Studium mechanických vlastností s využitím mikroskopie atomárních sil

Súhrn

Mikroskopie atomárních sil (AFM) se řadí mezi moderní zobrazovací techniky, které poskytují obraz v subnanometrickém rozlišení. Na rozdíl od ostatních technik ji lze použít i v kapalinách, které imitují přirozené prostředí, což je obzvlášť výhodné při studiu biologických vzorků. Od roku 1986 se vyvinula v univerzální nástroj, který kromě výškového zobrazení poskytuje mapy elastických a viskoelastických vlastností. Naše práce má za úkol představit nové techniky zabývající se studiem mechanických vlastností buněk – Peak Force Tapping a Stiffness tomography. Oba přístupy reprezentují jedinečný způsob práce se silovými křivkami, které jsou základem pro určení mechanických vlastností.

Klíčová slova:
mikroskopie atomárních sil, mechanické vlastnosti, Peak Force Tapping, Stiffness tomography

Úvod

Obecně přijímané tvrzení je, že struktura buňky určuje její funkci. Nicméně struktura není jediný definující faktor, patří mezi ně i chemické složení a mechanické vlastnosti. Buňka během svého života interaguje s vnějším prostředím např. změnou složení buněčných membrán [1] či reorganizací cytoskeletálního systému [2], které se projevují změnou mechanických vlastností [3-5]. Ke správnému určení mechanických vlastností je však potřeba použít vhodný nástroj. Jedním z nejúčinnějších je mikroskop atomárních sil (AFM) [6, 7]. AFM umožňuje více než jen topografické zobrazení zkoumaného vzorku, ale také detekci mechanických vlastností za fyziologických podmínek. AFM může být použito k dynamickému sledování změn tvaru buňky a změny mechanických vlastností například v průběhu farmakologické terapie [8, 9]. K měření mechanických vlastností je možné použít i jiné techniky, jako jsou mikropipety či optické tweezery [10-12].

Princip AFM není komplikovaný. AFM využívá silové interakce mezi ostrým hrotem umístěným na pružném nosníku a povrchem vzorku. Tyto interakce jsou během skenu zaznamenávány a na jejich základě je rekonstruován výsledný obraz. Pro zobrazení buněčných částí i celých buněk se nejčastěji používají dva zobrazovací módy [13]. V prvním, kontaktním módu, je hrot v přímém kontaktu s povrchem vzorku. Jejich vzájemná interakce způsobuje ohnutí nosníku, které je následně detekováno optickým systémem. Tento signál je využit ve zpětnovazebné smyčce, která usměrňuje napětí na piezoelektrických prvcích a reguluje tak vzájemné silové působení. V druhém, poklepovém (tapping) módu kmitá hrot blízko své rezonanční frekvence. Během skenu dochází k útlumu jednotlivých oscilací, jež jsou závislé na silové interakci mezi vzorkem a hrotem. Pomocí zpětnovazebné smyčky je obnovována jejich amplituda. Výhodou tapping módu je redukce laterálních sil, neboť dochází pouze k letmému dotyku s povrchem [13, 14].

V makroskopickém měřítku jsou mechanické vlastnosti podstatné pro funkci jednotlivých tkání, jako jsou kosti, šlachy nebo zuby. Lze tedy předpokládat, že mají vliv i na mikroskopické úrovni. Určením vlastností jednotlivých biomolekul lze zjistit vliv na samotný celek. Je také známo, že aktuální fyziologický stav systému se projevuje v jednotlivých buněčných charakteristikách. Mělo by tedy být možné korelovat změnu mechanickou se změnou strukturální [15].

Nanoindentace patří mezi běžné metody používané ke zjištění mechanických vlastností. Během tohoto procesu je vtlačen tuhý a ostrý hrot do vzorku, přičemž je zaznamenávána použitá síla a hloubka vrypu [16]. Na měření má vliv geometrie hrotu, hloubka penetrace a rychlost průtlaků. Záznam těchto vrypů, tzv. force-displacement curves (F-d křivky), je vyhodnocován pomocí mnoha různých teoretických a empirických modelů. Velmi rozšířená je Hertzova teorie [17], která předpokládá kontakt dvou sférických těles. Pro její platnost je třeba zohlednit několik aspektů: nedochází zde ke tření, oblast kontaktu je malá vzhledem k celkovým rozměrům těles a stlačitelnost je minimální. Jeden z nejdůležitějších předpokladů je absence adhezních či povrchových sil [18]. Působící síla je definována jako:

kde δ je hloubka vrypu, ν Poissonův poměr, R poloměr zakřivení hrotu a E je modul pružnosti. Kromě Hertzova modelu se často využívá i jeho modifikace pro kónický tvar hrotu, také znám jako Sneddonův model [19]

kde α je vrcholový úhel hrotu. Mezi modely, jež započítávají adhezi, patří Johnson-Kindal-Roberts (JKR) [20], Dejaguin-Müller-Toporov (DMT) [21] či Oliver-Pharr [22]. Při určení elasticity je potřeba věnovat pozornost typu kontaktu, správnému určení konstanty pružnosti hrotu a přesnému určení geometrie hrotu.

Peak Force Tapping

Peak Force Tapping je nový operační mód vyvinutý firmou Bruker. Stejně jako jeho předchůdce HarmoniX dokáže pracovat s širokou nabídkou standartních hrotů. Peak Force Tapping zobrazuje vzorek relativně rychle, podobně jako u poklepového módu, přičemž si zachovává vysokou rozlišovací schopnost. Primárně hrot osciluje v z-piezu s frekvencí 2 kHz, je však možné navolit i nižší frekvenci – 1, 0,5 a 0,25 kHz, a s amplitudou až 2 000 nm. Typický průběh jednoho cyklu znázorňuje obrázek 1. V bodě A, kdy hrot je dostatečně vzdálen od povrchu, působí jen nepatrné síly. Při přibližování hrotu k povrchu začnou na hrot působit přitažlivé síly (van der Waalsovy, elektrické a kapilární). V bodě B se hrot dotýká povrchu vzorku, přičemž hrot je stále na sestupné dráze a síla působící na vzorek se zvyšuje až do bodu C. Bod C je tzv. Peak Force. Hrot se začíná odtahovat a působící síla klesá, než dosáhne svého minima v bodě D. Z tohoto bodu je určena adheze vzorku. Hrot přestává být v kontaktu s povrchem vzorku a dále na něj působí pouze dalekosáhlé síly. Konstantní hodnota síly v bodě C je udržována zpětnovazebnou smyčkou. Závislost působící síly a Z-ové pozice lze porovnat s běžnou F-d křivkou, která se používá pro měření mechanických vlastností. Peak Force Tapping je mnohem rychlejší než běžná nanoindentace, kde jeden cyklus probíhá s frekvencí 0,5–10 Hz [23]. Obrázek zobrazuje způsob získávání jednotlivých charakteristik jako je modul pružnosti, adheze, disipační energie a maximální deformace. Takto získané informace se zobrazují pomocí barevných map jednotlivých vlastností v určitém datovém kanálu [24, 25].

Peak Force Tapping byl použit ke studiu různých biologických vzorků – amyloidních vláken [23, 26], rozsivky [27], živých a fixovanýych buněk osteosarkomu (U2-OS) [28], bakterií S. aureus [29]. Dle Sweerse a kol. jsou nanoindentace, HarmoniX a Peak Force Tapping zaměnitelné operační módy, neboť poskytují velmi blízké hodnoty elasticity [23]. Výhodou Peak Force Tappingu je možnost jejího užití pro různé vzorky, souběžné získání mechanických vlastností a topografie bez nutnosti dodatečného zpracování získaných dat, a nízké silové působení jen několik pN [26].

Modul pružnosti

Modul pružnosti (Youngův modul) v Peak Force Tapping (obr. 3A) je získán fitováním oddalující se křivky na model Derjaguin-Müller-Toporov (DMT model) [21]:

kde F – F_adh je interakční síla v závislosti na adhezi, R je poloměr hrotu, d – d₀ je deformace vzorku a E* je redukovaný Youngův modul. Pokud je znám Poissonův poměr, software přímo vypočítá Youngův modul dle

kde ν_s je Poissonův poměr vzroku, ν_tip je Poissonův poměr hrotu, E_s je Youngův modul vzorku a E_tip je Youngův modul hrotu. Pro buňky je Poissonův poměr volen 0,5 (dokonale nestlačitelné).

Adheze

Adhezní síly (obr. 3B) patří vedle modulu pružnosti k často stanovaným charakteristikám. Jak již bylo zmíněno, adheze je určena minimem na obrázku 2. Podstata adheze spočívá v jakékoli přitažlivé síle mezi hrotem a vzorkem. Pokud je hrot modifikován, podstata adhezních sil se mění a odráží chemické složení vzorku.

Disipační energie

Disipační energie (obr. 3C) je dána součinem síly a rychlosti integrovaná po dobu jednoho cyklu Peak Force

kde W je disipační energie jednoho cyklu, F je silová interakce a dZ je posunutí ve směru osy z. Z důvodu opačného směru vektorů pohybu ve směru osy z a rychlosti může být integrace nulová, pokud křivky přiblížení a oddálení se překrývají, proto je disipační energie rovna hysterezi mezi křivkami.

Deformace

Deformace (obr. 3D) je definovaná jako hloubka vrypu hrotu do povrchu vzorku v momentě největšího silového působení (peak force). Hodnota deformace obsahuje plastický i elastický příspěvek. Se znalostí jednotlivých parametrů hrotu a kontaktní oblasti lze tuto hodnotu deformace přepočítat na tuhost.

Stiffness tomography

Kromě nového způsobu získání F-d křivek je možné pro získání mechanických vlastností inovovat způsob jejich zpracování. Roduit a kol. [30, 31] přišli právě s takovou analýzou – stiffness tomography.

F-d křivka, záznam změny z-ové souřadnice hrotu v závislosti na působící síle, umožňuje určit Youngův modul pružnosti, pokud je znám tvar hrotu a Poissonův poměr měřeného vzorku. Systematickým rozdělením F-d křivky a aplikováním vhodného matematického modelu na každý segment lze získat mechanické vlastnosti napříč hloubkou vrypu. Během indentace lze pozorovat změnu tuhosti, a pokud tento proces aplikujeme na celý force volume sken, sken při kterém je v každém bodě zaznamenávána F-d křivka, lze kromě topografie vzorku získat informaci o pružnosti pod povrchem.

Pro provedení analýzy stiffness tomography je nejdříve potřeba získat F-d křivku, kdy hrot AFM je vtlačován do vzorku a je zaznamenávána změna ohybu nosníku. Poté je získaná křivka odečtena od křivky naměřené na tvrdém, nedeformovatelném povrchu jako je např. safírová destička. Následně je křivka rozdělena na jednotlivé segmenty, přičemž uživatel může volit velikost segmentů. Posledním krokem je fitování vhodně zvoleného teoretického modelu na jednotlivé segmenty křivky.

Hlavním rozdílem mezi standardní analýzou F-d křivek a stiffness tomography je aplikace teoretického modelu. U standardní analýzy je model fitován na celou křivku, u stiffness tomography je křivka nejdříve rozdělena a pak na každou část aplikován vybraný model. Takto získaná data představují 3D mapu pružnosti zkoumaného objektu. Mohou být zvýrazněné struktury, které by zanikly použitím standardní analýzy.

Roduit a kol. použili stiffness tomography k určení struktur pod povrchem fibroblastů (buněčná linie 293T) a makrofágů z linie monocytů THP-1 a jejich přispění k celkové tuhosti [31]. U makrofágů bylo zjištěno, že po podání cytochalasinu klesla tuhost na okraji buňky ze 132 kPa na 28 kPa (4,7 krát). Longo a kol. aplikovali stiffness tomography na bakterie E. coli, kde na buněčných membránách rozpoznali několik oblastí, které jsou tužší než okolní a Youngův modulus dosahuje až 20 MPa [32]. Umístění těchto tužších oblastí se však liší u jednotlivých bakterií.

Závěr

Během posledního desetiletí se AFM stalo široce používaným nástrojem ke studiu mechanických vlastností napříč různými vědeckými obory včetně oblasti živých systémů. Komplexnost biologických struktur však představuje nejednu výzvu při propojování experimentálních dat s teoretickými modely. Další faktory, které je třeba brát v úvahu, jsou geometrie hrotu a oblast kontaktu se vzorkem. Spolu s rostoucím počtem důkazů o propojení mechanických a chemických vlastností s biologickými funkcemi je potřeba zpřesnit jejich získání a následnou analýzu.

Poděkování

Tato práce byla podpořena projekty LF_2012_019, LF_2013_006 a Ústavem Molekulární a Translační Medicíny CZ.1.05/2.1.00/01.0030.

Jakub Malohlava, Mgr.

Ústav lékařské biofyziky

Lékařská fakulta

Univerzita Palackého v Olomouci

Hněvotínská 3, Olomouc 775 15

E-mail: jakub.malohlava@upol.cz

Tel.: +420 585 632 200