Proteom seminální plazmy u mužů s azoospermií

Seminal plasma proteome in men with azoospermia

Objective:
Seminal plasma is a potential source of biomarkers of many disorders of male reproductive organs. Identification and characterization of individual proteins in seminal plasma could be a useful tool for estimating male infertility. The aim of the study was to analyze proteome differences in men with azoospermia and normospermia.

Material and methods:
Samples of seminal plasma from men with azoospermia and normospermia were collected and cryopreserved in liquid nitrogen. Detergent CHAPS was used to solubilize the sample proteins. Two dimensional (2-D) gel electrophoresis was used to separate protein isolates. Immobilized gradient pH 3–10 NL was used for isoelectric focusation and 12% SDS-PAGE was used for second dimension. Sypro Ruby dye was used to stain the proteins. Software PDQuest was used to analyze quantitative and qualitative differences. Selected proteins were digested by trypsin and identified by MALDI-MS/MS or LC-MS/MS and (using) the Mascot software.

Results:
Six azoospermia and six normospermia samples were analyzed. Minimal differences in proteomic profile were found among normospermia samples. Significant quantitative and qualitative differences were detected between men with normospermia and azoospermia. Image analysis and mass spectrometry identified eighteen different proteins.

Conclusion:
Eighteen proteins were found that could serve as potential markers of azoospermia. These results provide an important basis for comparative proteomics of infertility and oxidative stress.

Key words:
proteome – male infertility – azoospermia – oxidative stress

Autori: I. Crha ¹ ; H. Konečná ² ; J. Žáková ¹; J. Buršíková ²; Z. Zdráhal ²; E. Lousová ¹; P. Ventruba ¹; M. Pohanka ¹
Pôsobisko autorov: Gynekologicko-porodnická klinika, LF MU a FN Brno ¹; Oddělení funkční genomiky a proteomiky, Přírodovědecká fakulta a CEITEC, Masarykova univerzita, Brno ²
Vyšlo v časopise: Prakt Gyn 2011; 15(2): 60-63
Kategória: Original Article

Súhrn

Cíl:
Seminální plazma obsahuje proteiny, které jsou důležitými markery patologií reprodukčního ústrojí. Cílem práce je analyzovat rozdíly detekované v proteomu seminální plazmy mužů s azoospermií a dárců spermatu.

Materiál a metodika:
Vzorky seminální plazmy byly získány standardním postupem od mužů s azoospermií a dárců spermatu a zamrazeny v kapalném dusíku. Proteiny ve vzorcích byly solubilizovány lyzačním pufrem obsahujícím detergent CHAPS. Výsledné proteinové izoláty byly separovány dvourozměrnou gelovou elektroforézou (2-DE). V prvním rozměru byl pro izoelektrickou fokusaci použit imobilizovaný gradient pH 3–10 NL, pro dělení v druhém rozměru 12 % SDS-PAGE. Proteiny v gelu byly barveny fluorescenčním barvivem Sypro Ruby. Kvalitativní a kvantitativní rozdíly mezi jednotlivými vzorky byly vyhodnoceny pomocí programu PDQuest. Proteiny ve vybraných spotech vykazující rozdíly byly následně štěpeny trypsinem a identifikovány pomocí MALDI-MS/MS (resp. LC-MS/MS) a vyhodnocovacího programu Mascot.

Výsledky:
Vyšetření byla provedena na vzorcích od 6 dárců spermatu a 6 mužů s azoospermií. V proteomu dárců spermatu s normospermií byly nalezeny minimální rozdíly, mezi dárci spermatu a skupinou pacientů s azoospermií byly zjištěny četné kvalitativní a kvantitativní rozdíly. Na základě výsledků analýzy obrazu bylo pomocí hmotnostní spektrometrie identifikováno 18 kvalitativně odlišných proteinů.

Závěr:
Bylo nalezeno 18 kandidátních proteinů, které mohou být potenciálními biomarkery azoospermie. Komparativní proteomika je perspektivním nástrojem výzkumu poruch plodnosti a oxidačního stresu.

Klíčová slova:
proteom – neplodnost – azoospermie – oxidační stress

Použité zkratky:

2-DE	dvourozměrná gelová elektroforéza
CHAPS	3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate
DTT	dithiotreitol
IEF	izoelektrická fokusace
%T	celková koncentrace akrylamidu v gelu
SDS-PAGE	polyakrylamidová gelová elektroforéza v dodecylsulfátu sodném
MALDI-MS/MS	matrix-assisted laser desorption/ionization tandemová hmotnostní spektrometrie
LC-MS/MS	kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií

Úvod

Seminální plazma je důležitou složkou spermatu, vytváří „životní prostředí pro spermie“. Obsahuje mnoho proteinů, jejichž zdrojem je varle, nadvarle a přídatné žlázy. Vyskytují se v něm mimo jiné proteiny, které jsou důležitými markery patologií reprodukčního ústrojí. Patologie spermatu jsou spojeny s rozdílnou expresí proteinů přítomných v seminální plazmě. Technologie dvourozměrné gelové elektroforézy kombinovaná s identifikačními možnostmi hmotnostní spektrometrie byla úspěšně aplikována na komplexní proteom spermatu [1]. Cílem práce je analyzovat rozdíly detekované v proteomu seminální plazmy mužů s azoospermií a dárců spermatu.

Materiál a metodika

Vzorky seminální plazmy byly získány standardním postupem od mužů s azoospermií a dárců spermatu a zamrazeny v kapalném dusíku. Byly použity vzorky spermatu dárců s normospermií a mužů s opakovaně diagnostikovanou azoospermií vyšetřovaných v andrologické laboratoři Centra asistované reprodukce FN Brno. Ejakulát byl získán pomocí masturbace do polypropylenových nádobek v odběrové místnosti centra, a to po abstinenci 3–5 dnů. Analýza spermatu byla provedena podle manuálu WHO [2]. Pro stanovení počtu spermií byla použita Neubauerova komůrka. Centrifugací (2 790g po 10 min) byla odstraněna seminální plazma, zamrazena v tekutém dusíku a transportována do Centrální laboratoře Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity.

Proteiny ve vzorcích byly solubilizovány lyzačním pufrem obsahujícím detergent CHAPS, močovinu, thiomočovinu a DTT. Výsledné proteinové izoláty byly separovány dvourozměrnou gelovou elektroforézou. V prvním rozměru byl pro izoelektrickou fokusaci použit imobilizovaný nelineární gradient pH 3–10 NL, pro dělení v druhém rozměru 12 % SDS-PAGE. Separovanéproteiny v gelu byly barveny fluorescenčním barvivem Sypro Ruby, které umožňuje nejenom lokalizaci, ale i kvantifikaci proteinu. Byla provedena počítačová analýza obrazu a kvalitativní a kvantitativní rozdíly mezi jednotlivými vzorky byly vyhodnoceny pomocí programu PDQuest. Proteiny ve vybraných spotech vykazujícíchrozdíly byly následně roboticky vyřezány a štěpeny trypsinem (in-gel digesce). Proteolyticky naštěpené peptidy příslušející proteinům z jednotlivých spotů byly analyzovány pomocí MALDI-MS/MS, resp. LC-MS/MS. K identifikaci proteinů na základě získaných MS/MS dat bylo použito programu Mascot.

Výsledky

Vyšetření byla provedena na vzorcích od 6 dárců spermatu a 6 mužů s azoospermií. V proteomu dárců spermatu s normospermií byly nalezeny minimální rozdíly sledovaných spotů (obr. 1 a, b). Mezi dárci spermatu a skupinou pacientů s azoospermií byly zjištěny četné kvalitativní a kvantitativní rozdíly (obr. 2 a 3). Na základě výsledků analýzy obrazu byly pomocí hmotnostní spektrometrie identifikovány kvalitativně odlišné proteiny (tab. 1 a, b).

Obr. 1. a, b. Porovnání vyšetření 2 vzorků normospermie vs. normospermie – bez zřejmých rozdílů (2-DE seminální plazma, IEF 3–10 NL, SDS-PAGE 12 % T dva paralelní velké gely. Barvení: Sypro Ruby).

Obr. 2. a, b. Vyhodnocení rozdílných spotů u vzorků azoospermie pomocí software PDQuest (2-DE seminální plazma, IEF 3–10 NL, SDS-PAGE 12 % T dva paralelní velké gely. Barvení: Sypro Ruby).

**Obr. 3. a, b. Vyznačení rozdílných spotů ve vzorku azoospermie a normospermie (2-DE seminální plazma, IEF 3–10 NL, SDS-PAGE 12 % T dva paralelní velké gely. Barvení: Sypro Ruby).**

**Tab. 1 a. Přehled proteinů identifikovaných v seminální plazmě vzorků s normospermií (proteiny popsané v literatuře jsou označeny*).**

**Tab. 1 b. Přehled proteinů identifikovaných v seminální plazmě vzorků s azoospermií (proteiny popsané v literatuře jsou označeny*).**

Z námi prokázaných rozdílů ve vyšetřených proteinech již byly některé dříve publikovány – např. prolactin-induced protein, epididymal secretory protein (E12), prekurzor epididymálního sekrečního proteinu E1, annexin A4 a annexin A11. Námi zjištěné významné rozdíly v prostatic binding proteinu, glutathione transferáze T1, alpha-1-acid glycoproteinu, apolipoproteinu D a laktátdehydrogenáze B nebyly v dostupné literatuře nalezeny.

Diskuze

V pečlivě provedené studii rozdílů v proteomu seminální plazmy u mužů s astenospermií byly prokázány významné rozdíly v 17 identifikovaných proteinech. Heat shock-related protein byl zvýšen, množství histonu H2A a cytoskeletálního aktinu bylo sníženo [3].

Ve srovnávací studii interindividuálních rozdílů v proteomu seminální plazmy mužů s normospermií a azoospermií byly identifikovány markery neobstrukční (např. epididymal secretory protein E1, stabilin 2, prolactin-inducible protein) a jeden marker obstrukční azoospermie (guanine nucleotide-releasing protein) [4].

Katalogy proteinů a spermie i proteomu seminální plazmy umožňují referenční porovnání individuálních hodnot a identifikaci proteinu. Představují začátek nové éry výzkumu poruch plodnosti. Relativním omezením je v současné době dostupnost zařízení, které je schopno hmotnostní spektrometrii spolehlivě provádět. V univerzitních zařízeních se dostupnost těchto technologií zvyšuje a zároveň klesají i náklady na tato vyšetření.

Dalším důležitým krokem pro klinické využití proteomu bude stanovení funkce jednotlivých proteinů a jejich podílu na snížení plodnosti. Zajímavé výsledky mohou přinést také studie sledující oxidační stres a kvantitativní a kvalitativní změny jednotlivých proteinů [5–7].

Z klinického hlediska je důležité charakterizovat souvislosti mezi reparačními mechanizmy DNA a její integritou [8].

Závěr

Byly nalezeny kandidátní proteiny, které mohou být významnými biomarkery azoospermie. Vyšetření proteomu seminální plazmy přináší nové možnosti poznání patologie spermatu. Komparativní proteomika je perspektivním nástrojem výzkumu poruch plodnosti a oxidačního stresu.

Podpořeno projekty Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (MSM 0021622415 a 2B08060) a grantem IGA MZ ČR NS/9661–4.

doc. MUDr. Igor Crha, CSc.
Gynekologicko-porodnická klinika, LF MU a FN Brno
icrha@fnbrno.cz

Zdroje

1. Nixon B, Aitken RJ. Proteomics of human spermatozoa. In: Krause WK, Naz RK (eds). Immune infertility: The impact of immune reactions on human infertility. Heidelberg: Springer-Verlag 2009.

2. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen. 5th ed. Ženeva: World Health Organization 2010.

3. Martínez-Heredia J, de Mateo S, Vidal-Taboada JM et al. Identification of proteomic differences in asthenozoospermic sperm samples. Hum Reprod 2008; 23(4): 783–791.

4. Yamakawa K, Yoshida K, Nishikawa H et al. Comparative analysis of interindividual variations in the seminal plasma proteome of fertile men with identification of potential markers for azoospermia in infertile patients. J Androl 2007; 28(6): 858–865.

5. Oborná I, Fingerová F, Hajdúch M et al. Lykopen v terapii mužské plodosti. Čes Gynek 2007; 72(5): 326–329.

6. Oborna I, Wojewodka G, De Sanctis JB et al. Increased lipid peroxidation and abnormal fatty acid profiles in seminal and blood plasma of normozoospermic males from infertile couples. Hum Reprod 2010; 25(2): 308–316.

7. Crha I, Kralikova M, Melounova J et al. Seminal plasma homocysteine, folate and cobalamin in men with obstructive and non-obstructive azoospermia. J Assist Reprod Genet 2010; 27(9–10): 533–538.

8. Oliva R, Martínez-Heredia J, Estanyol JM. Proteomics in the study of the sperm cell composition, differentiation and function. Syst Biol Reprod Med 2008; 54(1): 23–36.