(OH)D₃ u pacientov s CKD bola za bazálnych podmienok nízka (18 ± 2 ng/ml), štatisticky významne sa však zvýšila po 6-mesačnej suplementácii vitamínu D₃ (36 ± 9 ng/ml, p < 0,001), pričom absolútne zmeny [Ca²⁺]_i negatívne korelovali s absolútnou zmenou koncentrácie 25(OH)D₃ (graf 3). Suplementácia vitamínu D₃ upravuje [Ca²⁺]_i u pacientov v skorých štádiách CKD [17].

Vstup katiónov vápnika do bunky – vitamín D₃ a vápnikové/katiónové kanály

CRAC kanály

Vápnik vstupuje do buniek rôznymi typmi vápnikových/katiónových kanálov. V neexcitabilných bunkách ako sú periférne mononukleárne bunky (peripheral blood mononuclear cell – PBMC), je charakteristický vstup Ca²⁺ prostredníctvom vápnikových kanálov nezávislých od napätia, ktoré sú aktivované uvoľnením Ca²⁺ z endoplazmatického retikula, CRAC kanálov (calcium release activated calcium). Vstup Ca²⁺ CRAC kanálom aktivuje príslušné transkripčné faktory, čím reguluje expresiu génov pre cytokíny zodpovedné za imunitnú odpoveď [18,19]. Dysregulácia Ca²⁺ spôsobená zmenou funkčnosti alebo expresie CRAC kanálov bola zistená pri neurodegeneratívnych ochoreniach, u imunodeficitných pacientov, pri akútnej pankreatitíde, polycystickej chorobe obličiek a srdcovej hypertrofii [18–23]. U pacientov v skorých štádiách CKD sme zaznamenali významne zvýšený vstup Ca²⁺ prostredníctvom CRAC kanálov v porovnaní so zdravými jedincami [13]. Po suplementácii vitamínu D₃ sa vstup Ca²⁺ cez tieto kanály znížil (graf 4) [17]. Vitamín D₃ teda upravuje reguláciu Ca²⁺, a tým ovplyvňuje ďalšie regulačné mechanizmy v neexcitabilných bunkách.

L-typ vápnikových kanálov

Neexcitabilné bunky exprimujú Ca²⁺ kanály, ktoré majú rovnaké štruktúrne vlastnosti ako L-typ Ca²⁺ kanálov závislých od napätia, ktoré sa nachádzajú v excitabilných bunkách. Ich prítomnosť v plazmatickej membráne kľudových lymfocytov bola potvrdená až v roku 2003 [24]. Na rozdiel od kanálov excitabilných buniek nie sú senzitívne na zmenu membránového potenciálu. Nedávne štúdie poukazujú na účasť L-typu Ca²⁺ kanálov pri vstupe Ca²⁺ v priebehu aktivácie a proliferácie T-lymfocytov. Mechanizmus ich stimulácie však stále nie je objasnený [25,26]. V súlade s doterajšími poznatkami sme sledovali vstup Ca²⁺ cez tieto kanály. V PBMC pacientov s CKD sa vstup Ca²⁺ nezmenil, nedochádzalo k jeho zvýšeniu v porovnaní s bunkami zdravých jedincov [13]. Stimulácia buniek aktívnym metabolitom vitamínu D [1,25(OH)₂D₃] nevyvolávala zmeny vo vstupe vápnika Ca²⁺ cez L-typ Ca²⁺ kanálov [27]. Vzhľadom na tento poznatok nebol sledovaný mechanizmus vstupu Ca²⁺ cez L-typ Ca²⁺ kanálov po suplementácii vitamínu D₃.

P2X₇ receptory

V súčasnej dobe je purinergná signalizácia považovaná za jeden z rozhodujúcich komponentov podieľajúcich sa na rôznych typoch chorôb. Naviazanie extracelulárnych purínov na receptory plazmatickej membrány vyvoláva intracelulárnu signalizačnú kaskádu, ktorej výsledkom je bunková odpoveď. V závislosti od typu buniek, purínové receptory sprostredkovávajú veľké množstvo biologických účinkov, ako sú exokrinná a endokrinná sekrécia, zápal, imunitné odpovede, agregácia krvných doštičiek, modulácia srdcových funkcií, kontrakcia hladkých svalov, neurotransmisia, bolesť [28–30]. Na aktivácii PBMC sa podieľajú purínové receptory patriace do skupiny P2X. Do dnešného dňa bolo identifikovaných 7 podtypov P2X receptorov. P2X₁-P2X₆ sú exprimované prevažne v neurónoch a v excitabilných bunkách. P2X₇ receptory sa nachádzajú hlavne v bunkách hemopoetického systému, kde sa podieľajú na imunitných odpovediach, bunkovej proliferácii a bunkovej smrti, tvorbe kostí a ich resorpcii. P2X₇ receptory pozostávajú z katiónového kanálu a cyto­lytického póru. Po aktivácii P2X₇ receptorov dochádza za fyziologických podmienok k otvoreniu jeho katiónového kanálu a následne aj k otvoreniu neselektívneho cytolytického póru, ktorý v závislosti od typu buniek prepúšťa molekuly s molekulovou hmotnosťou do 900 Da [28,31]. V súčasnosti sa intenzívne študuje vzťah P2X₇ receptorov k mnohým typom ochorení, ako reumatoidná artritída, chronická obštrukčná choroba pľúc, neurologické choroby, hypertenzia, chronická leukémia z B-lymfocytov [32–34]. Tiež bola potvrdená kľúčová úloha P2X receptorov v regulácii fyziologických a patofyziologických procesov obličiek [35]. V našich štúdiách sme ukázali, že vstup Ca²⁺ cez P2X₇ kanály je zvýšený a priepustnosť P2X₇ pórov vzrástla. Okrem toho, funkčnosť P2X₇ kanálov aj pórov bola zmenená [12]. Aktívny metabolit vitamínu D [1,25(OH)₂D₃] v PBMC zdravých jedincov inhiboval vstup Ca²⁺ prostredníctvom P2X₇ kanálov a znižoval priepustnosť plazmatickej membrány P2X₇ pórmi [27]. Aj z tohto dôvodu sme sledovali vplyv suplementácie vitamínu D₃ na funkčnosť P2X₇ receptorov v PBMC pacientov s CKD. Suplementácia znižovala Ca²⁺ influx cez P2X₇ kanály a ovplyvňovala ich funkčnosť (graf 5A, 5B), nemala však vplyv na priepustnosť P2X₇ pórov [17]. Rozdielne účinky suplementácie na P2X₇ kanály a póry u týchto pacientov môžu byť spôsobené ich rozdielnou senzitivitou. Agonisti a antagonisti P2X₇ receptora môžu mať rozdielny vplyv na funkciu P2X₇ kanálov a pórov, ich vplyv môže byť zmenený aj pri rôznych patologických stavoch [36]. Nielen funkčnosť, ale aj expresia P2X₇ receptorov môže byť zmenená pri niektorých patologických stavoch [29,37–39]. V našej nedávnej štúdii sme zistili 1,5-násobné zvýšenie expresie P2X₇ receptorov plazmatickej membrány v PBMC pacientov s CKD v porovnaní s bunkami zdravých jedincov [12]. Suplementácia vitamínu D₃ ovplyvnila expresiu P2X₇ receptorov. Expresia sa po suplementácii znížila o 45 % (graf 5C) [17].

Výstup katiónov vápnika z bunky – vitamín D₃ a Ca²⁺-ATPázy plazmatickej membrány

Plazmatické membrány majú 2 hlavné systémy, ktorými sa Ca²⁺ odčerpáva z intracelulárneho priestoru do extracelulárneho proti koncentračnému gradientu: Na⁺/Ca²⁺ výmenný systém, ktorý je aktívny najmä v excitabilných bunkách a Ca²⁺-ATPázy plazmatickej membrány (PMCA) v neexcitabilných bunkách. Aktivita PMCA je rozhodujúca pri udržiavaní nízkej [Ca²⁺]_i. Znížením jej aktivity dochádza k nahromadeniu Ca²⁺ v bunke a následne k ovplyvneniu ďalších vnútrobunkových procesov. Už v skorých štádiách CKD dochádza v PBMC pacientov k zníženiu aktivity PMCA o 34 % a u pacientov s terminálnym zlyhaním obličiek bol zaznamenaný pokles aktivity až o 50 % [40,41]. Tento pokles aktivity PMCA môže byť spôsobený viacerými faktormi, ako je deficit kalmodulínu, aktivita niektorých endogénnych regulátorov proteínov, inhibícia mitochondriálneho alebo glykolytického metabolizmu [42]. Vstup Ca²⁺ CRAC kanálmi je tiež dôležitým regulátorom aktivity PMCA a zmenená komunikácia medzi nimi, môže byť ďalšou príčinou jej zníženej aktivity [43]. Aktivitu aj expresiu PMCA v niektorých epitelových bunkách a osteoblastoch zvyšuje 1,25(OH)₂D₃ [44–46]. V experimentálnych štúdiách boli sledované priame alebo nepriame účinky 1,25(OH)₂D₃ a 24,25(OH)₂D₃ na aktivitu a expresiu PMCA, avšak účinky 25(OH)D₃ sledované neboli. V našej štúdii sa po suplementácii vitamínu D₃ aktivita PMCA u CKD pacientov nezvýšila (graf 6). Zvýšila sa však koncentrácia proteínov plazmatickej membrány o 47 %, preto nemôžeme vylúčiť možnosť zvýšenej expresie PMCA [40].

Záver

Udržiavanie bunkovej homeostázy vápnika je pre fyziologické fungovanie bunky nevyhnutné. Zmeny v regulačných mechanizmoch vápnikovej homeostázy bunky sa prejavia zmenami v odpovediach bunky na vonkajšie podnety, a tým aj poruchou funkčnosti tkanív, resp. orgánov. U pacientov v skorých štádiách CKD viedla suplementácia vitamínu D₃ k zníženiu koncentrácie intracelulárneho vápnika ovplyvnením CRAC a P2X₇ kanálov a zníženiu expresie P2X₇ receptorov plazmatickej membrány. Benefičný účinok vitamínu D₃ je v normalizácii [Ca²⁺]_i, ktorá môže mať priaznivý účinok na intracelulárnu signalizáciu, a tým pozitívne ovplyvňovať funkčnosť buniek. Pochopenie regulačných mechanizmov bunkovej homeostázy vápnika a ich selektívne ovplyvnenie pri renálnych ale aj iných ochoreniach môže v budúcnosti viesť k cielenejšej terapii.

RNDr. Ingrid Lajdová, PhD.

ingrid.lajdova@szu.sk

Ústav farmakológie, klinickej a experimentálnej farmakológie LF SZU,

Bratislava,

Slovenská republika

www.szu.sk

Doručeno do redakce 22. 8. 2016

Přijato po recenzi 3. 10. 2016