Čichová detekce karcinomu prostaty pomocí speciálně trénovaného psa ve vzorcích lidské moči

Súhrn

Karcinom prostaty je nejčastějším solidním zhoubným nádorem u mužů v řadě vyspělých zemí světa. V naší studii jsme hodnotili schopnost detekovat pravděpodobnost přítomnosti karcinomu prostaty (KP) ve vzorcích lidské moči čichem speciálně trénovaného psa. Definitivní potvrzení KP je vždy nutné ověřit histologicky. Jedním z alternativních biomarkerů, které pes v moči cítí, jsou pak VOC (volatile organic compounds). Předmětem našeho dalšího výzkumu bude zjišťování, na jakou látku v moči pes vlastně reaguje a díky tomu je schopen označit pozitivní vzorek.

Klíčová slova:
karcinom prostaty, VOC, výcvik psa clicker training, čichová detekce

Úvod

Karcinom prostaty je nejčastějším zhoubným nádorem u mužů v řadě vyspělých zemí světa a je po karcinomu plic nejčastějším solidním nádorem u mužské populace. Odhaduje se, že v Evropě je každoročně diagnostikováno 2,6 milionů nových případů karcinomu prostaty.

V dnešní době stále nemáme spolehlivější diagnostický marker, než je PSA prostatický specifický antigen [1,2]. Diagnóza se opírá o karcinom prokázaný histologicky ve vzorcích získaných při operaci, ve vzorcích biopsie prostaty nebo vzorcích aspirační cytologie prováděné jehlou [3–5].

Další biomarkery (je jich téměř stovka) nenašly své uplatnění v každodenní praxi a o jejich validitě jsou zapotřebí vypracovat další studie.

Jinou oblastí výzkumu jsou markery detekovatelné v moči. Výhodou je snadný odběr vzorků (moč spontánně vymočená či po předchozí masáži prostaty), v nichž stanovujeme přítomnost buněk karcinomu či jimi secernovaných produktů. Močové onkomarkery pro diagnostiku a monitoring KP jsou až na výjimky stále předmětem výzkumu.

Použití psů v diagnostice a detekci nádorů bylo zaznamenáno v roce 1989, kdy byl zaznamenán první případ: pes poprvé objevil melanom na noze svého pána [6]. Jedním z alternativních biomarkerů, které pes v moči cítí, jsou pak VOC (volatile organic compounds).

Nové VOC v moči jako prognostické faktory

VOC jsou organické sloučeniny antropogenního (vznikající činností člověka) původu schopné vytvářet fotochemické oxidanty reakcí s NOx v přítomnosti slunečního záření. Dělíme je na uhlovodíky a jejich deriváty (kyseliny, estery, étery, aldehydy, aminy, heterocykly, ketony). Svými účinky působí na smysly člověka i zvířat ve formě vůně a pachu [7].

V poslední dekádě prošla analýza VOC rychlým rozvojem, je perspektivní, ale náročná. Můžeme je detekovat pomocí sofistikovaných metod (plynová chromatografie, hmotnostní spektrometrie) nebo pomocí detekcí čichu zvířat, konkrétně psa [8].

Mnohé studie prokázaly extrémní čichové vlastnosti a schopnosti psů rozpoznat, odlišit a detekovat zhoubné onemocnění (karcinom močového měchýře, prsu, plic, žaludku, jater, melanom) nebo schizofrenii [9–11].

Idea použít VOC jako nástroj včasného záchytu zhoubného onemocnění kůže – melanomu – není novinkou [12]. Abaffy et al ve své studii potvrdili zvýšené hladiny kyseliny laurové (c12:0) a kyseliny palmitové (C16:0), které by mohly být zvýšené důsledkem up-regulované de novo syntéze tuků, známé charakteristice rakoviny kůže [13].

Spojitost karcinomu prostaty s VOC popsali ve své práci Cornu et al [14], Willis et al popsali spojitost VOC s karcinomem močového měchýře [9], Peng et al s karcinomem prostaty, kolorekta a plic [15]. V případě KP lze předpokládat, že v moči, která jeví známky maligního tumoru, budou přítomny specifické VOC. Schopnost psů detekovat nádory čichem je připisována molekulám VOC. Studie prokazují, že během růstu nádoru dochází ke změně proteinů v maligních buňkách, což způsobuje peroxidaci některých součástí buněčné membrány nádorové buňky s následnou produkcí VOC, kterou lze detekovat v předním prostoru buňky.

Proměnné organické látky v moči byly navrženy i jako potenciální biomarkery karcinomu prostaty.

Neměcký ovčák

Německý ovčák je silný, odvážný, obratný a inteligentní pes. Jedná se o nejrozšířenější služební plemeno na světě s nejbohatší škálou využití. Je to všestranně po­užitelný pes využívaný jako služební, strážní, pátrací pes, stejně jako ke službě záchranné, pro vodění slepců, k pasení dobytka i k nalézání drog [16,17].

Čichové schopnosti psů jsou asi milionkrát lepší než člověka. Úkolem výcviku je tyto dispozice účinně a cílevědomě rozvíjet a tříbit [18]. Člověk má cca 5 milionů čichových buněk, zatímco jezevčík jich má cca 125 milionů, foxteriér 147 milionů a německý ovčák cca 220 milionů [17].

Výcvik psa

Ve spolupráci s Oddělením chirurgie a ortopedie Kliniky chorob psů a koček na Veterinární a farmaceutické univerzitě Brno proběhl výcvik mladé feny německého ovčáka jménem Agáta. Do výcviku byla zařazena 3. 12. 2012. Výcvik probíhal využitím clicker tréninkové metody (obr. 1) [19].

Výcvik psů za pomoci metody clicker training

Clicker training je tréninková metoda, která se opírá o označení žádoucího chování a jeho odměňování (http://www.clicker­training.com).

Žádoucí chování je obvykle označeno pomocí ,,clickru“, mechanického zařízení, které vydává krátké, zřetelné ,cvaknutí, které upozorní zvíře, kdy přesně co dělá ­správně. Tato jasná forma komunikace, v kombinaci s pozitivním posilováním, je účinným, bezpečným a humánním způsobem, jak naučit každé zvíře jakékoli chování, které je fyzicky a psychicky schopné dělat [20].

Pacienti a odběr vzorků

Vzorky moči byly získány od pacientů Uro­logické kliniky FN Brno po jejich souhlase a také se souhlasem ředitelství FN Brno, pod kontrolou právního oddělení FN Brno.

Nejdříve probíhal odběr vzorků použitých k výcviku, a to soubor 105 pozitivních a 58 negativních vzorků.

U pacientů nebyly brány v potaz jiné malignity či přítomnost uroteliálního karcinomu. Neexistovala žádná vylučovací kritéria jako pozitivní osobní anamnéza, léky, cigarety, alkohol, stravovací návyky. Druhou testovanou skupinou byly vzorky moči od pacientů s klinickým nálezem, sus­pektní DRV (digitální rektální vyšetření) nebo elevací PSA (PSA 0,78–1 032 ng/ml, medián 5,4), kde o pozitivitě/negativitě rozhodlo bioptické vyšetření.

Odebrané vzorky od pacientů Uro­logické kliniky FN Brno byly převezeny na Veterinární a farmaceutickou univerzitu Brno, na Kliniku chorob psů a koček, oddělení chirurgie a ortopedie, kde byly použity buďto v čerstvém stavu (do 12 hod od odběru), nebo zamrazeny na teplotu –20 °C a před použitím k tréninku/testování byly pozvolna rozmrazeny na pokojovou teplotu.

Vlastní design studie

Dvojitě zaslepená fáze se skládala z nav­zájem po sobě jdoucích běhů. V každém z těchto běhů byly psovi předkládány tři vzorky moči (dva kontrolní, jeden KP). Vzorky moči byly v kelímcích a psovi bylo při správném označení (ulehnutí k vzorku) clickrem oznámeno, že dostane pamlsek (obr. 2). V případě chyby (pes si ulehl ke kelímku s negativním vzorkem a neoznačil kelímek s pozitivním vzorkem) byly negativní vzorky označeny jako falešně pozitivní a vzorek s KP jako falešně ­negativní.

U pacientů s falešně pozitivními vzorky bylo navrženo re-PBP. Celkem bylo testováno 45 pozitivních a 25 negativních vzorků.

Výsledky

Ze 70 testovaných vzorků pes označil 65 vzorků (40× KP, 25× neg.) správně a pět vzorků (2× KP, 3× neg.) nesprávně. Dá se tedy odhadnout, že pes je schopen čichem správně označit vzorek pacienta s KP s 93% pravděpodobností. Závislost úspěšného označení na jiných veličinách byla hodnocena pomocí korelační analýzy, přičemž byl vypočten korelační koeficient mezi:

1. stadiem nemoci TNM a hodnotou PSA – zde vyšla výsledná korelace na hodnotu cca 0,28, což znamená, že tyto dvě hodnoty spolu vzájemně nekorelují (aby se dalo hovořit o vzájemné korelaci, musela by hodnota korelačního koeficientu být vyšší než 0,3 a nejlépe se co nejvíce blížit 1),
2. kvalitou označení vzorku a hodnotou PSA – zde vyšel korelační koeficient cca 0,15, takže opět se nedá říct, že by tyto dvě veličiny spolu vzájemně korelovaly; vyšší hodnota PSA nemá vliv na kvalitnější označení vzorku psem,
3. kvalitou označení a stadiem nemoci TNM – zde korelační koeficient dosáhl hodnoty cca 0,19, takže opět není prokázána korelace mezi těmito veličinami; pokročilost stadia nemoci nemá vliv na kvalitu označení vzorku psem.

Diskuze

V naší práci jsme prokázali schopnost detekovat pravděpodobnost přítomnosti karcinomu prostaty ve vzorcích lidské moči pomocí čichu trénovaného psa.

Schopnost psů detekovat čichem je připisována molekulám VOC. Studie prokazují, že během růstu nádoru dochází ke změně proteinů v maligních buňkách, což způsobuje peroxidaci některých součástí buněčné membrány nádorové buňky s následnou produkcí VOC, kterou lze detekovat v předním prostoru buňky. Proměnné organické látky v moči byly navrženy i jako potenciální biomarkery karcinomu prostaty.

Willis et al prokázali detekci karcinomu močového měchýře na základě pachu moči pomocí šesti vycvičených psů. Z celkového souboru pacientů 54 (muži i ženy) psi správně zvolili moč u 22 pacientů, což je průměrná míra úspěšnosti 41 %. To znamená, že těkavé látky v moči u pacientů s karcinomem močového měchýře mají také charakteristickou vůni či pach a jsou odlišné od sekundárních projevů nádorů, jako je infekce, zánět či krvácení [9].

Slibné výsledky přicházejí ze studií zabývajících se rakovinou plic: zde byla VOC detekována ve vydechovaném vzduchu pacientů s tímto nádorem.

Peng et al zkoumali také VOC z vydechovaného vzduchu u pacientů s karcinomem prostaty, prsu, kolorekta a plic 177 pacientů před zahájením léčby [15]. Dech dobrovolníků byl vyhodnocen pomocí nanosenzorů s nanočásticemi zlata a pomocí plynové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (gas chromatography-mass spectrometry technique – GC-MS). Nanosenzor rozlišil různé vzory dechů u jednotlivých typů nádorů.

Na rozdíl od jiných onemocnění je u KP a VOC popsána jediná práce, kdy francouzští autoři použili psa, speciálně vycvičeného belgického ovčáka, který patřil francouzské armádě, k detekci KP z moči pomocí jeho čichu [9]. Celkové trvání tréninkové fáze od počátečního učení až po nezaslepenou fázi cvičení bylo 16 měsíců. Na výcvik psa byla použita metoda clicker training.

Pomocí dvojitě zaslepené studie francouzští autoři prokázali na souboru 66 pacientů (33 pacientů s BHP, 33 pacientů s KP, potvrzené punkční biopsií prostaty) správné označení u všech vzorků s KP, tedy u všech 33 pacientů. Tři pacienti klasifikovaní jako ,,falešně“ pozitivní následně podstoupili re-PBP: u jednoho z nich byl diagnostikován KP. Senzitivita a specificita byla 91 % [21].

Pes byl vysílán vždy k šesti vzorkům, kde byl vždy jeden pozitivní a ostatní negativní. V případě úspěchu si pes sednul před krabici se vzorkem močí s KP, výsledek byl označen za skutečně pozitivní a kontroly jako skutečně negativní. Za odměnu pes dostal balonek. V případě chyby (pes sedící před krabicí označenou jako kontrola) byly kontrolní vzorky označeny jako falešně pozitivní a vzorky s KP jako falešně negativní. Falešně pozitivní vzorek byl následně vyčleněn ze souboru kontrolních vzorků, které měly být použity pro další běhy a vzorky s KP byly následně znovu testovány společně s dalšími kontrolami. U pacientů s falešně pozitivními vzorky bylo navrženo re-PBP. Z výše zmíněného vyplývá, že během testovací fáze pes správně rozpoznal 63 z 66 vzorků.

Dr. Gianluigi Taverna z Humanitas Research Hospital v Miláně prezentoval výsledky detekce KP pomocí čichu na výročním zasedání Americké urologické asociace v Orlandu v květnu 2014. Jeho tým vycvičil pomocí metod „clicker“ a „imprinting“ dvě feny německého ovčáka. Analyzováno bylo 200 vzorků moči s KP a 230 vzorků kontrolních. Úspěšnost detekce byla u prvního psa 98 % a u druhého 96 %.

My jsme také prokázali, že speciálně cvičený pes toto dovede. Našich výsledků jsme dosáhli za pomoci jediného psa, německého ovčáka, feny. Její výcvik trval 12 měsíců a na výcvik psa jsme po­užili také clicker training stejně jako francouzští i italští autoři. Náš pes byl o hodně mladší a byl poměrně brzy začleněn do náročného tréninku. I přes poměrně krátkou dobu výcviku jsme dosáhli srovnatelných výsledků. V potaz bylo bráno i potenciální negativní ovlivnění detekce pachu v souvislosti s háráním feny. V této době se fena špatně soustředila na čichovou detekci a dělala při určování vzorků chyby. Tato negace je však zanedbatelná v kontextu s celkovým přínosem studie, který spočívá v detekci potenciálních biomarkerů za pomocí psů.

Závěr

V budoucnu bychom chtěli určitě v naší práci pokračovat. Vize projektu je zjistit, které konkrétní látky (VOC) pes při čichání cítí a úspěšnost detekce spojit se stadiem karcinomu prostaty. Možná detekce podezření na KP pomocí čichu speciálně trénovaného psa je prozatím metoda, kterou je potřeba dále zkoumat a rozvíjet, ale do budoucna je velmi slibná, protože otvírá dveře VOC jako potenciálního markeru prostaty. Je minimálně invazivní, umožňuje zvýšit přesnost testu PSA a rozeznat, u koho provést biopsii prostaty a u koho ne.

Předmětem našeho dalšího výzkumu bude zjišťování, na jakou látku v moči pes vlastně reaguje a díky tomu označí pozitivní vzorek.

Použití této metody v praxi by mohlo vést k eliminaci počtu biopsií. Metoda je neinvazivní pro pacienta, protože k celému procesu je nutný jen vzorek moči.

Výsledky naší studie mohou sloužit jako vodítko k dalším již rozběhlým metabolomickým studiím zaměřeným na VOC.

Tato práce byla podpořena START-UP grantem FN Brno 2014. 

MUDr. Vlasta Vyhnánková

Urologická klinika LF MU a FN Brno

Jihlavská 20, 625 00 Brno

vlasta.vyhnankova@fnbrno.cz