Utváření cévního řečiště: přehled molekulárních mechanismů a možnosti terapeutického ovlivnění

Súhrn

Článek podává aktuální přehled o molekulárních mechanismech tvorby cévního řečiště. Je podán přehled poznatků o růstových faktorech endotelu krevních cév a jejich receptorech na angiogenních a endotelových buňkách. Je popsán a vlastními experimenty dokumentován význam tkáňové hypoxie pro aktivaci produkce VEGF a novotvorbu cév. Jsou zmíněny nové poznatky o efrinech a jejich receptorech, které řídí diferenciaci tepenné a žilní části krevního řečiště a o ztrátě fenotypu žilního štěpu v arteriálním řečišti. Je uveden poznatek o mutaci Foxc2, která podmiňuje insuficienci žilních chlopní. Je popsán molekulární mechanismus objasňující společný průběh cév a nervů. Jsou zmíněny látky, které vaskularizaci tkání stimulují nebo naopak tlumí, a tak otevírají nové léčebné postupy.

Klíčová slova:
vaskulogeneze, angiogeneze, růstové faktory, hypoxie.

Úvod

Tvorba krevních cév je nezbytná jak pro vývoj embrya, tak pro regeneraci a procesy hojení v dospělosti, ale také pro růst nádoru. Poznání nejúčinnější molekuly, která růst cév ovlivňuje, přineslo studium nádorového růstu.Již v roce 1939 vyslovil Ide na základě výsledků svých pokusů domněnku, že buňky nádoru uvolňují faktory, které stimulují jeho vaskularizaci (1). O několik desetiletí později byla tato domněnka experimentálně potvrzena, když Folkman et al. (1971) izolovali „tumor angiogenic factor“. Současně vyslovili předpoklad, že nádory lze léčit blokádou této angiogenní látky (2). Takováto angiogenní látka byla izolována teprve v roce 1983 (3) a gen, který ji kóduje, byl identifikován v roce 1989 (4). Vyznačuje se specifickým mitogenním účinkem na angiogenní buňky a byla nazvána VEGF – Vascular Endothelial Growth Factor, růstový faktor cévního endotelu.

Poznání primární struktury VEGF umožnilo připravit specifickou myší anti-VEGF protilátku, která skutečně vykazovala inhibiční efekt in vivo (5). V roce 1997 byla připravena anti-VEGF protilátka, která se váže na lidské izoformy VEGF-A a jejich bioaktivní fragmenty (6). Byla nazvána bevacizumab a komerčně Avastin (Genentech). Prošla úspěšně klinickým testováním a v současnosti je Avastin používán jako lék první volby u metastazujícího kolorektálního karcinomu.

Na počátku 90. let minulého století byl poznán další významný faktor, který ovlivňuje tvorbu cév. Bylo zjištěno, že snížená tenze kyslíku ve tkáních má za následek zvýšenou expresi řady genů včetně VEGF. Vyvolávají ji faktory indukované hypoxií (HIF) (7). Zabývali jsme se studiem této kaskády a jejího významu pro embryonální růst cév, kdy je sycení tkání kyslíkem nižší než v dospělosti, a ukázali jsme, že mírná hypoxie se uplatňuje jako jeden z řídících faktorů vaskularizace embryonálních základů orgánů (8, 9).

Moderní metody studia rozšířily poznatky o faktorech, které řídí utváření cévního řečiště, a otevřely tak cestu k terapeutickému uplatnění látek, které vaskularizaci tkání stimulují nebo naopak tlumí. Problematika tvorby krevních cév se tak stala aktuálním tématem také v klinické medicíně.

Vznik a přestavba cévního řečiště

Základní stavební a funkční jednotkou cévního řečiště je endotelová buňka. Vzniká z prekurzorových buněk, angioblastů, jejichž diferenciace z buněk mesodermu je indukována buněčnými interakcemi, podobně jako při diferenciaci dalších buněčných linií v mnohobuněčném organismu. Angioblasty a endotelové buňky exprimují receptor růstového faktoru cévního endotelu (VEGFR2) a mají specifickou schopnost tvořit trubice a luminizované výběžky těchto trubic. Mechanismus, který se přitom uplatňuje, není dosud jednoznačně objasněn. V současné době převažuje názor, že cévní dutina vzniká z navzájem se propojujících intracelulárních vakuol (10). Alternativou zůstává vznik cévního lumen z extracelulárního prostoru (11).

První cévy vznikají spojováním krevních ostrůvků v mezodermu stěny žloutkového váčku, zárodečného stvolu a choria. Buňky krevních ostrůvků (hemangioblasty) mají dvojí vývojový potenciál. V centru ostrůvku se nacházejí výchozí buňky extraembryonální krvetvorby (hemoblasty) a stěnu ostrůvku tvoří prekurzory endotelových buněk (angioblasty). Ostrůvky se vzájemně propojují za vzniku pletení a trubic, které vrůstají do embrya, kde se spojují s cévami, které se tvoří ve vlastním embryu (12).

Intraembryonální angioblasty se diferencují z paraaxiálního mezodermu a z mezodermu splanchnopleury. Jejich diferenciaci navozují signální molekuly produkované buňkami entodermu a buňkami chorda dorsalis. Angioblasty tvoří nejprve primitivní sítě a pruhy, ve kterých záhy vzniká lumen, napojují se na srdce a tvoří základy velkých axiálních cév. Stěna těchto cév je zpočátku tvořena pouze endotelem. U člověka v nich proudí krev od 4. týdne a hemodynamika se uplatňuje jako jeden z formujících faktorů jejich vývoje (12). Další angioblasty, které se diferencují v paraaxiálním mezodermu, migrují do stěny trupu a do základů končetin dříve, než vytvoří definitivní cévy (13, 14). Vývoj primárních extra- a intra-embryonálních pletení a cév z angioblastů je označován termínem vaskulogeneze (obr. 1). Další fází vývoje je remodelace primárního cévního řečiště a jeho pokračující růst označovaný termínem angiogeneze. Spočívá v rychlé proliferaci endotelových buněk a v jejich pučení (sprouting) ze stěny již existujících cév. Angiogeneze je spojena s diferenciací stěny artérií a vén. Z buněk okolního mezenchymu se diferencují pericyty a hladké svalové buňky. Jejich interakce s endotelovými buňkami je zprostředkována signalizací mezi angiopoietiny a Tie receptory. Postupně se tak diferencují další složky cévní stěny.

Lymfatické cévy se začínají tvořit o několik dní později než krevní cévy. Jejich diferenciaci navozuje exprese transkripčního faktoru Prox-1. Hluboké lymfatické cévy vznikají z endotelu velkých žil a povrchové cévy zřejmě také z lymfatických angiogenních prekursorů (15). Pro endotel lymfatických cév je typická exprese receptoru VEGFR3, na který se váže růstový faktor VEGF-C.

V dospělosti může být cévní řečiště přestavováno procesem, který je nazýván arteriogeneze (16). Je to rychlá proliferace malých kolaterálních tepen a jejich transformace ve větší přívodné tepny navozená postupně vznikajícím uzávěrem hlavní cévy. Je vyvolána hemodynamickým a mechanickým stresem (shear stress), který vede k akumulaci aktivovaných monocytů a makrofágů na poškozeném endotelu a k produkci řady cytokinů (MCP-1, GM-CSF, TGF-β, FGF-2), které stimulují částečnou degradaci původní arterioly a současně také proliferaci endotelových a hladkých svalových buněk. Arteriogeneze není provázena zvýšenou expresí VEGF a jeho receptorů a podání VEGF ji významněji neovlivňuje.

Růstové faktory cévního endotelu a jejich receptory

Proliferace a diferenciace angiogenních buněk je řízena růstovými faktory z rodiny VEGF. Do této rodiny patří VEGF-A–E, dále růstový faktor krevních destiček (PDGF) a placentární růstový faktor (PlGF). Jednotlivé faktory se vyznačují určitými specifickými vlastnostmi, i když se svým vlivem na růst cév zčásti překrývají (17).

VEGF-A se uplatňuje jako mitogen, který zároveň stimuluje endotelové buňky k degradaci extracelulární matrix, k migraci, k jejich diferenciaci a tvorbě cévních trubic. Zvyšuje také permeabilitu cév a indukuje antiapoptotické proteiny. Byly popsány různé formy VEGF-A (díky alternativnímu sestřihu), pro které je charakteristická orgánově specifická distribuce. Menší molekuly volně difundují, větší jsou vázány na extracelulární matrix. Za vývoje je VEGF-A exprimován extra- i intra-embryonálně a jeho exprese je na rozdíl od dalších členů rodiny VEGF stimulována hypoxií. Lokální produkce VEGF-A navozená hypoxií představuje molekulární substrát parakrinního signálního systému zodpovědného za lokální angiogenezi (18).

VEGF-B je exprimován především v kosterní svalovině, v myokardu a v hnědé tukové tkáni. Přesná úloha VEGF-B není dosud známa. Zřejmě se uplatňuje i při vývoji koronárního řečiště, neboť mutantní myši s delecí genu pro VEGF-B mají menší srdce (17).

VEGF-C hraje roli především v proliferaci endotelových buněk lymfatických cév a je považován za primární lymfangiogenní růstový faktor. V dospělosti je exprimován také v srdci, v tenkém střevě, v placentě a ve štítné žláze.

VEGF-D je exprimován v celé řadě tkání zejména v dospělosti. Stimuluje proliferaci endotelu krevních i lymfatických cév, není ale pro jejich vývoj nezbytný.

VEGF-E byl objeven jako součást genomu parapoxviru (Orf virus). Infekce tímto virem vede ke kožním lézím s proliferací a dilatací kapilár (17).

Růstový faktor krevních destiček, PDGF, byl izolován z trombocytů, ale je produkován v celé řadě buněk. Je to rodina několika faktorů a jejich receptorů, které ovlivňují růst různých buněk a tkání včetně endotelu. PlGF byl izolován z lidské placenty, kde se také uplatňuje vazbou na receptory VEGFR1 a 2.

Receptory pro VEGF jsou tyrozinkinázového typu a jsou označovány číslicemi 1–3. VEGFR1 se vyskytuje především v endotelu srdeční a kosterní svaloviny a váže se na něj VEGF-B (17). VEGFR2 slouží především pro vazbu VEGF-A (19). Tento receptor je exprimován již v angioblastech krevních ostrůvků a jeho vyřazení vede k defektům v jejich utváření. VEGFR3 se vyskytuje v endotelu lymfatických cév a slouží proto jako jejich marker. Je receptorem pro VEGF-C a -D (20).

Vývoj krevních cév je ovlivňován také skupinou signálních molekul, ke kterým patří efriny a angiopoietiny. Efriny jsou signální molekuly, které se vážou na tyrozinkinázové Eph receptory. Protože efriny zůstávají zakotveny v cytoplazmatické membráně buněk, operují mezi buňkami, které jsou v kontaktu. Efekt vazby ligandu a receptoru je přitom obousměrný, neboť je aktivována nejen buňka nesoucí receptor, ale i buňka exprimující ephrin. Wang et al. (21) zjistili, že arteriální endotel exprimuje ephrin-B2 (ligand), kdežto venózní endotel exprimuje jeho receptor Eph-B4 (21). Dále ukázali, že za selektivní propojování venózních a arteriálních úseků kapilár při remodelaci primárního kapilárního řečiště je zodpovědná komplementarita molekuly ephrin-B2 a jeho Eph-B4 receptoru (obr. 2). Proporcionalita rozsahu arteriálního a venózního úseku kapilárního řečiště je tak výsledkem uvedené interakce. Potvrzením tohoto předpokladu je výskyt narušené diferenciace artérií z kapilárních pletení u myších embryí s vyřazeným genem pro ephrin-B2. Embrya odumírají okolo 10. dne vývoje (21).

Angiopoietin 1–4 a jejich tyrozinkinázové receptory Tie1 a Tie2 se uplatňují při utváření a stabilizaci cévní stěny za vývoje i v dospělosti. Angiopoietiny jsou produkovány buňkami mezenchymu a hladké svaloviny, jejich receptory jsou obsaženy v cytoplazmatické membráně endotelových buněk. Uvedená signalizace je substrátem interakcí endotelu a přilehlého mezenchymu, ze kterého se diferencují pericyty a hladké svalové buňky ve stěně cév (22). Mutace receptoru Tie2 vede k familiárnímu výskytu žilních malformací, které se projevují dilatací žil, v jejichž stěně chybí hladké svalové buňky (23).

Neuropilin 1 a 2 (Nrp1, 2) jsou další receptory na povrchu endotelové buňky, které se mohou uplatňovat v diferenciaci arteriálního či venózního fenotypu díky schopnosti vázat specifické izoformy VEGF-A. Protože endotel artérií exprimuje především Nrp1, zatímco žilní endotel exprimuje Nrp2 (24), může být pomocí VEGF signalizace ovlivněna diferenciace arteriálního, resp. venózního endotelu.

Arteriální a venózní identita endotelu

Recentní studie ukazují, že arteriální a venózní identita cévy je za vývoje embrya určena genetickými mechanismy dříve, než se vyvine cirkulace (21). V určení arteriálního fenotypu dorzální aorty se uplatňuje signalizace zprostředkovaná molekulami Sonic hedgehog (Shh) produkovanými v chorda dorsalis. Buňky přilehlých somitů reagují na signalizaci Shh produkcí VEGF-A. Vazba VEGF-A na angiogenní buňky pak aktivuje transkripční faktory Foxc1 a Foxc2 a ty spouštějí signální kaskádu Delta/Notch. Ligand Delta a receptor Notch jsou membránové proteiny, které se uplatňují v interakci celé řady buněk nacházejících se ve vzájemném kontaktu. Za angiogeneze navozuje vazba ligandu Delta 4 na receptor Notch 1 expresi druhově odlišného transkripčního faktoru (gridlock u zebřičky, hesr1/hesr2 u myši), který aktivací exprese ephrinu-B2 vede k arteriální specifikaci endotelu (obr. 2). Naproti tomu je v endotelu vena cardinalis aktivován transkripční faktor COUP-TFII, který blokuje uvedenou kaskádu a navozuje expresi receptoru Eph-B4, který je odpovědný za venózní diferenciaci endotelu (25).

Zjištění, že arteriální a venózní endotel má rozdílnou identitu již od časných stadií vývoje, otevírá novou problematiku pro základní i klinický výzkum. Například by bylo zajímavé vědět, zda klinicky používané angiogenní a antiangiogenní látky mají selektivní vliv na arteriální, resp. venózní endotel. Je také otázkou, zda by bylo možné ovlivnit transformaci endotelu žilních bypassů používaných k přemostění arteriálního uzávěru. Kudo et al., kteří sledovali adaptaci žilního štěpu použitého k přemostění uzávěru v arteriálním řečišti, zjistili, že kromě ztluštění hladké svaloviny dochází ke ztrátě venózní identity endotelu vyjádřené vymizením exprese Eph-B4. Očekávaná indukce arteriálního markeru ephrinu-B2 však prokázána nebyla (26).

V souvislosti s uvedeným uplatněním transkripčního faktoru Foxc2 při diferenciaci arteriálního a venózního fenotypu je zajímavý nález mutace genu tohoto transkripčního faktoru u pacientů s primární insuficiencí žilních chlopní (27). Foxc2 se uplatňuje také při vývoji lymfatických cév a později je exprimován nejen v endotelu, ale také ve svalových buňkách a chlopních žil a lymfatických cév. Pacienti, kteří jsou nositeli Foxc2 mutace, mají insuficientní chlopně i v lymfatických cévách s následným rozvojem lymfedému.

Růst cév podél nervů

Je dobře známo, že celá řada tepen a žil probíhá společně s periferními nervy jako neurovaskulární svazky. Vysvětlení této vazby přineslo až zjištění, že signální molekuly, které navádějí periferní nervy na trasy jejich průběhu, jsou využívány také endotelem při formovánítrubic krevních cév. Mezi signální molekuly, které se přitom uplatňují, patří Netrin a jeho receptor UNC5B, Slit a jeho receptor Robo, Semaphorin 3A, který se váže na receptory Neuropilin 1 a 2 (28). Ke společnému průběhu senzitivních nervů a drobných tepen v podkoží přispívá také VEGF, který je produkován Schwannovými buňkami a atrahuje buňky na hrotu pučící cévy. Dalším příkladem vývojové koordinace průběhu cév a nervů je mechanismus, kterým jsou autonomní nervová vlákna naváděna na průběh artérií. Hladké svalové buňky cévní stěny tepen produkují signální molekulu artemin (ARTN), která atrahuje nervová vlákna sympatiku ke tvorbě periarteriální pleteně (28).

Význam tkáňové hypoxie pro tvorbu krevních cév

Na počátku poznání významu tkáňové hypoxie pro stimulaci tvorby cév bylo zjištění (29), že buňky reagují na sníženou tenzi kyslíku produkcí transkripčních faktorů indukovaných hypoxií (HIF). HIF faktory stimulují expresi celé řady genů, které usnadňují adaptaci na hypoxii. Jednou z těchto molekul je i VEGF-A – nejúčinnější stimulátor tvorby cév– a patří sem i erytropoetin, transferin a jeho receptor, enzymy glykolytického metabolismu, fosfoglycerát kináza, glukózové transportéry a endotelová NO syntáza (30). Postupně byla definována celá signální kaskáda (obr. 3) zodpovědná za vaskularizaci tkání vystavených hypoxii (31).

Byly popsány tři faktory HIF, které jsou označovány číslicemi 1–3. Klíčovou roli má HIF-1. Je to heterodimer složený z indukovatelné podjednotky alfa a trvale přítomné podjednotky beta. HIF-1alfa je v přítomnosti kyslíku rychle degradován, a proto je za normoxických podmínek jeho hladina nízká, kdežto za hypoxických podmínek je tato degradace snížena a hladina HIF-1 alfa ve tkáni vzrůstá. Její exponenciální růst začíná při 6% O₂ (pO₂ – 6 kPa) a maximální hladina je dosahována při 0–0,5% O₂ (pO₂ – 0–0,5 kPa) (30), přičemž minimální parciální tlak kyslíku, který umožňuje funkční oxidativní metabolismus mitochondrií je 0,133 kPa = 1mmHg = 0,1% O₂ (32).

Prostorový gradient pO₂ je složitý a je dán vzájemným uspořádáním kapilár a buněk, které kyslík spotřebovávají. Například v mozkové tkáni se pO₂ může lišit až o 4–5 kPa v místech vzdálených od sebe pouze několik mikrometrů (33). Parciální tlak kyslíku ve tkáni lze měřit přímo pomocí platinové elektrody, ale je možný také imunohistochemický průkaz hypoxie v místech s parciálním tlakem kyslíku nižším než 10 mm Hg = 1,3 kPa = 1% O₂ (34). Do oběhu se aplikují dusíkaté heterocyklické sloučeniny, které po hypoxické aktivaci enzymů ze skupiny nitroreduktáz vedou k tvorbě adduktů mezi podanou látkou a makromolekulami bílkovin. Tyto addukty jsou pak detegovatelné protilátkou (Hypoxyprobe), a tu lze vizualizovat v histologických řezech tkáněmi. V nádorové tkáni byly tímto způsobem znázorněny hypoxické okrsky, ve kterých byla tvorba cév stimulována. Důležitá je i skutečnost, že hypoxické okrsky se vyznačují sníženou radiosenzitivitou (34).

Použití imunohistochemického průkazu hypoxie při studiu embryonálních tkání ukázalo, že za embryonálního vývoje se hypoxické okrsky vyskytují fyziologicky, a že reprezentují místa fyziologické stimulace angiogeneze cestou kaskády HIF – VEGF – angiogeneze (8, 35). Exprese HIF faktorů navozuje vaskularizaci hypoxických okrsků; nejvíce je to patrné v neurální a trávicí trubici a za vývoje ledviny (obr. 4). V podmínkách zvýšené hypoxie se signální angiogenetická kaskáda uplatňuje ve zvýšené míře a hustota kapilárního řečiště v hypoxických tkáních narůstá (8). Lze proto usuzovat, že v řízení vývoje krevních cév se vedle genetických faktorů uplatňují změny lokálního mikroprostředí. Zatímco velké kmeny tepen a žil vznikají podle vývojového programu, který se vytvořil v průběhu historického vývoje, uplatňuje se za vývoje vaskularizace orgánů signální kaskáda navozená lokální produkcí HIF. Směr růstu nových kapilár odpovídá gradientu parciálního tlaku kyslíku ve tkáni, který s rostoucí vzdáleností od kapiláry klesá a zároveň stoupá produkce VEGF.

Terapeutické ovlivnění tvorby cév

Poznávání molekulární podstaty tvorby cév umožňuje hledat racionální ovlivnění tohoto děje s cílem tvorbu cév stimulovat nebo naopak potlačit. Terapeutické postupy zaměřené na zlepšení cévního zásobení jsou stále ve stadiu ověřování jejich efektivity. Podávání růstových faktorů (VEGF-A, VEGF C, FGF-1, 2 a 4) nepřineslo zatím pozitivní efekt ve srovnání s placebo-studiemi u pacientů s ICHDK či ICHS (36). Naproti tomu u pacientů s ICHDK vedla intramuskulární aplikace angiogenních buněk z autologní kostní dřeně k ústupu ischemické bolesti a k prodloužení klaudikačních intervalů. Transkutánním měřením byla v končetinách prokázána signifikantně zvýšená tenze kyslíku (36). Ve stadiu experimentu je intramyokardová injekce virového vektoru nesoucího gen pro HIF-1alfa, která přinesla zvýšenou perfuzi a lepší funkci levé komory (37).

Zastavit růst nádoru se podařilo blokádou VEGF na různých úrovních jeho signální kaskády. Inhibice samotného VEGF humanizovanou monoklonální protilátkou (bevacizumab) se zdá nejúčinnější. Bylo zjištěno, že bevacizumab významně omezuje novotvorbu cév. Usnadňuje i průnik cytostatik, protože současně snižuje intersticiální tlak v nádorové tkáni. Je proto vhodné kombinovat podání bevacizumabu s chemoterapií. V současné době je bevacizumab lékem první volby u kolorektálního karcinomu s metastázami (38). Některé studie však ukazují, že inhibice pučení cév a destrukce již vytvořených cév ustává po ukončení inhibice. V zachovaných bazálních membránách kapilár obklopených pericyty se může endotel obnovit (39).

Inhibice angiogeneze anti-VEGF protilátkou se osvědčila i u pacientů s makulární degenerací, které podléhá centrální část retiny pod makulou a která je způsobena tvorbou abnormálních cév se zvýšenou permeabilitou a krvácivostí. Lokální aplikace monoklonální anti-VEGF protilátky (ranibizumab, Lucentis) permeabilitu snižuje a růst cév omezuje (40).

Další, zatím méně využívanou možností blokády VEGF signalizace, je inhibice VEGF receptorů buď monoklonální protilátkou, nebo pomocí inaktivního heterodimeru VEGF, který obsadí vazebná místa receptorů (41). Blokovat lze i samotné tyrozinkinázy, které jsou součástí VEGF receptorů. Některé z takovýchto přípravků však blokují i tyrozinkinázy receptorů pro jiné růstové faktory (EGF, PDGF).

Lze využít i postupy genové terapie podáním antisense oligonukleotidů proti mRNA pro VEGF, nebo aplikací specifického ribozymu, který štěpí mRNA pro VEGF receptor (42).

Možnosti terapeutických zásahů do procesu tvorby cév otevírají v současné době nové oblasti klinické medicíny. Podmínkou jejich dalšího rozvoje je pokračující poznávání základních molekulárních mechanismů tvorby cévního řečiště.

Zkratky

ARTN – signální molekula artemin

EGF – epidermový růstový faktor

HIF – faktory indukované hypoxií

Nrp1, Nrp2 – Neuropilin 1 a 2

PDGF – růstový faktor krevních destiček

PlGF – placentární růstový faktor

VEGF – růstový faktor cévního endotelu

Práce byla vypracována s finanční podporou MŠMT ČR v průběhu řešení VZ 0021620806 a VC LC 06061.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Ondřej Naňka, Ph.D.

Anatomický ústav 1. LF UK

U Nemocnice 3, 128 00 Praha 2

e-mail: ondrej.nanka@lf1.cuni.cz