miRNA jako nový ukazatel u diabetes mellitus a u rozvoje karcinomu pankreatu

Súhrn

Karcinom pankreatu je onemocnění s rostoucí incidencí a vysokou (a téměř neměnnou) letalitou, která je dána především jeho pozdní diagnostikou. Rizikovými faktory nádorové transformace jsou zejména chronická pankreatitida, diabetes mellitus, ale také obezita a kouření. Nalezení vhodných časných markerů se tak stává stěžejním bodem výzkumu v této oblasti. Dle současných poznatků by těmito markery mohly být microRNA, krátké jednovláknové molekuly RNA fungující jako regulátory translace. Článek je přehledem současných poznatků o microRNA u diabetes mellitus a karcinomu pankreatu.

Klíčová slova:
diabetes mellitus – miRNA – karcinom pankreatu – chronická pankreatitida

BIOSYNTÉZA A FUNKCE miRNA

U různých nemocí a jejich komplikací dosud používáme biochemické ukazatele, které více či méně přesně charakterizují aktivitu či závažnost procesu, ale jsou velmi často nespecifické. Poznání genetické podmíněnosti, a tedy účasti určitých genů na vývoji patologického procesu vedlo k využívání polymorfismů genů. Cílem časné diagnostiky a výhledově terapie i prevence je využívat časné a specifické markery. Novou oblastí jsou v tomto směru microRNA(miRNA). miRNA jsou krátké, jednovláknové molekuly RNA o velikosti 21–23 nukleotidů, účastnící se regulací expresí genů na posttranskripční úrovni (1). Touto regulací tak ovlivňují mnoho fyziologických i patofyziologických pochodů, při nichž zasahují do dráhy angiogeneze, apoptózy i kancerogeneze. Odlišné exprese miRNA byly popsány u diabetes mellitus, akutního infarktu myokardu, neurologických a dalších onemocnění. Šíře působení v jednotlivých orgánových systémech naznačuje, že se jedná o velmi významný regulační mechanismus v celém organismu.

Termín miRNA byl použit poprvé v roce 2001 (2), přestože první objevenou miRNA byla již v roce 1993 lin-4, kdy byla popsána inhibice proteinu lin-14 u organismu Caenorhabditis elegans mechanismem RNA-RNA interakce (3). Dnes je známo přes 1500 lidských miRNA (Sanger miRNA database 19.0 – www.mirbase.org).

miRNA vzniká nejčastěji za účasti RNA polymerázy II jako tzv. pri-miRNA během transkripce z DNA. Po samotném přepisu dojde k vytvoření sekundární struktury za vzniku smyčky a dvojvlákna RNA. Z jednoho vláknapri-miRNA může vzniknout 1–6 zralých miRNA. Lokalizace genů pro miRNA je v oblastech mimo geny kódující proteiny nebo v intronech uvnitř sekvencí kódujících proteiny (4–6). Tato pri-miRNA, tvořená asi 80 nukleotidy, je následně štěpena tzv. mikroprocesorem, tedy enzymatickým komplexem obsahujícím protein DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8), rozpoznávajícím dvouvláknovou sekvencipri-miRNA, a enzymem Drosha s RNázovou aktivitou, díky které dojde k vlastnímu odštěpení konců pri-miRNA za vzniku prekurzorové miRNA (pre-miRNA) (7–9). Ta je následně aktivně transportována pomocí transportního proteinu exportinu 5 z jádra do cytoplazmy (10–11). Zde dojde k dalšímu štěpení (díky ribonukleázové aktivitě enzymu Dicer), při kterém nakonec z pre-miRNA odštěpením oblasti smyčky vznikne dvojvlákno miRNA. Dicer je součástí tzv. RISC (RNA-induced silencing complex) a je navíc zodpovědný za rozvolnění dvojvlákna miRNA. Nepřítomnost Diceru znamená afunkční miRNA, a tedy i poruchu posttranskripční regulace, jak bylo prokázáno in vivo na myších (12). Ve většině případů je použito pouze jedno vlákno miRNA(z pre-miRNA), druhé je degradováno (obr. 1). Vlastní jednovláknová sekvence miRNA je zavzata do RISC, který zprostředkuje navázání na cílovou mRNA, a dále umožní podle míry komplementarity miRNA-mRNA buď přímo degradaci cílové mRNA (v případě úplné komplementarity bází), nebo inhibici její translace. Degradace mRNA je umožněna RNázovou aktivitou proteinu Ago2, který je rovněž součástí RISC (13). Oběma způsoby je dosaženo regulační funkce – inhibice vzniku proteinu.

miRNA není vázána pouze na buňku – je detekovatelná v plazmě a dalších tělních tekutinách. Nicméně volná RNA podléhá v plazmě rychlé degradaci díky přítomnosti RNáz. Proto v plazmě necirkuluje volně, ale ve vezikulech, případně navázána na protein. Tím je zabráněno její degradaci (14–15). Vezikuly mohou být reprezentovány exozomy, mikročásticemi aktivně se uvolňujícími z buňky, nebo apoptotickými tělísky (16–18). Ukázalo se, že vysoce denzní lipoprotein (HDL) má vliv nejenom na snížení kardiovaskulárního rizika ovlivněním transportu cholesterolu, ale navíc je schopen přenášet i miRNA, chránit ji tak před degradací a jejím prostřednictvím ovlivňovat cílovou tkáň (19). Použití HDL jako vektoru v transportu specifických miRNA je jedna z možností, kterou by bylo možné v budoucnu využít i pro cílenou léčbu některých onemocnění (20–21). Kromě HDL cirkulují v plazmě miRNA navázané i na další proteiny, jako je například nucleophosmin 1 (NPM1) a Ago2, výše zmíněný protein, jenž je součástí RISC.

miRNA A DIABETES MELLITUS

Při diabetes mellitus dochází k hyperglykémii, která je způsobena absolutním nebo relativním nedostatkem inzulinu. Inzulin je produkován beta-buňkami v ostrůvcích pankreatu a dále uvolňován do krevního řečiště. V cílových tkáních pak vazbou na svůj receptor usnadní vstup glukózy do buněk s následným poklesem glykémie. Při inzulinové rezistenci je potřeba k dosažení normoglykémie většího množství inzulinu. Tím se zvyšují nároky na beta-buňku. Při jejím selhání se rozvíjí hyperglykémie. miRNA hraje významnou roli jednak v samotném vývoji pankreatických ostrůvků a diferenciaci beta buněk, jednak pak v produkci a sekreci inzulinu a rozvoji inzulinové rezistence. Účastní se taktéž metabolismu tuků a svou úlohu hraje i v patogenezi obezity. miRNA se tak účastní všech důležitých kroků, jejichž selhání může vést k rozvoji diabetes mellitus, metabolického syndromu a jejich komplikací (22).

Diabetes mellitus 1. typu (T1DM) je způsoben autoimunitním mechanismem, který vede k destrukci a zániku beta buněk. Ukázalo se, že regulační T-lymfocyty u diabetiků 1. typu zvýšeně exprimují miR-510, naopak miR-191 a miR-342 byly exprimovány méně v porovnání se zdravými jedinci (23). V jiné studii byly porovnávány exprese miRNA u dětí s nově diagnostikovaným T1DM proti zdravým dětem. U 12 miRNA (miR-152, miR-30a-5p, miR-181a, miR-24, miR-148a, miR-210, miR-27a, miR-29a, miR-26a, miR-27b, miR-25, miR-200a) byla pozorována zvýšená exprese. Jedná se o miRNA, které jsou zapojeny do apoptotických dějů a regulací beta buňky. V této studii byla navíc prokázána asociace mezi miR-25 a zbytkovou funkcí beta buňky, vedoucí k lepším hodnotám glykémií (24).

U diabetes mellitus 2. typu (T2DM) byla signifikantně zvýšená exprese sedmi miRNA (miR-9, miR-29a, miR-30d, miR-34a, miR-124a, miR-146a a miR-375) v porovnání s kontrolami, přičemž u pěti z nich byla navíc signifikantně zvýšená exprese v porovnání s prediabetiky (hraniční glykémie nalačno, porušená glukózová tolerance). Rozdíl mezi prediabetiky a kontrolami nebyl zjištěn (25). Zvýšená exprese miR-375 potlačila glukózou stimulovanou sekreci inzulinu a naopak její inhibice vedla k vyplavování inzulinu. Tato miRNA posttranskripčně reguluje translaci proteinu myotrofinu (Mtpn), jehož dereprese sníženou hladinou miR-375 vedla ke zvýšení produkce inzulinu (26). Myši neexprimující miR-375 mají zmnožené alfa buňky pankreatu a zvýšenou hladinu glukagonu. Naopak množství beta buněk je snížené. To pak vede k hyperglykémii. miR-375 se tak účastní prostřednictvím svých cílových transkriptů i buněčného růstu a proliferace buněk (27).

miR-124, a zejména pak jeho izoforma miR-124a, se také účastní vývoje pankreatu. Inhibuje translaci transkripčního faktoru FOXA2, který reguluje specifické geny beta buňky (PDX1, KIR6.2 a SUR1). NadbytekmiR-124 vede ke snížení produkce inzulinu. Zdá se, že dráhy regulace sekrece inzulinu jsou pro miR-124a miR-375 shodné (28).

U prediabetiků při rozvoji inzulitidy byla pozorována zvýšená exprese miR-21, miR-34a a miR-146a (29). miR-9 snižuje expresi granuphilinu, a tím i vyplavování inzulinu při stimulaci glukózou (30–31).

Ve velké prospektivní studii (n = 822) byla sledována exprese miR-126, kdy byla prokázána významná negativní korelace mezi miR-126 a rozvojem T2DM, navíc s výrazným gradientem mezi kontrolami, prediabetiky a diabetiky. Zatímco nejvyšších hladin miR-126 dosahovala skupina kontrol, nejnižších dosahovali diabetici. Exprese u prediabetiků byla uprostřed. Původ miR-126 zatím není znám, ale její snížení je spojováno s nemocí periferních arterií u diabetu (32), stejně tak jako s nemocí koronárních tepen (33). Cílovou mRNA pro miR-126 je transkript genu IRS-1. Při nadbytku miR-126 v hepatocytech dochází k redukci translace IRS-1, a tím k poruše signalizace inzulinové dráhy (34). Při in vitro pokusu na endoteliích pěstovaných v podmínkách hyperglykémie nebyla změněna exprese miR-126, ale bylo snížené její „balení“ do apoptotických tělísek (32, 35), čímž se snížila možnost parakrinního působení a ovlivnění cílových struktur. Zůstává tedy otázkou, jestli například změna v koncentraci jiných miRNA nemůže ovlivňovat uvolňování apoptotických tělísek, a způsobovat tak sníženou hladinu kolující miR-126 v krvi.

EXPRESE miRNA U CHRONICKÉ PANKREATITÍDY A KARCINOMU PANKREATU

Karcinom pankreatu zaujímá v České republice u mužů i u žen 5. místo v úmrtnosti z nádorové příčiny, pokud neuvažujeme kožní nádory a nádory z pohlavních žláz (36). Mortalita je tak podobná jako v USA (37). Svým maligním chováním, pozdní diagnostikou a zvyšující se incidencí představuje karcinom pankreatu významnou oblast v onkologii, dosud však bohužel se špatnou prognózou. Pozdní diagnostika je dána pozdními klinickými projevy, které se objeví většinou již v pokročilé fázi onemocnění, a také absencí vhodných markerů karcinogeneze (38). Nalezení takového markeru by znamenalo pokrok v diagnostice, a tím i v možném zlepšení prognózy pacienta. Jedním z recentně studovaných mechanismů jsou i odlišné exprese miRNA u nádorů. U karcinomu pankreatu byly pozorovány pozitivní i negativní změny v expresi miRNA.

Mezi miRNA, jejichž koncentrace jsou snížené, patří miR--126, která inhibuje translaci ADAM9, proteinu s metaloproteinázovou a disintegrinovou doménou, jehož nadprodukce byla prokázána při progresi karcinomu (39–41). Substituce miR-126 by tak mohla být jednou z možností prevence progrese a metastazování karcinomu (41). Jak bylo uvedeno výše, tato miRNA má změněnou koncentraci i u jinak zdravých diabetiků. To by mohlo jednak pomoci zdůvodnit, proč mají diabetici obecně vyšší riziko neoplazie než zdraví jedinci, a jednak objasnit časný výskyt diabetu (a zároveň mnohdy první příznak) v souvislosti s rozvojem karcinomu. Oblast DNA kódující miR-148a je u karcinomu pankreatu hypermetylována a exprese samotné miR-148a je pak snížená. Míra metylace této oblasti DNA by tak mohla sloužit jako diagnostický marker k odlišení karcinomu od chronického zánětu (průměrná metylace miR-148a u karcinomu pankreatu a chronické pankreatitidy je 4,25 %, resp. 1,21 %; p < 0,05) (42). Taktéž miR-132 je sníženě exprimována u karcinomů pankreatu a její genová sekvence je hypermetylována. Při in vitro pokusu na buněčných liniích došlo při podání miR-132 ke zpomalení růstu nádorových buněk a naopak při podání anti-miR-132 k progresi buněčného růstu a tvorbě větších buněčných kolonií (43).

Na rozdíl od diabetiků, kde bylo pozorováno zvýšení exprese miR-375, byla tato miRNA u karcinomu snížená. Nízká exprese pak korelovala s horším stagingem podle pTNM klasifikace (44). Tento poznatek by se mohl využít při výskytu diabetu u rizikové skupiny pacientů, kdy by daná miRNA pomohla rozlišit primární – a sekundární diabetes mellitus (prvotní symptom karcinomu pankreatu).

U pacientů s karcinomem byla rovněž pozorována nižší exprese miR-218, která také korelovala s horší diferenciací nádoru, pokročilostí a horší prognózou pro pacienta (45).

Mezi miRNA, jejichž exprese jsou u karcinomu naopak zvýšené, patří miR-16, miR-21, miR-27a, miR-100, miR-135b, miR-155, miR-181b, miR-196a, miR-200 a miR-221. Liu et al. prokázal signifikantní zvýšení exprese u sedmi miRNA, z nichž pro diagnostiku karcinomu navrhl miR-16 a miR-196a v kombinaci s biochemickým markerem CA 19-9. Tento test k odlišení karcinomu od kontrol a pacientů s chronickou pankreatitidou dosahoval 92% senzitivity a 95,6% specificity. Pro odlišení karcinomu od chronického zánětu pak byla senzitivita a specificita 88,4 % a 96,3 % (46). K odlišení nádoru od zánětu byla v jiné studii použita exprese miR-135b ve vzorku 42 pacientů s karcinomem a 33 s chronickou pankreatitidou, která byla schopna tyto jednotky odlišit se senzitivitou 92,9 % a specificitou 93,4 %. Pozitivní a negativní prediktivní hodnota testu byla 95 % a 91 % (47).

Při analýze vzorků odebraných při aspirační biopsii bylo pozorováno zvýšení exprese miR-21, miR-196a a miR-221 (p < 0,001, p < 0,001, p = 0,009) (48). Ke zvýšení miR-21 dochází i u jiných nádorů, např. jícnu, plic, tlustého střeva, u glioblastomu (49–52). Tato miR-21 reguluje translaci LRRFIP1, který inhibuje antiapoptotickou signalizační dráhu NF-κB, a tím významně zasahuje do regulačních procesů buňky. Zvýšením hladiny miR-21 dojde k inhibici LRRFIP1, čímž je dráha NF-κB deblokována a buňka chráněna před apoptózou, což vede k delšímu přežívání (až imortalizaci) a proliferaci nádorových buněk (52–53). NF-κB představuje společnou signalizační dráhu, která je aktivní při zánětech i nádorech. Tak lze vysvětlit pojetí chronické pankreatitidy jako rizikového faktoru pro rozvoj karcinomu pankreatu (54). Míra exprese miR-21 nekorelovala s velikostí tumoru, stupněm diferenciace, ani s metastatickým postižením uzlin. Výrazně zvýšená exprese však souvisela s horší prognózou pacienta (55–56).

Koncentrace miR-155 je taktéž zvýšena u celé řady nádorů (57–59). To ukazuje na společné prvky v karcinogenezi různých tkání. miR-155 reguluje translaci TP53INP1 (tumor protein 53-induced nuclear protein 1), proteinu indukovaného při buněčném stresu, který se s p53 spolupodílí na buněčné smrti v apoptotickém procesu (60–61). Zvýšená koncentrace miR-155 u karcinomů však vede k inhibici TP53INP1, čímž opět dojde k inhibici apoptózy a imortalizaci nádorových buněk (60) (obr. 2).

Sestavením vhodného panelu miRNA by bylo možné získat účinný diagnostický nástroj. Bloomston et al. vybral 25 miRNA, které v 95 % správně určily nádor a nenádorovou tkáň (tedy kontroly a chronickou pankreatitídu), v 93 % správně zařadily nádor a chronický zánět a ve 100 % odlišily chronickou pankreatitídu od normální tkáně pankreatu (62).

Podobně jako v séru či plazmě, i v pankreatické šťávě byly pozorovány odlišné exprese některých miRNA. Testováním miR-205, miR-210, miR-492 a miR-1247 spolu s CA 19–9 bylo dosaženo senzitivity 91 % při specificitě 100 % (pro záchyt karcinomu), tedy daleko více než při použití samotného CA 19-9 (77 %, 93 %) (63).

miRNA – NOVINKA V ÚČINNÉ TERAPII NÁDORŮ?

Studium miRNA se stává významnou oblastí vědy, což dokládá i množství publikací vznikajících v posledních 10 letech. Rostoucí počet prací směřuje k využití miRNA v diagnostice určitých chorob, ke zpřesnění zažitých testů, k přesunu od invazivní diagnostiky k méně invazivní. Zároveň roste i snaha o využití poznatků v terapii.

Aby však bylo možné ovlivnit cílovou tkáň, je potřeba konkrétní miRNA-modulátor nějakým způsobem dopravit na cílové místo. Způsob podání může být lokální nebo systémový. Zatímco lokální má výhodu v zamezení nežádoucího působení modulátoru na jiném místě v organismu, systémový má zase výhodu v možnosti semi-invazivně (intravenózně) ovlivňovat i tkáně, které nejsou přímo dostupné. Nicméně miRNA při systémovém podání je vystavena nukleázové aktivitě v krevním řečišti, a tak musí být molekula chemicky upravena, konjugována a opouzdřena, aby byla před RNázou ochráněna, dopravena na cílové místo, schopna projít buněčnou membránou a dostat se do cytoplazmy. Pouze chemická modifikace sice stabilizuje molekuly v krevním řečišti a ochrání je od RNáz, nicméně neumožní efektivní vstup do buňky. Proto byly vyvinuty nosiče na virové a nevirové bázi, které prostup buněčnou membránou usnadní. Jako virové nosiče se používají lentiviry, adenoviry a adeno-asociované viry, mezi nevirové nosiče se řadí lipozomy, biodegradabilní polymery, kolagen 1. typu a makrofágy. Pokud se ke komplexu připojí nosič obsahující molekulu, jež bude rozeznána povrchovým receptorem konkrétní buňky, bude dosaženo cíleného působení modulátoru s minimalizováním nežádoucích účinků jinde v organismu a umožněním redukce jeho dávky. V současné době se připravuje ke klinickému testování první lék používající miRNA (proti hepatitidě C). Vzhledem k často velmi limitujícím možnostem protinádorové terapie jsou sníženy nároky na bezpečnost a toxicitu protinádorového léku, což může usnadnit proniknutí miRNA-orientované léčby na trh v oblasti onkologie. To může přinést nové a zatím netušené možnosti v nádorové terapii, ať už se bude jednat o samostatný lék nebo jako senzitizér v kombinaci s chemoterapií (64).

ZÁVĚR

Oblast miRNA je sice zatím vědecky mladá, málo probádaná, nicméně již současné poznatky předpokládají slibné nasazení miRNA jak v rutinní diagnostice, tak v terapii. Například u diabetu by mohla být detekovatelná časná stadia selhávání beta buňky, u karcinomu pankreatu pak časná stadia neogeneze, včetně zatím problematického odlišení karcinomu v terénu chronické pankreatitidy. Dosud netušené možnosti skrývá předpokládané využití miRNA v terapii, kdy by bylo možné úpravou miRNA spektra (blokováním zvýšeně exprimovaných, případně doplněním méně exprimovaných miRNA) u nádorů podpořit apoptózu neoplasticky transformovaných buněk, blokovat metastazování, eventuálně docílit redukce ložiska. Blokování destruktivního autoimunitního procesu u diabetes mellitus 1. typu, ochrana beta buňky a snížení inzulinové rezistence u 2. typu atd. by pak znamenalo revoluci v terapii diabetu. To je však zatím hudba budoucnosti, ke které bude ještě potřeba mnoho dalších výzkumných studií.

Konflikt zájmů: žádný.

Článek byl doručen do redakce 14. 2. 2014.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

MUDr. Pavel Škrha

II. interní klinika 3. LF UK a FNKV

Šrobárova 50, 100 34 Praha 10

e-mail: pavel.skrha@email.cz