Účinky laktoflóry podané intranazálně, výsledky primární studie

Súhrn

Probiotika jsou dlouhodobě v zájmu výzkumníků i mléčného průmyslu pro svůj biologický i ekonomický potenciál. Aplikace na sliznici nosu a nosohltanu ve světové literatuře dosud publikována nebyla. Po vyzkoušení směsi L. acidophilus CCD151 a L. helveticus CCGM 98 na dospělých dobrovolnících byla provedena aplikace u dětí v počáteční fázi infektu HCD. V souboru 76 dětí s aplikací laktoflóry bylo nutné v 8,1 % v dalším průběhu onemocnění nasadit antibiotika, v kontrolním souboru 31 dětí ve 22 %. Nedošlo k žádné nežádoucí příhodě.

Klíčová slova:
probiotika, Lactobacillus acidophilus, rinitis, nazofaryngitis, intranazální podání

ÚVOD

Laktobacily a bifidobakterie jsou v mlékárenství využívány ve výrobě kysaných mléčných výrobků, průmyslových tvarohů a sýrů. Jednotlivé kmeny se mohou ve svých vlastnostech významně lišit. Lactobacillus acidophilus je znám jako mikroorganismus zdravé vaginální sliznice. Interakce mezi lidským tělem a laktobacilem je evidentně pozitivní. Zcela logicky byla zkoušena jeho aplikace a později i příbuzných bakterií při dysmikrobiích gastrointestinálního traktu a dalších onemocněních. Publikované výsledky vědeckých prací se dotýkají mimořádné šířky účinků i v dalších oblastech lidského těla, a proto jsou také terčem celé řady kritik. Jednoduchá příprava kultur, výroba acidofilních kultur a celé řady komerčních mléčných výrobků a možná souvislost se zlepšením zdravotního stavu přímo vybízí k testování aplikace různých druhů laktoflóry u řady onemocnění, kdy byl popsán pozitivní účinek. Na laické hodnocení celé řady dospělých pacientů, kteří používali koncentrovanou laktoflóru ke kloktání a při počínajících příznacích zánětů horních dýchacích cest, navazuje výzkumný úkol intranazální aplikace u dětí, u nichž se tento druh zánětu vyskytuje nejčastěji.

VLASTNÍ POZOROVÁNÍ

První pokus byl provedený u 12 dospělých dobrovolníků. Roztok směsi vytipovaných kmenů L. acidophilus a L. helveticus o koncentraci 10⁸ bakterií/ml používali ke kloktání.

Vstupní příznaky byly zvýšená teplota, škrábání, bolesti v krku, dysfonie. U všech došlo ve velmi krátké době k ústupu potíží a nebylo nutné nasadit antibiotika. Ve druhé fázi byl u 6 z nich aplikován roztok i cestou nosních průchodů. Nezaznamenali jsme žádnou nežádoucí příhodu. Pokud došlo k použití během 12 – 24 hodin po zahájení onemocnění, došlo k ústupu potíží prakticky do druhého dne.

V průběhu dalších dvou let bylo možné intranazální aplikaci vyhodnotit u 76 dětí ve věku 0,5 – 17 let. Inkluzní kritéria: zánětlivé změny v oblasti nosohltanu, případně počínající zánět v oblasti středouší bez nutnosti nasadit antibiotika. Exkluzní kritéria: alergie na kravské mléko, poruchy imunity.

Použitý přípravek: lyofilizovaná kultura laktoflóra acidofilní (kmen Lactobacillus helveticus CCDM 98 a Lactobacillus acidophilus CCDM 151) uchovávané při 4 st. C v uzavřené dóze.

Příprava roztoku bakteriální kultury – obsah malé kávové lžičky (3,5 ml) lyofilizované kultury probiotika se rozmíchá do 50 ml teplé vody (optimálně 37 st.C). Bakterie se aktivují během 15 – 20 minut za opakovaného promíchání. Pomocí běžného nosního kapátka se směs vstříkne vleže do nosních průchodů tak, aby se dostala i do oblasti nosohltanu. Zbývající roztok se obohatí kávovou lžičkou řepného cukru a použije k vykloktání a vypití. Zpravidla se podává 3x denně po 3 dny, není na závadu podávání častější.

Jako běžná léčba se aplikují antipyretika-antiflogistika a salinické roztoky zahřáté na tělesnou teplotu. Používání studených roztoků inhibuje pohyb řasinek. Anemizující nosní kapky používáme pouze v případě nosní obstrukce.

V letech 2012 – 2013 bylo vyšetřeno 80 dětí a byla vytvořena metodika pro získání kontrolního souboru dětí se stejnými inkluzními kritérii, které by byly sledovány bez podávání přípravku laktoflóry – 32 dětí. Byla vyvinuta nová metoda podávání emulze laktoflóry na nosní sliznici pomocí nosního rozprašovače, ve spolupráci s Milkomem, s.r.o., pak i s vývojem nové technologie přípravy probiotické směsi. Aplikace byla vyzkoušena na 50 dobrovolnících s velmi dobrou tolerancí a nulovými nežádoucími účinky.

Ze souboru 80 dětí ve věku 5 – 17 let, v průměru 5,3, přišlo ke kontrole 76 dětí, u 6 bylo potřeba nasadit antibiotika celkově, u 1 dítěte lokálně. Antibiotika celkově nebylo potřeba nasadit u 70 dětí ze 76 – u 91,8 %

Nález patogenní flóry byl u 1. výtěru z nosu v 75 %, u 2. výtěru dokonce 82 %, zatímco u prvního výtěru z krku jen necelých 16 % a u druhého výtěru 14,5 %.

Celkem u 32 dětí z 80, ve 40 %, byla patogenní flóra alespoň jednoho mikroorganismu stejná v prvním i v kontrolním výtěru z nosu.

Mezi patologickými bakteriemi v 1. i 2. výtěru v nose byly zjištěny 44x pneumokoky, Moraxella catarrhalis 30x, Haemophilus influenzae 23x, ostatní patogeny byly zjištěny ojediněle.

V kontrolním souboru docházíme k podobným procentům pokud se týká nálezů patogenní flóry ve výtěrech z nosu, ve výtěrech z krku je záchytnost ještě menší než u souboru testovaného. Do hodnocení bylo přijato 31 dětí, u jednoho byla diagnostikována druhý den streptokoková angína.

U 26 dětí z 31 (84 %) byl zjištěn alespoň 1 patogen v 1. výtěru z nosu, ve 2. výtěru u 16 dětí ze 20 (80 %).

Výtěr z krku byl pozitivní u 3 dětí z 25, resp. u  1 z 19.

Soubory můžeme pokládat za odpovídající skladbu. Z 31 dětí s projevy zánětu v oblasti horních dýchacích cest, které byly léčeny zvyklou léčbou bez použití antibiotik, bylo nutnou 7 ≈ 22 % nasadit celkově antibiotickou léčbu.

Rozdíl nalézáme v potřebě nasadit celkově antibiotickou léčbu – 22 % verzus 8,1 %.

Současně s klinickým testováním provádíme testování interakce používané laktoflóry s běžně získávanými patogenními kmeny, s využitím nového laboratorního postupu, vypracovaného v laboratoři Kliniky mikrobiologie FNM v roce 2012. Na 47 mikrobiálních kmenech byl otestován pravděpodobný průkaz inhibičních exoproduktů používané laktoflóry. K účelu laboratorních testů byla použita standardně připravená bujonová kultura (Brain Heart Infusion) laktobacilů. Tato kultura byla inkubována při pokojové teplotě (22–25 st. C) a při teplotě 37 st. C po dobu 10 dnů. Inkubační teplota neovlivnila aktivitu laktobacilů. Inhibiční účinek je ale ovlivněn stářím bujonové kultury – nejvyšší aktivita byla dokumentována u čtyř a šestidenní kultury laktobacila. Předpokládáme, že toto časové rozmezí odpovídá exponenciální fázi, kdy hustota populace směsi laktobacilů dosahuje maxima a následně postupně přechází do stacionární fáze růstu se snižující se koncentrací aktivních produktů, které inhibují konkurenční bakteriální mikroflóru. Ve vztahu k bakteriálnímu druhu byla vyšší aktivita pozorována zejména u hemofilů, pneumokoků, streptokoků, střední aktivita u branhamel a stafylokoků, relativně nejnižší u pseudomonád a dalších gram negativních tyček; nicméně u všech testovaných izolátů kultivovaných z klinického materiálu byla inhibice v různé intenzitě laboratorně prokázána. Interakce mezi bakteriemi v oblasti lidského epitelu bude zahrnovat podstatně komplexnější mechanismus potlačení potenciálně patogenní mikroflóry, kterým například může být i kompetice o vazební místa na epitelu dýchacích cest. Mikrobiologická metoda zřejmě zahrnuje pouze pravděpodobný průkaz exoproduktů, které mají inhibiční účinek testované bakterie.

Další mikrobiologický rozbor prokázal velmi dobrou citlivost všech vzorků testovaných kultur laktoflóry na potencované amoxypenicilíny, které by byly lékem volby v případě raritní infekce u imunokomprimovaných osob.

DISKUSE

Interakce mezi mikro a makrosvětem jsou velmi složité. V léčbě akutních bakteriálních onemocnění zvažujeme zpravidla na prvním místě antibiotickou léčbu. V prevenci infekčních onemocnění se později objevila možnost přímé aktivní, pasivní imunizace a nepřímé ovlivňování imunitních odpovědí. Probiotika, živé organismy, které mají mít schopnost pozitivně ovlivnit zdravotní stav hostitele, začala být studována ve druhé polovině minulého století a počty prací o jejich účincích se stále zvyšují. Aplikace probiotik nelze považovat za kauzální léčbu, ale podle dosavadních zkušeností dochází k pozitivnímu ovlivňování interakcí makro a mikroorganismů. Ve studii jsme mohli pozorovat, že v kultivačních nálezech z nosu ve velkém procentu přetrvávaly primárně zjištěné patogeny, ale nedošlo k progresi onemocnění. Mezi účinky podávané laktoflóry v roztoku se zvažují přímé mechanismy interakce s mikroflórou nosní sliznice (mechanicky, kompetitivní inhibice o adhezivní receptory, o potravu, tvorba štěpných produktů s  mléčnou kyselinou a peroxidem vodíku (1), antibakteriálních polypeptidů (28)) i nespecifická stimulace makroorganismu (zvýšení sekrece, snížení slizniční permeability, stimulace imunitního systému) (34).

Probiotika jsou podle definice WHO z roku 2001 „živé organismy, které podané v adekvátním množství poskytují zdravotní prospěch“. R. Fuller je v roce 2001 charakterizuje obdobně - mikrobiální doplněk potravy, který působí příznivě na vyvážení střevní mikroflóry hostitele (35). Přes preventivní charakter podávání probiotik řada autorů studuje i možnost léčebného použití, a to i za podpory dalších látek – prebiotik. Probiotika charakterizujeme jako nestravitelné části potravy, které stimulují růst bakterií příznivých pro hostitele (jako inulin, fruktózooligosacharity, galktozosacharidy, laktulózu; WHO 2002). Vytvářejí se tak směsi probiotik a prebiotik – synbiotika. Použití synbiotik bývá označováno jako „replacement therapy” (léčba nahrazením) bakterioterapie.

K nejužívanějším probiotikům patří Lactobacillus acidophilus. Používá se samostatně i v kombinacích například s L. casei, L. bulgaricus, L. reuteri, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Streptococcus thermophilus, Saccharomyses boulardii.

Přítomnost Lactobacillus acidophilus na sliznici vaginy je považována za fyziologickou. Pozitivní účinek je dokladován především v oblasti střeva. Doporučuje se primárně k udržování příznivé mikrobiální balance ve střevě. Užívání přípravků s probiotiky je doporučováno u perorálně podávaných širokospektrých antibiotik, významně redukujících běžnou střevní flóru (36). Podávání antibioitika a probiotika by mělo respektovat dobu účinku antibiotika ve střevě, současné nebo následné podání je nevhodné.

Rozsah zájmu výzkumných prací, které prokazují účinnost probiotik na lidský organismus, je nesmírně široký a souhrn všech doporučení budí až podezření na přeceňování významu probiotik.

Běžně jsou doporučována při:

• a) vaginálních infekcích – vaginální čípky s L. acidophilus a dokonce i užívání (p.os) jogurtu s živou kulturou (4, 23, 29),
• b) prospěšnost u tzv. cestovatelského průjmu dokládá metaanalýza s využitím kmenů Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus GG, Saccharomyces boulardii a směsi Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium bifidum) (25),
• c) prevenci průjmu – jak běžné infekční etiologie u dětí i dospělých. Zdůrazňuje se potřeba přesné specifikace vlastností použitých bakterií a jejich kombinací, protože se výsledky jednotlivých studií liší (11, 24, 25),
• d) nahrazování přirozené střevní bakteriální mikroflóry zničené antibiotickou léčbou (12, 14,
• e) při trávení a supresi nežádoucích bakterií (22).

Probiotika jsou dále doporučována při:

• f) léčbě infekce Clostridium difficile (Lactobacillus plantarum 2017405, Lactobacillus fermentum 353, Lactobacillus acidophilus DSM 21007 a Lactobacillus rhamnosus GG) (30, 34),
• g) eradikaci infekce (pomocí Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii a L. salivarius) (16),
• h) léčbě symptomů Crohnovy choroby, ulcerativní kolitidy apod.,
• i) eliminaci laktózové intolerance (35),
• j) posílení imunitního systému (5, 10, 13, 26),
• k) chronické rinosinusitidě (27),
• l) urogenitálních infekcích (29),
• m) snížení rizika pylové alergie (18, 15, 20),
• n) snížení rizika dětských ekzémů (19),
• o) onemocnění ústní dutiny (kazivost zubů, nemoci periodontu) (35),
• p) hypercholesterolémii (2), diabetu (35), hypertenzi (35).

Mechanismus působení probiotik při průjmových onemocněních na molekulární úrovni není plně pochopený. Prokazuje se například vliv L. acidophilus při regulaci exprese a funkce střevního přenašeče iontů NHE3 (natrium-hydrogen exchanger 3), který je kódovaný genem SLC9A3 (32).

Fenoménu posílení imunitního systému se věnuje několik autorů. Studovali účinky dlouhodobého podávání bakterií rodu Lactobacillus nebo Bifidobacterium (více než půl roku) u 3-5letých dětí z kolektivních zařízení. Ukazují na snížení celkové nemocnosti, nižší potřebu antibiotické léčby, mírnější průběh onemocnění (6, 10, 12, 13, 15, 18, 21, 27, 31). Pozorování odpovídá i výše uvedená informace o oslabení nadměrných reakcí u dětských ekzémů a pollinózy.

Probiotika jsou připravována v podobě lyofilizovaných granulí, kapslí, prášku, v podobě tekutých přípravků, jogurtů, tablet, vaginálních čípků, přidávají se i do žvýkací gumy. Mají různé možnosti použití, různou délkou a způsob skladovatelnosti. Za nejdůležitější parametr je považována aplikovaná dávka. Pro prevenci a léčbu průjmu u dospělých se doporučují 1 - 2 miliardy buněk, ale až 10 - 15 miliard buněk denně. Dalším velmi důležitým parametrem je stabilita pasážované a později skladované kultury (33).

Probiotika by neměly používat osoby s podezřením na alergickou reakci na složky mléka. Mezi vedlejšími projevy podávání probiotik se uvádí plynatost, „zkažený žaludek“, průjem. Závažné nežádoucí reakce jsou velmi řídké – je popsaný jeden případ anafylaktické reakce u pacienta užívajícího inulin (typ probiotika). Aplikace se nedoporučuje u osob s oslabeným imunitním systémem (chemoterapie, imunosuprese), ale i u implantovaných cizích těles, jako jsou kloubní náhrady nebo srdeční chlopně (36). Populační studie v zemích, kde se probiotika běžně používají, neprokazují zvýšené riziko bakteriémie nebo endokarditidy (3). Výhledově se připravují geneticky modifikovaná probiotika, kde by bylo možné kumulovat pozitivní vlastnosti jednotlivých bakteriálních kmenů (35).

Systematické podávání probiotik na nosní sliznici a do oblasti nosohltanu u lidí bylo popsáno poprvé v práci vycházející z našich zkušeností v Otolarnygologii v roce 2013. Vycházeli jsme z dosud pozorovaných účinků na sliznici obecně, přestože nelze říci, že by byl tento mechanismus objasněn. Z cílených vědeckých prací lze usuzovat na aktivaci dendritických buněk a poté T buněk směrem k Th1, nebo Th2 (6), efekt L. acidophilus na zvýšení exprese iontové pumpy Cl/HCO₃ na povrchu střevní sliznice (to může být vysvětlením protiprůjmového účinku) (32).

ZÁVĚR

Ve shodě s citovanými pracemi jsme potvrdili dobrou snášenlivost aplikovaného přípravku laktoflóry L. acidophilus a L. helveticus v koncentraci 10⁸ bakterií/ml na sliznici nosu, jak ve formě čerstvě připravovaných kapek, tak ve formě spreje. Nezaznamenali jsme žádnou nežádoucí reakci, která by byla příčinou zastavení aplikace. Mikrobiologické testy prokázaly přímou inhibiční schopnost směsi na běžně kultivovaté patogenní bakterie získávané z klinických odběrů. Současný výsledek srovnání skupiny 76 dětí s aplikací laktoflóry a kontrolní skupiny 31 dětí bez jejího použití lze označit jako velmi nadějný; je potřebné nasadit antibiotika v průběhu infektu u 8,1 % verzus 22 % ve prospěch dětí s aplikací laktoflóry.

Práce je podporována grantem MZe QJ1210093 – Nové metody pro výrobu, kontrolu kvality a účinků probiotických potravin, účinek Lactobacillus acidophilus na zabránění rozvoje bakteriálních zánětů v horních dýchacích cestách.

Adresa ke korespondenci:

MUDr. Michal Jurovčík

ORL klinika 2. LF UK a FNM

V Úvalu 84

150 06 Praha 5