Organizace a využívání tkáňové banky nádorů

Súhrn

Biobankovnictví je sofistikovaný a organizovaný systém, programově schraňující pro účely vědeckého výzkumu biologický materiál a k němu příslušná data. Tento článek stručně popisuje principy nádorových biobank, zejména shromažďování, skladování a poskytování vzorků nádorových tkání. Je vysvětlena klíčová role patologa při odběru materiálu pro biobanku; proces výběru vhodného vzorku je neoddělitelnou součástí diagnostického makroskopického zpracování resekovaných tkání a orgánů. Materiál musí být v biobance zpracovávaný způsobem, který je kompatibilní s jinými biobankami. Harmonizace standardních operačních postupů je tedy důležitým úkolem. Poskytnutí materiálu k vědeckému použití musí být provázeno uzavřením dohody (Material Transfer Agreement), která ošetří všechny technické a eticko-právní aspekty předání materiálu.

Klíčová slova:
biobanky – standardy – translační výzkum

Úvod

Bouřlivý rozvoj biomedicínského výzkumu a nových léčebných postupů v posledních desetiletích si vynutil vznik specializovaných zařízení, sloužících k dlouhodobému uchovávání lidského biologického materiálu. Pro tato zařízení se vžil termín „biobanka“ (BB). Dle definice je biobanka „zařízení, sloužící k dlouhodobému skladování a konzervování biologického materiálu, sloužícího k podpoře budoucích vědeckých výzkumných projektů“ [1]. Biobanky sestávají ze dvou odlišných částí: 1) úložiště biologického materiálu, který je shromažďován, zpracováván a dlouhodobě skladován, a 2) databáze obsahující demografické a klinické informace vztahující se ke každému jednotlivému biologickému materiálu. Podle účelu vzniku rozeznáváme celé spektrum BB: banky pupečníkové krve, kmenových buněk, nádorové tkáňové banky, banky zaměřené na specifickou chorobu, populační (epidemiologické) banky apod. V dalším textu se zaměříme na banky uchovávající nádorové tkáně, většina problematiky je ale společná všem typům BB. V kontextu nádorových onemocnění jsou BB klíčovými zdroji pro výzkum biomarkerů, molekulární diagnostiku a terapii, genomické, proteomické, metabolomické (a jiné -omické) profilování, epidemiologické a translační studie atd. Základním parametrem každé BB je bezpochyby kvalita, a to jak kvalita uchovávaného materiálu, tak kvalita shromažďovaných informací. Jen BB s vysokou úrovní kvality může být široce využívaným východiskem výzkumných projektů, a tudíž ekonomicky udržitelná. V odborné literatuře lze najít celou řadu doporučení a postupů pro správné fungování BB. Neméně závažným aspektem práce BB je široká národní a nadnárodní spolupráce mezi BB. U většiny vědeckých projektů trvá shromáždění vhodného materiálu roky, takže sdílení vzorků a informací je žádoucí, u méně častých a vzácných onemocnění dokonce nezbytné. Podmínkou takového sdílení obsahu BB je ale maximální harmonizace postupů sběru a uchovávání materiálu, programů pro zajištění kvality, formátů uchovaných dat, algoritmů jejich zpracování a v neposlední řadě i eticko-právního rámce. V současné době existuje řada struktur a organizací vytvářejících takové společné operační postupy v biobankovnictví [2,3]. Nezanedbatelným aspektem fungování BB je její financování. Náklady na ustavení a udržení biobankové infrastruktury jsou značné a zejména v investiční fázi je nutno hledat finanční podporu vládních, neziskových či privátních investorů. Jde přitom o relativně mladé medicínské odvětví, o jehož ekonomickém fungování je zatím málo známo, a z čistě obchodního pohledu je tedy rizikové. Přitom z podstaty věci vyplývá, že jde o projekt plánovaný spíše na desetiletí než roky. Ekonomicky životaschopná BB musí nejen poskytovat vysoce kvalitní vzorky a informace, ale zejména vzorky, o něž je zájem ze strany výzkumných týmů, neboť shromažďování a skladování vzorků bez jejich vydání (jež je spojeno s úhradou poplatků) je nerentabilní.

Sběr nádorové tkáně

Nádorová BB slouží shromažďování zejména tkání primárních tumorů a případných metastáz, případně doplněných nenádorovou (zdravou) tkání, z níž nádor vzniká. Paralelně může probíhat sběr dalších biologických materiálů, jako jsou krev, sérum, plazma či moč. Tkáň určená k uložení do BB musí splňovat dvě základní kritéria: musí jít SKUTEČNĚ o nádorovou tkáň a musí být zamražena CO NEJDŘÍVE PO PŘERUŠENÍ CÉVNÍHO ZÁSOBENÍ. Druhé kritérium závisí v prvé řadě na typu a postupu operačního výkonu (zde nelze očekávat, že by bylo možno je zásadně modifikovat pro potřeby biobankovnictví), v druhé řadě na organizačních opatřeních vedoucích k minimalizaci času mezi odběrem operačního preparátu a zamražením tkáně. Právě tato opatření jsou pro kvalitu uloženého materiálu zcela zásadní – degradace makromolekul počíná prakticky okamžitě po zastavení oxygenace tkáně a postupuje velmi rychle [4]. Plnění prvního kritéria – zajištění reprezentativnosti uloženého materiálu – záleží zejména v makroskopickém odlišení nádorové tkáně od tkáně normální, nekróz, inflamatorně-fibroproduktivních či prekancerózních změn. V tomto ohledu mají bohaté zkušenosti patologové, zejména tací, kteří jsou zvyklí zpracovávat nativní, nefixovaný materiál, nehledě na analogické znalosti z autopsií. Odběr vzorků do BB je přitom neoddělitelný od makroskopického popisu a zpracování nádorových resekátů. Popis velikosti tumoru a jeho vztahu k okolním strukturám, stav a vzdálenost resekčních okrajů apod. jsou informace zásadního charakteru, jejichž získání má samozřejmě přednost před odběrem materiálu pro vědecké účely. Jelikož tyto informace jsou součástí histopatologického výsledkového protokolu, zodpovědnost za ně nese patolog. Je tedy na něm, aby kombinoval techniky makroskopického zpracování s odběrem tkáně do BB tak, aby nedošlo k ovlivnění diagnosticko-léčebného procesu [5]. Nelze považovat za správné, aby odběr do BB prováděl kdokoliv jiný než patolog zodpovědný za diagnostiku předmětného nádorového onemocnění. Na straně chirurgie je tedy nezbytné 1) vyloučit nadbytečné zásahy do vyjmutých tkání/orgánů a 2) zajistit okamžitý transport materiálu k rukám patologa. Na straně patologie je nutno zajistit takovou organizaci práce, která umožňuje bezodkladné a prioritní zpracování vzorků určených pro odběr do BB. Jinými slovy, neustále musí být k dispozici jeden kvalifikovaný patolog, nejméně jedna laborantka a kapalný dusík.

Prakticky nejběžnější metodou ošetření tkáně při sběru je prudké zmražení v kapalném dusíku, případně v izopentanu předchlazeném v kapalném dusíku. Kromě přímého zamražení je podle mnohých studií vhodnější inkubovat před zamražením excidovanou tkáň v roztoku inhibujícího RNázy (RNA-later). Vzorky o velikosti v řádu mm3 jsou po zmrazení alikvotovány do speciálních zkumavek, označeny a uloženy. S výhodou lze praktikovat systém většího počtu sběrných míst napojených na jedno dlouhodobé úložiště. Sběrné místo je vybaveno Dewarovými nádobami s kapalným dusíkem k zamražení a přechodnému skladování, v intervalu cca jednoho týdne jsou shromážděné vzorky předány do velkokapacitního úložiště. Manipulace s kapalným dusíkem a tkáněmi je relativně jednoduchá a bezpečná a vyžaduje pouze krátké zaškolení (a povinně též bezpečnostní školení pro nakládání s medicinálními plyny).

Většina publikovaných schémat pro biobankovnictví nádorů doporučuje sbírat kromě nádorové i nepostiženou tkáň a optimálně i krevní buňky k extrakci genomické DNA. To umožňuje odlišit v nádoru získané genomové změny od vrozených.

Vhodným způsobem, jak přesně identifikovat tkáň odebranou pro BB, je pořídit tzv. paralelní blok, tzn. ke klasickému histologickému vyšetření vybrat a separátně označit tkáň bezprostředně (kontinuálně) navazující na bankovanou tkáň. Histologickým vyšetřením lze potvrdit přítomnost vitálního nádoru a kvantifikovat jeho zastoupení ve vzorku. Navíc lze tyto paralelní bloky použít ke konstrukci složených tkáňových bloků (Tissue Micro Arrays, TMA) a následně k in situ immunohistochemické validaci výsledků získaných metodami in vitro. Tím se minimalizuje možné zkreslení vlivem vnitřní nádorové heterogenity.

Sběr séra je komplexní problematikou, minimálním programem je uchování séra odebraného bezprostředně před operací a v krátkém intervalu po operačním výkonu. Lze praktikovat dlouhodobý sběr ke sledování vývoje hladin testovaných biomarkerů v souvislosti s klinickým vývojem onemocnění.

Sběr dat ke vzorkům může probíhat paralelně či může být uskutečněn retrospektivně. Jako optimální řešení se jeví softwarové propojení BB s nemocničním informačním systémem, zejména je-li tento komplexní a pokrývá veškerá data o diagnosticko-léčebné činnosti. Mnohdy však pacient prochází několika zdravotnickými zařízeními a tehdy může být shromáždění relevantních údajů nesmírně obtížné.

Jak odběr materiálu, tak shromažďování dat je nezbytné ošetřit z hlediska etických a právních aspektů, tj. v prvé řadě zajistit podrobné informování pacienta-dárce a podepsání informovaného souhlasu.

Uchovávání nádorové tkáně

Dlouhodobé skladování nativní, prudce zmražené tkáně je možné jediným způsobem – udržením velmi nízkých teplot. V praxi přicházejí v úvahu dvě řešení – hlubokomrazicí boxy s teplotou -80 °C a kapalný dusík (či jeho páry) s teplotou -196 °C, resp. -160 °C. Výhodou prvního je relativně nízká pořizovací cena a možnost postupného rozšiřování o další zařízení. Nevýhodou je extrémní závislost na stabilní dodávce elektrické energie a na bezporuchovém provozu samotného boxu. K nežádoucím událostem typu poruchy či výpadku proudu sice dochází relativně řídce, ale pokud nastanou, pak dojde k naprostému znehodnocení všeho uloženého materiálu. Materiál, který rozmrzne, je během několika hodin působením uvolněných enzymů zcela degradován. Druhou – i když relativně méně závažnou – nevýhodou je vyšší skladovací teplota. Je prokázáno, že vzorky jsou v kapalném dusíku v dlouhodobém horizontu (měsíců a let) stabilnější a poskytují vyšší a kvalitnější výtěžky při izolaci nukleových kyselin i proteinů. Třetím nepříjemným atributem je ohřívání okolního prostředí provozem mrazicích boxů (ty přitom smějí pracovat pouze v limitovaných okolních teplotách, jinak hrozí jejich poškození). Může si vynutit instalaci dodatečné klimatizace. Systém používající k uskladnění kapalný dusík je oproti předchozímu několikanásobně náročnější na vstupní investice – kromě samotného skladovacího zařízení je nutno instalovat detektor hladiny kyslíku, alarm a krizové provětrávání prostorů (k ochraně obsluhy před nedostatkem kyslíku – dusík není jedovatý ani hořlavý, při odpařování však vytěsňuje vzduch), vyřešit logistiku pravidelného zásobování velkými objemy kapalného plynu (příjezdové komunikace, bezprahový pohyb k převážení zásobníků atd.) a proškolit personál v zacházení s medicinálními plyny a zařízením s nebezpečně nízkými teplotami. Výhodou je spolehlivé a kvalitní uchování vzorků, nezávislé na dodávce elektrické energie. I při výpadku dodávky dusíku kontejnery uchovají stabilní teplotu po mnoho dní. Kromě toho odlišná konstrukce dusíkových kontejnerů umožňuje skladování mnohem většího počtu vzorků než na stejné ploše instalované mrazicí boxy. Systém je robustnější i vůči chybám obsluhy. Oba systémy vyžadují instalaci monitoringu a alarmu, nejlépe GSM sítěmi automaticky oznamujícího obsluze nastalý problém.

Součástí standardních operačních procesů BB by měly být postupy pro kontrolu kvality uchovávaného materiálu, například měření fragmentace izolované RNA, které vypovídá o dodržení podmínek preanalytické fáze.

Vydávání nádorové tkáně

Předání uloženého biologického materiálu k použití ve vědě a výzkumu je samotným smyslem existence BB. Tento krok je nutno dobře zvládnout po stránce organizační a smluvní, stejně jako po stránce technické. Každá BB, ať již funguje samostatně či v rámci infrastrukturální sítě, by měla definovat a zveřejnit, jaký materiál a jaká data uchovává, za jakých podmínek je vydává a které subjekty jsou oprávněny žádat o vydání materiálu. Takovéto transparentní definování politiky BB je nezbytné, aby nevznikaly tlaky a neshody při kolizi více požadavků na vydání téhož typu materiálu. Každá BB by měla mít ustavený poradní orgán („scientific board“), který bude jednotlivé žádosti posuzovat podle předem daných kritérií a rozhodovat o vydání či nevydání materiálu. Takovými kritérii mohou být např. očekávaný publikační dopad projektu, zkušenost řešitelského týmu, chyby v samotném designu studie apod. Je také vhodné, aby BB nabízela službu předběžného zjištění dostupnosti materiálu. Zájemce o podání grantového projektu tak může před sepsáním žádosti oslovit BB s dotazem, zda disponuje potřebným množstvím vzorků o definovaných vlastnostech, jako jsou histologický typ nádoru, stadium, známé molekulární parametry (např. určitý status Her-2 u karcinomu prsu či RAS mutace u karcinomu kolorekta, shromážděná data o terapii a přežití aj.). Je též možné požádat BB o předběžné posouzení projektu, a tak se vyvarovat nepříjemné situace, kdy přidělený grantový projekt nebude možné řešit z důvodu zamítnutí žádosti o biologický materiál. V případě, že vydání BB v definitivním posouzení schválí, musejí být smluvně definovány podmínky, za kterých řešitel projektu bude se vzorky a daty nakládat. Takový smluvní vztah („Material Transfer Agreement“) zejména definuje vlastnictví materiálu a dat, zavazuje BB k jejich vydání na základě schválené žádosti, příjemce pak zavazuje např. k použití pouze ke schválenému účelu, neposkytnutí materiálu ani jeho derivátů třetím stranám, k nakládání s materiálem jako s biologicky nebezpečným, k dodržování pravidel zveřejnění výsledků výzkumu a zejména k uvedení dedikace příslušné BB v každé publikaci [6]. Součástí tohoto ujednání může být také uhrazení nákladů spojených se sběrem, skladováním a vydáním vzorků.

Samotný proces předání materiálu je relativně snadný. Vyhledání jednoho alikvotu od každého vzorku, jeho vyzvednutí z úložiště a přemístění do transportní nádoby s nízkou teplotou je záležitostí několika hodin až dnů. Poskytování dat slouží jednak účelům samotného výzkumu (vlastnosti vzorku a charakteristiky pacienta), jednak účelům identifikace vzorku (přiřazení identifikačního čísla vzorku i datovým záznamům)[7]. Samozřejmostí je anonymizace dat.

Závěr

Biobankovnictví je klíčová infrastruktura v translačním biomedicínském výzkumu. Správné fungování biobanky vyžaduje úzkou spolupráci mnoha medicínských, biologických, informačních a dalších oborů. Jako optimální pro maximální využití potenciálu biobank se jeví vzájemné propojení („networking“) a maximální harmonizace postupů. Podmínkou odběru do BB je informovaný souhlas nemocného. Při odběru tkání je nezbytná flexibilní spolupráce chirurga a patologa, zejména na rychlosti transferu materiálu ze sálu na patologii. Odběr vzorků pro biobankovnictví je integrální součástí procesu histopatologické diagnostiky a výlučně náleží do rukou patologa. Skladování vzorků a shromažďování dat vyžadují značné finanční zdroje, jejichž dlouhodobé pokrytí je podmínkou udržitelného rozvoje biobankovnictví. Podmínky pro souhlas s vydáním materiálu a dat musejí být transparentně definovány, součástí tohoto procesu je uzavření smluvního vztahu („Material Transfer Agreement“) mezi biobankou a příjemcem. Anonymizace dat, ochrana osobních a citlivých informací jsou podmínkou dodržení legálního a etického rámce biobankovnictví.

MUDr. Pavel Fabian, Ph.D.

Oddělení onkologické patologie,

Masarykův onkologický ústav Žlutý kopec 7

656 53 Brnoe-mail: fabian@mou.cz