16. celostátní konferenceDNA diagnostiky (28. až 30. listopadu, Brno)

Koncem listopadu 2012 proběhla v Brně tradiční konference, tentokrát již třídenní a konala se na dvou místech – jednak v historickém Mendelově refektáři, kde byla 28. listopadu zahájena, a pokračovala v prostorách Kanceláře veřejného ochránce práv v následujících dvou dnech. Program byl rozdělen do postupně probíhajících sekcí, z nichž první zahajovací se týkala problematiky onkologické, která ještě pokračovala v následujícím dni 29. listopadu, kde na ni navázaly sekce o Nové generaci sekvenování, sekce Klinické genetiky, Onkologické genetiky a Forenzní genetiky. Poslední den byl věnován vloženému programu „8th Golden Helix Pharmacogenomics Day“, jehož náplň tvořila kromě farmakogenomiky problematika vzácných nemocí. Konferenci uzavřela sekce Mezilaboratorní kontroly kvality. Přednášky z 28. a 29. listopadu jsou zastoupeny dále uvedenými autorskými výtahy a výtahy přednášek z „Osmého Farmakogenomického Dne Zlatého Helixu“ připravil na základě laskavě poskytnutých prezentací autor komentáře. Smutným údělem těchto konferencí je malý zájem praktických lékařů a v důsledku toho i omezený dopad na naši klinickou medicínu, přestože odborná úroveň je vysoká a začíná být srovnatelná i se zahraničními akcemi pořádanými v zemích, které mají proti nám v této oblasti medicíny náskok, díky účinné podpoře ze strany nadřízených státních institucí, ale i privátního sektoru. Snad alespoň těm, kteří se snaží sledovat směřování medicíny k maximální individualizaci péče, pomohou při hledání genetických determinant v příčinách chorob, jejich průběhu a výběru vhodných léčebných postupů, dále uvedené výtahy přednášek včetně adres jejich autorů.

Účastníků konference bylo cca 250.

prof. MUDr. Radim Brdička, DrSc.

SEKCE GENETIKA V ONKOLOGII

Možnosti vyšetřování molekulárních prediktorů onkologické léčby z cirkulující volné nádorové DNA

Benešová L.¹, Belšánová B.¹, Kopečková M.¹, Fiala O.², Pešek M.², Mináriková P.³, Lipská L.⁴, Levý M.⁴, Zavoral M.³, Minárik M.¹

¹Centrum aplikované genomiky solidních nádorů, Genomac výzkumný ústav, Praha

²Klinika nemocí plicních a tuberkulózy FN, Plzeň

³Interní klinika 1. LF UK a ÚVN, Praha

⁴Chirurgická klinika 1. LF UK a Thomayerovy nemocnice, Praha

e-mail: lbenesova@genomac.cz

Úvod: Neodmyslitelnou součástí cílené biologické léčby solidních nádorů je vyšetřování molekulárních prediktorů léčebné odpovědi. U aplikace terapie zamířené na blokaci EGFR signální dráhy je tak klíčové vyšetření přítomnosti mutačního postižení genů KRAS u kolorektálního karcinomu (CRC), EGFR u nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC) a v menší míře i BRAF, respektive EML-ALK. V blízké době lze očekávat další markery, např. PIK3CA, HER2 atd. Vzhledem k časté inoperabilitě a nedostupnosti tumorózní tkáně pro bioptické vzorkování u mnohých nádorů jsou v poslední době vysoké naděje vkládány do možnosti vyšetřování volné cirkulující tumorové DNA (cfDNA) v periferní krvi jako alternativního zdroje pro zjištění molekulárního profilu primárního nádoru či vzdálených metastáz. K uvolňování cfDNA dochází v důsledku aktivace procesů buněčné apoptózy a nekrózy, a to jak přímo z masy tumoru, tak i z okolní nenádorové tkáně.

Metodika: V našem pilotním projektu jsme se zaměřovali na vyšetřování přítomnosti cfDNA u nemocných s CRC a NSCLC. Následně jsme prováděli vyšetřování sady genetických a epigenetických markerů souvisejících s biologických chováním nádoru. Celkem jsme takto vyšetřili 189 (CRC) a 107 (NSCLC) nemocných, u kterých byl proveden odběr tumorózní tkáně a současně i odběr plazmy získané zpracováním vzorku periferní krve. U CRC pacientů byla provedena korelace výskytu mutace KRAS v primárním tumoru, cfDNA a v metastatické tkáni. U NSCLC pacientů bylo provedeno metylační vyšetření cfDNA. Mutační analýza byla prováděna na sekvenátoru ABI 3100 s použitím vysoce citlivých kitů Genoscan (Carolina Biosystems), vyšetření metylací panelu 30 genů bylo prováděno metodou MS-MLPA s použitím kitů SALSA (MRC-Holland).

Výsledky: Některá ze sledovaných mutací byla nalezena v primárním tumoru u celkem u 71 % CRC pacientů (135/189) a 24 % NSCLC pacientů (26/107). Přítomnost tumorové cfDNA v plazmě byla detekována u 28 % CRC pacientů (35/125) a 30 % NSCLC pacientů (8/24). Absolutní shoda přítomnosti KRAS mutace v primárním nádoru, cfDNA i v metastáze byla nalezena u 57 % případů (4/7), zatímco u 14 % případů (1/7) byla mutace KRAS prokázána v primárním tumoru a v cfDNA bez nálezu KRAS v metastatické tkáni. U NSCLC pacientů bylo následně provedeno metylační vyšetření. Při srovnání metylačních profilů primárních nádorů a tumorové cfDNA byla nejčastěji zjištěna shoda u genů VHL (4/8, 50 %), APC (3/8, 37 %), PTEN (3/8, 37 %), CASP8 (3/8, 37 %) a TIMP3 (3/8, 37 %). U každého ze sledovaných NSCLC pacientů byla hypermetylace v primárním nádoru alespoň u jednoho z postižených genů následně prokázána i v tumorové cfDNA.

Závěr: Výsledky naší pilotní studie dokládají možnost využití volné DNA v periferní krvi nejen pro vyšetření přítomnosti mutací genů KRAS a EGFR, ale i pro vyšetření metylačního statusu genů významných pro biologické chování solidních nádorů.

Částečně podpořeno z projektu IGA NT13660.

Genotype phenotype correlation in patients with neurofibromatosis type 1 and optic pathway glioma

Bolčeková A.¹, Nemethova M.², Zatkova A.³, Hlinkova K.⁴, Hlavata A.¹, Ilencikova D.¹

¹Detská klinika DFNsP a LF UK, Bratislava, Slovenská republika

²Laboratórium genetiky, Ústav molekulární fyziológie a genetiky SAV, Bratislava, Slovenská republika

³Katedra molekulárnej biológie PrF UK, Bratislava, Slovenská republika

⁴Oddelenie onkologickej genetiky, Národný onkologický ústav, Bratislava, Slovenská republika

e-mail: anna.rybarova@gmail.com

Optic pathway gliomas (OPG) occur in 15% of patients with neurofibromatosis type 1 (NF1; OMIM162200). Genotype-phenotype correlations in patients with NF1 and OPG may help to determine the risk group for developing a severe form of NF1. We evaluated 51 Slovak patients with NF1 (21 with OPG and 30 without OPG). All of them underwent a neurofibromatosis 1 focused clinical examination and molecular diagnostics of NF1 gene using protocol based on cDNA analysis. In the group with OPG patients, there was a significantly higher incidence of freckling (95%), neurofibromatosis brain objects (NBO) (76%), compared to group without OPG. The differences between the groups with respect to Lisch nodules and neurofibromas were not significant. Approximately 50% of mutations in patients with OPG were located in the first 16 exons (first 5’tertile) of the NF1 gene, in the group without OPG they were located mostly in the 2nd and third tertile. In this group 12/20 (57.1%) identified mutations were novel, in the entire cohort it was 30/49 (61.3%). Our results present the clustering of mutations in the 5’ tertile of NF1 gene in patients with optic nerve glioma and suggest the incidence of a more severe form of neurofibromatosis type 1. Molecular analysis of NF1gene is an important part in complex management of NF1 patients and may contribute to a better prognosis prediction for optic glioma.

Molekulární diagnostika neurofibromatózy typu 1 (NF1) na Oddělení lékařské genetiky

Dudová S., Vaňásková M., Švestková Z., Danadová J., Valášková I., Gaillyová R.

OLG FN, Brno

e-mail: sdudova@fnbrno.cz

Neurofibromatóza typu I je multisystémové onemocnění s autozomálně dominantní dědičností a kompletní penetrancí vycházející z buněk odvozených z neurální lišty. Tato porucha, která má četnost 1 : 3000 narozených jedinců je způsobena mutacemi v genu NF1, umístěném na chromozomu 17 (17q11.2). Jedná se o tumor-supresorový gen, jehož produkt (neurofibromin) je součástí intracelulární signální kaskády spojené s RAS-kinázou a cAMP-dependentní proteinkinázou A.

Analýza NF1 genu je však komplikována jeho vysokou mutační rychlostí (1 × 10^-4/gametu/generaci), de novo mutacemi, velikostí genu a absencí hot spots a také přítomností mnoha homologních pseudogenů. Na pracovišti Oddělení lékařské genetiky je pro vyšetření NF1 genu zavedena sekvenace transkriptů NF1 genu kombinovaná se sekvenováním genomové DNA. V souvislosti s korelací psychických poruch s mikrodelecemi je využívána také MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Tato kombinace zvyšuje detekci mutace na 61 % u testovaných pacientů, kteří splňují diagnostická kritéria pro NF1.

Pro zajištění co největšího záchytu sekvenční změny jsou používány také další metody jako sekvenování nové generace (Roche) nebo QF PCR. Se zvýšením citlivosti detekce se však zvyšují nároky na dobu analýzy, s čímž souvisí množství příjmu NF1 vzorků převyšující počet dokončených analýz.

V příspěvku bude popsána komplexní strategie vyšetření NF1 genu na Oddělení lékařské genetiky spolu s příklady nálezů s využitím metod používaných na pracovišti.

Zajímavé nálezy u pacientů s MDS a komplexním karyotypem prokázané metodou aCGH

Kostýlková K., Buryová H., Nováková M., Gančarčíková M., Zemanová Z., Michalová K.

Centrum nádorové cytogenetiky ÚLBLD 1. LF UK a VFN, Praha

e-mail: karla.kostylkova@seznam.cz

Myelodysplastické syndromy (MDS) představují heterogenní skupinu klonálních hematologických malignit charakterizovanou neefektivní krvetvorbou, morfologickou dysplazií krvetvorných buněk a současnou periferní cytopenií postihující jednu či více krvetvorných linií. Chromozomové aberace jsou popsány přibližně u 50 % případů nemocných s primárními MDS a u 80 % pacientů se sekundárními MDS. U 10–20 % nemocných jsou pak nalezeny komplexní změny, tedy změny zahrnující tři a více chromozomů (označováno jako komplexní karyotyp), které představují zvýšené riziko transformace do akutní myeloidní leukémie (AML), špatnou odpověď na léčbu a vyšší riziko relapsu.

V průběhu let 2002–2012 jsme konvenčními a molekulárně cytogenetickými metodami (G-pruhování, FISH, mFISH, mBAND) vyšetřili soubor 139 pacientů s MDS a komplexním karyotypem. Pro upřesnění rozsahu nebalancovaných chromozomových aberací a zlomových míst jsme u 92 pacientů použili metodu array Comparative Genomic Hybridization (aCGH). V rámci sdělení prezentujeme tři pacienty s MDS a komplexním karyotypem, u nichž metoda aCGH odhalila změny, které nebyly jinými metodami detekovány. U první pacientky byly konvenčními a molekulárně cytogenetickými metodami nalezeny tři patologické klony, přičemž ve všech byl přítomen deletovaný chromozom 5 a kromě dalších chromozomových aberací i monosomie chromozomu 16. Metodou aCGH bylo však zjištěno, že subtelomerická oblast dlouhých ramen chromozomu 16 byla zachována a translokována na jiný derivovaný chromozom. U druhého pacienta byl cytogenetickými metodami, kromě jiných aberací, nalezen derivovaný chromozom vzniklý translokací chromozomu 8 a 20. Metodou aCGH byla upřesněna zlomová místa a deletované oblasti na těchto chromozomech. U třetího pacienta byla cytogenetickými metodami nalezena delece chromozomu 5 v oblastech 5q13.2 až 5q34. Metoda aCGH upřesnila, že k deleci došlo mezi oblastmi 5q14.3 a 5q35.3 a zároveň prokázala, že v oblasti 5q35.1 zůstal zachován gen NPM1. Chromozomové aberace zahrnující tento gen jsou asociovány s non-Hodgkinovým lymfomem, akutní promyelocytární leukémií, MDS a AML. aCGH v kombinaci s molekulárně cytogenetickými metodami přispívá k detekci nebalancovaných kryptických aberací a napomáhá při hledání genů zodpovědných za vznik a progresi choroby.

Podpořeno granty RVO-VFN64165/2012, GAČR P302/12/G157/1, COST EuGESMA.

Epigenetický screening kolorektálního karcinomu-biomarker mSEPT9

Koudová M., Bittóová M., Vlčková Z., Alánová R., Indráková V., Nedvědová V.

GHC GENETICS s.r.o. – NZZ, Praha

e-mail: koudova@ghcgenetics.cz

Úvod: Kolorektální karcinom (KRK) patří mezi nejčastější maligní nádorová onemocnění v naší populaci se stále se zvyšující incidencí a mortalitou. Screening CRC zahrnuje v České republice vyšetření okultního krvácení ze stolice (TOKS) jednou ročně od 50 let věku. Po 55. roce věku se jedná o TOKS jednou za 2 roky nebo koloskopické vyšetření jednou za 10 let. Epigenetický screening CRC je založen na detekci abnormálně methylované DNA v oblasti v2 genu Septin 9 v krevní plazmě. Cytosinové zbytky SEPT9 jsou specificky metylované u tkáně kolorektálního karcinomu, ale ne u normální střevní sliznice, proto může být vyšetření mSEPT9 použito jako biomarker pro detekci CRC.

Metoda: V rámci nyní zahájeného projektu preventivní péče je celkem testováno 300 mužů a žen české populace ve věku 50 a více let. Materiálem k vyšetření je vzorek plazmy získaný odběrem periferní nesrážlivé žilní krve. Epigenetické vyšetření je prováděno pomocí certifikovaného kitu Test Epi proColon Early Detection (f. Pentagen). Nejprve je provedena extrakce, bisulfitická konverze a vyčištění bezbuněčné DNA z lidské plazmy. Simultánní detekce mSEPT9 DNA a ACTB DNA (vnitřní kontrola vhodnosti vložené DNA) je provedena pomocí duplexní RT-PCR. V rámci vyšetření jsou použity také pozitivní a negativní kontroly pro celý postup zpracovávání vzorku plazmy. U všech testovaných osob je současně prováděno imunochemické vyšetření TOKS odběrovou soupravou FOB test DIMA^® a získávána podrobná anamnestická data zaměřená na rizikové faktory CRC (strava a životní styl) a výskyt nádorových onemocnění v osobní a rodinné anamnéze. V případě pozitivního výsledku mSEPT9 nebo TOKS bude provedena urgentní koloskopie, včetně eventuálního histologického vyšetření a při potvrzení diagnózy CRC bude zahájena nezbytná onko-chirurgická terapie.

Výsledky: Po ukončení projektu bude provedeno vzájemné srovnání výsledků všech provedených vyšetření – epigenetického, TOKS a koloskopického (eventuálně histologického). Získané výsledky budou detailně a podrobně zpracovány a statisticky vyhodnoceny spolu se zhodnocením anamnestických údajů z osobní, rodinné anamnézy a životního stylu.

Závěr: Cílem projektu je aplikovat nejnovější poznatky epigenetiky v rámci screeningu CRC s ohledem na anamnézu a životní styl pacienta a tím rozšířit současné možnosti záchytu pacientů s CRC již v časném stadiu onemocnění, které lze ještě velmi dobře léčit.

Hereditární syndrom nádoru prsu a/nebo ovaria – výsledky genetického testování BRCA1/2 genů v MOÚ

Macháčková E., Sťahlová Hrabicová E., Házová J., Vašíčková P., Miková M., Foretová L.

Oddělení epidemiologie a genetiky nádorů, Masarykův onkologický ústav, Brno

e-mail: emachack@mou.cz

Úvod: Nádorová onemocnění jsou v zemích západního světa druhou nejčastější příčinou úmrtí. Nádorové onemocnění je vždy třeba chápat jako velice komplexní a multifaktoriální záležitost. Jedno z nejčastěji diagnostikovaných maligních onemocnění u žen jsou nádory prsu. V naší populaci přibližně každá desátá žena onemocní během svého života nádorem prsu. Na základě rodinné a osobní anamnézy lze u cca 5–10 % z diagnostikovaných případů nádorů prsu zaznamenat dědičnou predispozici. Žena, která má jednu příbuznou prvního stupně diagnostikovanou s nádorem prsu, má riziko onemocnění zhruba dvojnásobně vyšší, než je riziko běžné populace. Toto riziko však dále narůstá, pokud nádorem prsu onemocněla mladá žena.

Obecně lze říci, že riziko vzniku nádoru prsu u ženy, odhadované podle rodinné anamnézy, roste se snižujícím se věkem v době diagnózy a vzrůstajícím počtem postižených příbuzných v rodině. Hereditární forma nádoru prsu a/nebo ovaria je způsobena nejčastěji funkčně ztrátovou mutací v genu BRCA1 (lokus 17q21-q24) nebo BRCA2 (lokus 13q12-q13). Odhad incidence nosičů v západní populaci je uváděn v rozmezí 1 : 500 až 1 : 800.

Vyšetřovaný soubor: Molekulárně genetická analýza mutací v genech BRCA1 a BRCA2 je v MOÚ prováděna od roku 1999. Do konce září 2012 bylo ukončeno vyšetřeníu 3765 rodin (nepříbuzných jedinců) s indikací klinického genetika na pravděpodobnou dědičnou predispozici. V některých rodinách bylo kompletní vyšetření obou genů provedeno u více než jednoho jedince – a to především v případě, že nebyla zachycena patogenní mutace u primárně analyzované osoby s vysoce rizikovou rodinnou anamnézou nebo u jedinců s oboustrannou (maternálně i paternálně) rizikovou anamnézou.

Postupy vyšetření v MOÚ: Vyšetření je prováděno z genomické DNA izolované z periferní krve. PCR amplifikace a analýza kódujících oblastí a míst sestřihu jednotlivých exonů genů BRCA1 a BRCA2 metodou je prováděno ve fragmentech v rozmezí velikosti cca 200–600 bp. V letech 1999–2006 byly jako screeningové metody využívány: heteroduplexní analýza s využitím MDE gelu (Cambrex) a PTT (protein truncation test, pro fragmenty kódující DNA v rozsahu 900–1300 bp).

Během roku 2007 byly výše zmíněné metody postupně nahrazeny vysokorozlišovací analýzou křivek tání (HRM – High Resolution Melting) s využitím přístroje LightScanner (Idaho Technology). V roce 2012 byla pro vyšetření vysoce polymorfních úseků zařazena denaturační vysokorozlišovací kapalinová chromatografie (DHPLC) s využitím přístroje Wave system 4500 (Transgenomic). Fragmenty s aberantním profilem zachyceným u screeningových metod byly sekvenovány. V letech 1999–2007 na ALF express II (Pharmacia) a od roku 2007 bylo sekvenování převedeno na 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems).

Od roku 2005 byla používána k vyšetření intragenových přestaveb genu BRCA1 a BRCA2 metoda MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) s užitím kitu SALSA (MRC-Holland). Velké intragenové delece jsou poměrně časté v případě genu BRCA1. V selektované skupině vysoce rizikových pacientek s nádorem (s rodinnou anamnézou 3 a více případů karcinomu prsu a/nebo ovaria) byl záchyt 6% (10/172 nejrizikovějších selektovaných probandů) a vyšetření MLPA analýzou bylo přiřazeno ke standardnímu postupu vyšetření. Vyšetření metodou MLPA u genu BRCA2 však bylo v roce 2007 ukončeno, protože po vyšetření cca 1000 rizikových probandů nebyla zachycena žádná rodina s pozitivním záchytem.

Výsledky a diskuze: Vysoce riziková mutace, s prokázaným patogenním efektem, byla zachycena u 896 rodin (tj. u 23,8 %). Z toho BRCA1 mutace byla zachycena u 602 rodin (97 různých) a BRCA2 mutace byla zachycena u 294 rodin(89 různých). V jedné rodině byly zachyceny patogenní mutace v obou genech BRCA1 i BRCA2, v další rodině mutace v genu BRCA1 společně s CHEK2. Spektrum zachycených mutací je obrovské. Od záměnových mutací (missense s prokázanou patogenitou, nonsense a sestřihových), přes drobné až rozsáhlé delece/inzerce až po deleci celé alely genu.

V případě interpretace vzácných missense a intronových variant nejasného významu (UV) se při interpretaci nálezu řídíme především výsledky funkčních analýz (jsou-li dostupné), prediktivních multifaktoriálních studií a přikláníme se k IARC klasifikaci pro varianty nejasného významu navrženou Plon et al. 2008. Dle IARC hodnocení je pro UV varianty navrženo pět klasifikačních tříd:

5. (5-IARC class: definitely pathogenic) – funkčně ztrátové mutace s pravděpodobností patogenity > 0,99.

4. (4-IARC class: likely pathogenic) – predikovány jako patogenní na základě multifaktoriálních analýz, ale chybí průkaz patogenity „nezpochybnitelným“ funkčním testem s pravděpodobností patogenity 0,95–0,99.

3. (3-IARC class: uncertain) – varianty nejasného významu, většinou velice vzácné a zatím nehodnocené varianty s pravděpodobností patogenity 0,05–0,949.

2. (2-IARC class) – pravděpodobně nepatogenní nebo pouze malého klinického významu s pravděpodobností patogenity 0,001–0,049.

1. (1-IARC class) – nepatogenní a klinicky nevýznamné polymorfismy s pravděpodobností patogenity < 0,001.

Kromě výše zmíněných prokazatelně patogenních mutací v genech BRCA1 a BRCA2 u 896 analyzovaných rodin, byla u dalších 18 rodin zachycena sekvenční varianta s predikovaným patogenním efektem třídy 4-IARC (šest různých missense mutací) a případně i s částečně pozitivními funkčními testy, kde je pravděpodobné, že se patogenita v budoucnu plně prokáže. Následně byly u 84 rodin nalezeny varianty, které lze v současné době klasifikovat pouze jako variantu nejasného významu (3-IARC), a to 20 různých u genu BRCA1 a 44 různých u genu BRCA2. Většina z nich se vyskytuje pouze ojediněle, některé zatím nepopsané v mezinárodních databázích a některé se vyskytují ve vysoce konzervovaných funkčních doménách proteinu.

Závěr: V současné době jsme schopni provést kompletní vyšetření obou genů v průměru u 50 probandů měsíčně. Přesto dochází k velkému navyšování čekacích dob na vyšetření vzhledem k neustále narůstajícímu množství požadavků na vyšetření.

Urgentní vyšetření je indikováno pouze v případě návaznosti na léčbu – např. u neadjuvantní léčby u triple-negativních karcinomů prsu v případě nosičky BRCA1 mutace (terapie PARP inhibitory, cisplatinou), u pacientek po jednostranné mastektomií s plánovanou oboustrannou rekonstrukcí na plastické chirurgii nebo při plánované IVF.

Úkolem onkologa a spolupracujících odborníků je zajistit těmto rizikových jedincům adekvátní prevenci dle nejlepších současných možností. Bez této adekvátní prevence by se význam genetického testování a odhalování osob s vysokým rizikem míjel účinkem.

Literatura

1. Machackova et al. BMC Cancer 2008; 8: 140.

2. Minckwitz et al. Annals of Oncology 2012; 23: vi35-vi39.

3. Plon et al. Human Mutation 2008; 29: 1282–1291.

4. Vasickova et al. BMC Medical genetics 2007; 8: 32.

Testování je podporováno Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101).

Farmakogenetické aspekty terapie fluoropyrimidiny/farmakokinetické sledování pacientů léčených protinádorovou chemoterapií s 5-fluorouracilem

Mrkvicová M.^1,2, Pilátová K.¹, Zemanová E.¹, Odráška P.¹, Obermannová R.³, Demlová R.^2,4, Valík D.¹

¹Oddělení laboratorní medicíny, Masarykův onkologický ústav, Brno

²Farmakologický ústav LF MU, Brno

³Klinika komplexní onkologické péče, Masarykův onkologický ústav, Brno

⁴RECAMO, Oddělení klinických hodnocení, Masarykův onkologický ústav, Brno

e-mail: martina.mrkvicova@mou.cz

Protinádorový lék 5-fluorouracil (5-FU) byl syntetizován již před více než 50 lety Heidelbergerem a Duschinskym, přesto stále zůstává jedním z nejčastěji předepisovaným protinádorovým lékem široce používaným u různých forem solidních nádorů, především kolorektálních karcinomů, nádorů žaludku, jater a pankreatu, karcinomů prsu. U přibližně 13–16 % pacientů dochází po podání 5-FU k závažné gastrointestinální (záněty sliznic, stomatitida, zvracení, průjem), hematologické (těžká neutropenie, trombocytopenie) a neurologické toxicitě. Mechanismus jeho protinádorového účinku spočívá v inhibici enzymu thymidylátsyntázy (TS) prostřednictvím fluorodeoxyuridin-monofosfátu (FdUMP), která vede k poruše syntézy DNA, a dále v poškození syntézy RNA v důsledku inkorporace 5-fluorouridintrifosfátu (FUTP). Fluorouracil je v těle odbouráván na neaktivní metabolity. Iniciačním enzymem metabolismu je dihydropyrimidin dehydrogenáza (DPD; EC 1.3.1.2; kódována genem DPYD), která přeměňuje 5-FU na 5,6-dihydrofluorouracil (5,6-DHFU). Plazmatická koncentrace 5-FU závisí na rychlosti odbourávání DPD. Více než 80 % podaného 5-FU je odbouráváno v játrech, pouze zbytek 5-FU se dostane k nádoru. U pacientů s nízkou aktivitou enzymu DPD může dojít k vážné toxicitě způsobené vysokou expozicí k 5-FU, zatímco vysoká aktivita snižuje dostupnost cytostatika v místě nádoru, a tím efekt cytostatika. Aktivita enzymu DPD je u celkové populace velmi variabilní a nejméně 3–5 % jedinců vykazuje nízkou nebo nedostatečnou aktivitu DPD. Snížená katalytická aktivita enzymu DPD je způsobena bodovými či sestřihovými mutacemi, velkými delecemi a inzercemi nebo sníženou expresí genu DPYD. Gen DPYD (OMIM 274270) se nachází v oblasti 1q22, má velikost 843 kbp a je složen z 23 exonů. Od konce devadesátých let 20. století je tento gen intenzivně studován, přičemž do dnešních dnů bylo popsáno více než 30 mutací u pacientů s nádorovým onemocněním. Četnost mutací je v běžné populaci udávána mezi 1–5,8 %. Mezi nejčastější v západoevropské populaci patří mutace IVS14+1G>A (c.1905+1G>A), označovaná též jako DPYD*2A. Vyšetření aktivity enzymu DPD a genetický screening genu DPYD mohou představovat důležitý prediktor toxicity před zahájením léčby a jejich provedení je doporučováno pro pacienty, kde se plánuje léčba fluoropyrimidiny.

Kromě deficitu DPD byla závažná 5-fluorouracilová toxicita popsána také u deficitu enzymu dihydropyrimidináza (DHP; EC 3.5.2.2). DHP je druhý enzym degradační dráhy 5-FU a katalyzuje přeměnu 5,6-DHFU na další metabolit. S ohledem na současné poznatky, že příčinou fluoropyrimidinové toxicity může být změna ve funkci obou enzymů jak DPD, ale také DHP – tj. ne pouze DPD, jak bylo dříve uvažováno – bylo zavedeno vyšetření zahrnující nejen stanovení genotypu pro DPD (detekci mutace IVS14+1G>A), ale také fenotypové hodnocení vycházející z farmakokinetické analýzy 5-FU a jeho metabolitu 5,6-DHFU (nepřímé stanovení rychlosti konverze).

Nepřímé stanovení aktivity enzymu DPD je založeno na měření rychlosti in vivo syntézy 5,6-DHFU. Pomocí HPLC je stanovováno množství 5-FU a jeho metabolitu 5,6-DHFU z plazmy odebrané do Li-heparinových zkumavek před podáním a po podání bolusové dávky 5-FU v časech 10, 30 a 90 minut. Detekce mutace IVS14+1G>A s využitím certifikované soupravy PGX-5FU StripAssay (ViennaLab Diagnostics) je založena na kombinaci in vitro PCR a reverzní hybridizace. Do studie bylo prozatím zahrnuto 43 pacientů. Čtyři z nich vykazovali pomalejší eliminaci 5-FU v důsledku možné snížené aktivity enzymu DPD. Tito pacienti mohou být ohroženi toxicitou 5-FU. U všech pacientů (včetně pacientů s pomalejší eliminací 5-FU) byl zastoupen nemutovaný (wt) genotyp, mutace IVS14+1 G>A nebyla detekována.

Postup vyšetření genotypu a farmakofenotypu DPD byl zaveden do diagnostické laboratorní praxe pro pacienty MOÚ (http://www.mou.cz/file.html?id=1223), genotypizace DPYD byla akreditována ČIA, o.p.s. dle kritérií ČSN EN ISO15189. Výhodou zvoleného komplexního postupu je, že sleduje i rychlost eliminace metabolitu 5,6-DHFU, která může být snížena i u jedinců s deficitem v dalším enzymu této dráhy, DHP, a řadí se k vhodným screeningovým vyšetřením predikující vznik závažné toxicity po podání 5-FU a jeho derivátů.

Práce byla podpořena z OP VaVpI financovaným Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky pro RECAMO (CZ.1.05/2.1.00/03.0101) a projektem BBMRI_CZ (LM2010004).

Lymfomy se dvěma zásahy

Šmardová J.1, Moulis M.1, Klusáková J.2, Lišková K.1, Hrabálková R.1

¹Ústav patologie FN, Brno

²Bioptická a cytologická laboratoř, MDgK plus spol. s r.o., Újezd u Brna

e-mail: jsmardova@fnbrno.cz

B-lymfomy vznikají klonální proliferací B-lymfocytů v různých fázích jejich diferenciace, od naivních B-buněk po zralé plazmatické buňky. Pro nehodgkinské B-lymfomy jsou charakteristické chromozomální translokace a aberantní somatické hypermutace, které jsou důsledkem chyb mechanismů, které se fyziologicky podílejí na remodelaci imunoglobulinových genů během zrání B-lymfocytů. Translokace a hypermutace postihují geny, jejichž produkty regulují buněčný cyklus, programovanou buněčnou smrt nebo jsou klíčovými regulátory diferenciace B-lymfocytů (např. c-myc, BCL2, BCL6, PAX5). Tyto tzv. primární genetické změny zajišťují účinnou proliferaci a přežívání buněk a vytvářejí možnost akumulace sekundárních genetických změn, které umožňují další progresi lymfomů. Asi 40 % B-lymfomů nese charakteristickou reciprokou chromozomální translokaci. Například pro folikulární lymfomy je charakteristická translokace t(14;18) způsobující vysokou expresi BCL2, translokace typické pro Burkittův lymfom zahrnují gen c-myc, pro lymfomy z buněk plášťové zóny je charakteristická translokace t(11;14), jejímž důsledkem jsou vysoké hladiny cyklinu D1. Jako lymfomy se dvěma zásahy („double-hit lymphomas“) byly původně označovány B-lymfomy, které nesly zároveň přestavbu genu c-myc a genu BCL2. Nyní se tak obecněji označují lymfomy s násobnými primárními genetickými změnami. Jsou velmi agresivní a často rezistentní ke standardní terapii. V našem příspěvku prezentujeme případ 53letého muže s B-lymfomem s translokací t(14;18) a přestavbou genu c-myc.

Tato práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR číslo NT/13784-4/2012.

Význam mutací v genech ATM a TP53 u chronické lymfocytární leukémie – implikace pro terapii

Trbušek M.^1,2, Navrkalová V.^1,2, Malčíková J.^1,2, Šebejová L.², Šmardová J.², Zemanová J.^1,2, Staňo-Kozubík K.^1,2, Doubek M.^1,2, Brychtová Y.², Mayer J.^1,2, Pospíšilová Š.^1,2

¹Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno

²Fakultní nemocnice, Brno

e-mail: mtrbusek@fnbrno.cz

Úvod: Proteiny ATM a p53 hrají klíčovou roli při odpovědi buňky na poškození DNA způsobené jak postupnou maligní transformací, tak i navozené záměrně při aplikaci chemoterapie. U chronické lymfocytární leukémie (CLL) jsou defekty v těchto genech považovány za nejvýznamnější negativní prognostický faktor. Zcela běžně se defekty ztotožňují s heterozygótními delecemi 11q, resp. 17p. Nejsou to však tyto delece, nýbrž mutace druhé kopie obou genů, které rozhodují do největší míry o výsledné funkčnosti kódovaných proteinů.

Metody: Stanovili jsme přítomnost delecí v obou těchto genech (pomocí I-FISH) i mutací, a to u 140 pacientů pro ATM a u 550 pacientů pro TP53. Pro identifikaci mutací v genu ATM jsme použili resekvenační čip Affymetrix a paralelně Western blot proteinu ATM a dále funkční testování proteinu ATM. Pro detekci mutací v genu TP53 jsme pak použili kvasinkovou funkční analýzu FASAY s následným sekvenováním a/nebo přímé sekvenování genomové DNA. Určili jsme prediktivní a prognostický význam inaktivace ATM resp. p53 v našem souboru CLL pacientů.

Výsledky: Mutace v genu ATM identifikované u 22 pacientů (16 %) vedly jednotně k celkové eliminaci funkce proteinu ATM. Tato eliminace byla zřejmá z narušené indukce genů p21, PUMA, BAX a GADD45 po aplikaci doxorubicinu (induktor dvouřetězcových zlomů), což rezultovalo i v silnou rezistenci příslušných buněk na tuto látku. Čas do první terapie byl u pacientů s mutací stejný jako u těch s pouhou delecí 11q. Defekt genu TP53 byl nalezen u 100 CLL pacientů (18 %), z nichž 96 neslo mutaci – buď samostatně nebo ve spojení s delecí 17p. Reakce těchto pacientů na terapii byla obecně špatná a i jejich přežití bylo výrazně kratší ve srovnání se všemi ostatními testovanými genetickými skupinami. U části pacientů byly mutace v TP53 zaznamenány v dominantním procentu buněk až po terapii a u části pacientů byly tyto mutace spojeny i se silným ziskem onkogenní funkce.

Závěr: Mutace v genu ATM vedou ke kompletní eliminaci funkce příslušného proteinu a následně k velmi silné rezistenci na léky vyvolávající primárně dvouřetězcové zlomy. Defekty genu TP53 jsou spojeny s velmi špatnou prognózou CLL pacientů – rezistencí na léčbu a krátkým přežitím.

Podpořeno projektem CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Molekulárně genetická diagnostika u pacientů s retinoblastomem – kazuistika

Vaňásková M.¹, Valášková I.¹, Zrůstová J.¹, Kepák T.², Gaillyová R.¹

¹Oddělení lékařské genetiky FN, Brno

²Klinika dětské onkologie FN, Brno

e-mail: martina.vanaskova@fnbrno.cz

Retinoblastom je maligní nádor sítnice vyskytující se u dětí do 5 let věku s incidencí 1 : 15 000 až 1 : 20 000. Vznik nádoru je podmíněn mutacemi v genu RB1, který kóduje retinoblastomový tumor supresorový protein. Tento protein se uplatňuje při regulaci buněčného cyklu. Existují dvě formy retinoblastomu: hereditární a sporadická. Závažnější hereditární forma onemocnění se manifestuje v časnějším věku a je s ní spojen výskyt více nádorových ložisek. U této hereditární formy bývá přítomna zárodečná mutace genu RB1, která spolu s pozdější somatickou mutací postihující druhou alelu dává vzniknout nádoru. U této hereditární formy retinoblastomu je riziko přenosu zárodečné mutace do dalších generací. Molekulárně genetická analýza genu RB1 je klíčovým vyšetřením při diagnostice a určování formy retinoblastomu a dále při vytvoření léčebné strategie.

Molekulárně genetické vyšetření genu RB1 je prováděno na úrovni DNA nebo RNA izolované z krve pacienta pro detekci případné zárodečné mutace. U pacientů s dostupným biologickým materiálem z tumoru je vyšetřována nádorová tkáň za účelem detekce somatických mutací. V přednášce budou prezentovány kazuistiky, kde bylo pro detekci mutací využito široké spektrum molekulárně genetických metod.

Sledování množství kopií genu TSPY a TSPX u pacientů s gonadálním tumorem, buněčných linií a kontrol

Vodička R.¹, Kvapilová M.¹, Vrtěl R.¹, Filipová H.¹, Křížová K.², Šantavý J.¹

¹Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny FN, Olomouc

²Laboratoř molekulární patologie LF UP, Olomouc

e-mail: vodickar@fnol.cz

Úvod: Lokus genu TSPY je umístěn na chromozomu Y. TSPY je protein se specifickou expresí ve varlatech. Homologem ke genu TSPY je TSPX, jehož lokus se nachází na chromozomu X. Tento gen se normálně exprimuje ve vaječnících i varlatech. Zvýšená exprese TSPY byla zjištěna ve zhoubných tkáních. Exprese TSPY urychluje přechod mezi G2/M fází buněčného cyklu prostřednictvím cyklinu D2, a pozitivně tak ovlivňuje proliferaci a iniciaci tumorogeneze. Naproti tomu nadměrná exprese proteinu TSPX nebo SET vede k zastavení buněk v G2/M fázi.

Cíle: Kvantifikovat počet kopií genů TSPY a TSPX a sledovat změny v počtu kopií TSPY/X genů a jejich vzájemných poměrů u sledovaných souborů.

Metoda: Soubor pacientů: deset pacientek a osm pacientů s gonadálnímí tumory, pět prostatických buněčných linií (DU-145, LAPC-4, PC-3, RWPE-I, LNCeP), 80 kontrol mužů a 80 kontrol žen. Projekt byl vypracován v rámci grantového projektu UPOL LF_2011_004.

Relativní kvantifikace kopií genů TSPY a TSPX byla provedena kapilární elektroforézou v porovnání s jednokopiovým genem amelX a amelY.

Výsledky: U pacientů se seminomem je pozorováno větší zastoupení kopií genu TSPY oproti genu TSPX ve srovnání s kontrolami. Počet kopií genu TSPX u kontrolní skupiny mužů je vyšší než u pacientů se seminomy. U žen s karcinomy je naznačena větší variabilita počtu kopií TSPX. Kontrolní soubor žen má v průměru větší počet kopií genu TSPX než pacientky s tumory. U prostatických buněčných liniíDU-145, LAPC-4 a LNCeP je patrný nárůst počtu kopií TSPY oproti kontrolní skupině.

SEKCE KLINICKÉ GENETIKY

DNA diagnostika familiárnej hypercholesterolémie na Slovensku

Balážiová D.¹, Staníková D.^1,3, Hučková M.¹, Staník J.^1,2, Vohnout B.^1,2, Gašperíková D.¹, Rašlová K.^1,2, Klimeš I.¹

¹DIABGENE a Laboratórium diabetu a porúch metabolizmu, Ústav experimentálnej endokrinologie SAV, Bratislava, Slovenská republika

²Národné referenčné centrum pre FHLP SZU, Bratislava, Slovenská republika

³1.detská klinika DFNsP, LF UK, Bratislava, Slovenská republika

e-mail: dominika.balaziova@savba.sk

Úvod: Familiárna hypercholesterolémia (FH) je monogénovo dedičné metabolické ochorenie, ktoré je charakterizované od narodenia vysokou hladinou celkového a LDL-cholesterolu, šľachovou xantomatózou a vysokým výskytom včasného infarktu myokardu v mladom a strednom veku. Familiárna hypercholesterolémia (FH) je podmienená mutáciami v géne pre LDL-receptor (LDLR). Fenokópiami FH sú familiárny defektný apo-B-100 (FDB), ktorý spôsobuje mutácia R3500Q v géne Apo-B100. FH3 má taktiež rovnaký klinický obraz ako klasická FH, avšak je podmienená mutáciou v géne PCSK9. Autozómovo recesívna hypercholesterolemia (ARH) je veľmi zriedkavé ochorenie, ktoré je podmienené mutáciami v géne LDLRAP1.

Cieľ: U pacientov s klinickou diagnózou FH: 1. vykonať DNA analýzu génov Apo-B100, LDLR, PCSK9, 2. zistiť mutačné spektrum zodpovedné za vznik familiárnej hypercholesterolémie v Slovenskej republike a 3. v prípade identifikácie nových variantov vykonať in silico analýzy s cieľom určenia ich potenciálnej patogenity.

Metódy: V spolupráci s Národným referenčným centrom pre FHLP a špecializovanými metabolickými ambulanciami boli do laboratória Diabgene odoslané vzorky od 6 detských a 56 dospelých pacientov s klinickým podozrením na FH. U týchto pacientov sme vykonali analýzu génov Apo-B100, LDLR, a PCSK9 metódami Real-time PCR (alelická diskriminácia) a priamym obojsmerným sekvenovaním. Gény sme analyzovali v poradí 1. ApoB-100, 2. LDLR, 3. PCSK9.

Výsledky: V celom súbore 62 pacientov sme metódou alelickej diskriminácie detegovali přítomnost najčastejšej mutácie R3500Q v géne ApoB-100 u dvoch pacientov(3 % pacientov z celého súboru). Následne sme u zvyšných 60 pacientov analyzovali priamym obojsmerným sekvenovaním gén LDLR. Prítomnosť mutácie sme potvrdili u 28 pacientov (45 % pacientov z celkového súboru), pričom sme identifikovali 17 známych mutácií. U 8 pacientov sme identifikovali 6 variantov, ktoré zatiaľ v dostupnej literatúre neboli popísané. In silico analýza nových variantov v exónoch 4, 8, 12 a 14 predpovedala ich pravdepodobnú patogenitu. Na druhej strane in silico analýza variantov v intrónoch 2 a 3 nepredpovedala žiadne zmeny na úrovni splicingu génu LDLR. U zvyšných 24 jedincov bez prítomnosti mutácie v LDLR sme analyzovali gén PCSK9, avšak bez nálezu mutácie.

Záver: DNA analýzou sme u 48 % slovenských pacientov potvrdili klinické podozrenie na FH. Najčastejšie išlo o mutácie v LDLR (45 %), u malého počtu pacientov (3 %) boli nájdené mutácie v géne ApoB-100. Mutácie v géne PCSK9 u analyzovaných pacientov neboli zistené. DNA diagnostika vie výrazne urýchliť diagnostický proces FH, pričom včasná diagnostika je kľúčom v včasném prevencii a liečbe závažných komplikácií.

Podporené projektom „Transendogen“ (ITMS kód projektu 26240220051).

DNA diagnostika monogénovej obezity u obéznych detí a morbídne obéznych jedincov po bariatrickom výkone

Balogová M.¹, Bužga M.², Staníková D.^1,3, Staník J.^1,3, Hučková M.¹, Holéczy P.⁴, Machatka E.⁵, Foltys A.⁵, Tichá Ľ.³, Virgová D.⁶, Zavacká I.⁷, Klimeš I.^1,8, Gašperíková D.^1,8

¹DIABGENE a Laboratórium diabetu a porúch metabolizmu, Ústav experimentálnej endokrinologie SAV, Bratislava

²Fyziologický ústav LF, Ostravská univerzita, Ostrava

³1.detská klinika DFNsP, LF UK, Bratislava

⁴Chirurgické oddelenie, Vítkovická nemocnica, Ostrava

⁵Katedra chirurgických odborov, Lekárska univerzita, Ostravská univerzita, Ostrava

⁶Detské oddelenie, NsP Levice

⁷Katedra biomedicínskych odborov Lekárska fakulta, Ostravská Univerzita, Ostrava

⁸Molekulárno – medicínske centrum SAV, Bratislava

e-mail: martina.balogova@savba.sk

Úvod: Obezita predstavuje komplexné ochorenie, ktoré je zapríčinené vplyvom genetických aj negenetických rizikových faktorov. Monogénová obezita je zapríčinená mutáciou v jednom z génov ležiacich na melano-kortínovej osi, ktorá hrá dôležitú úlohu v udržiavaní energetickej homeostázy organizmu. Najčastejšie ide o gény pre leptín, leptínový receptor a melanokortínový receptor 4. Mutácie v týchto génoch vedú k neselektívnej hyperfágii a následne k rozvoju morbídnej obezity už v rannom detstve. Aj keď v súčasnosti farmakologicky vieme ovplyvniť len monogénovú obezitu spôsobenú mutáciou v géne pre leptín, vo všetkých prípadoch je najdôležitejší včasný záchyt takýchto pacientov a ich správny menežment.

Cieľom našej práce bolo: 1. vykonať DNA analýzu génu pre melankortínový receptor 4 v súbore obéznych detí aj dospelých jedincov po bariatrickom zákroku, 2. vykonať DNA analýzu génu pre leptín a leptínový receptor v súbore detských pacientov vybraných na základe specifických klinických kritérií a 3. zistiť prevalenciu mutácií v géne pre melanokortínový receptor 4 v týchto cieľových skupinách.

Metódy: DNA analýzu sme vykonali v súbore 265 pacientov metódou priameho obojsmerného sekvenovania. Prvý súbor pozostával zo 130 dospelých pacientov (88 žien, 42 mužov) s priemerným vekom 42,4 ± 10,4, BMI 43,72 ± 7,70 kg/m² a s priemerným vekom vzniku obezity 19,7 ± 13,0 rokov, ktorí podstúpili bariatrický zákrok. Druhý súbor tvorilo 135 detí (60 chlapcov a 75 dievčat) s BMI nad 97. percentilom a priemerným vekom vzniku obezity 4,0 ± 3,0 rokov, ktorí spĺňali základné klinické kritéria pre vyhľadávanie monogénovej obezity: 1. obezita (BMI nad 97. percentilom pre daný vek a pohlavie), 2. obezita vzniknutá do 10. roku života, 3. pozitívna rodinná anamnéza (výskyt obezity aspoň u jedného prvostupňového príbuzného). V celom súbore pacientov sme analyzovali gén pre melanokortínový receptor 4, a následne na základe fenotypových kritérií sme vyšpecifikovali v súbore obéznych detí jedincov vhodných na DNA analýzu génu pre leptín (8 pacientov) a leptínový receptor (9 pacientov).

Výsledky: V súbore detí sme identifikovali dvoch pacientov s dvoma rôznymi mutáciami v géne pre melanokortínový receptor 4, ktoré boli už v minulosti popísané. V prvom prípade sa jednalo o pacientku s mutáciou p.Ser19X, u ďalšej pacientky sme potvrdili mutáciu p.Ser127Leu. V géne pre leptín a leptínový receptor sme neidentifikovali žiadne mutácie, ale identifikovali sme 7 pacientov s polymorfizmami v géne pre leptínový receptor (K109R, Q223R, S343S, K656N, P1019P), pozitivně korelujúcimi so zvýšeným množstvom tukového tkaniva v organizme. V súbore pacientov po bariatrickom zákroku sme rovnako ako v prvom súbore identifikovali 2 pacientov s rovnakou mutáciou v géne pre melanokortínový receptor 4 – p.Ser127Leu. V celom súbore sme identifikovali 19 pacientov s 2 typmi polymorfizmov v MC4R (V103I, I251L).

Záver: V našej štúdii sme zistili rovnakú prevalenciu monogénovej obezity podmienenej MC4R mutáciou v súbore obéznych detí, ako aj dospelých pacientov podstupujúcich bariatrický zákrok. DNA diagnostika závažnej obezity by mala napomôcť genetickému poradenstvu, prognostike a špecifickej terapii.

Podporené projektmi „Transendogen“ (ITMS kód projektu 26240220051).

Vztah mezi polymorfizmy v genu pro MSX1 a agenezemi zubů v české populaci

Bonczek O.¹, Krejčí P.², Lochman J.¹, Matalová E.³, Šerý O.¹, Míšek I.³

¹Laboratoř DNA diagnostiky, Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno

²Klinika zubního lékařství, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého, Olomouc

³Ústav živočišné fyziologie a genetiky, Akademie věd ČR, v.v.i., Brno

e-mail: bonczek@mail.muni.cz

Snížený počet zubů (hypodoncie) je nejčastější dědičnou poruchou lidské dentice. Vývoj zubu (odontogeneze) je velmi komplikovaný a komplexní proces, který zahrnuje souhru mezi ústním epitelem a buňkami přiléhajícího mezenchymu, které vycestovaly z neurální lišty. Tyto reciproké interakce jsou zprostředkovány více než 300 signálními molekulami, zahrnující Pax9, Msx1 a Axin2. Mutace v genech pro tyto tři molekuly byly asociovány s izolovanou (nesyndromickou) formou hypodoncie. Msx1 (člen rodiny genů muscle segment homeobox) je transkripční represor, který obsahuje DNA-vázající homeodoménu, jež je schopna interagovat s ostatními členy transkripčního komplexu, včetně Pax9. Jeho exprese byla identifikována pouze v dentálním mezenchymu.

Cílem této práce bylo studium mutací obou dvou exonových sekvencí genu pro MSX1. DNA pacientů byla izolována z krve nebo bukálních stěrů pomocí UltraClean BloodSpin DNA izolačního kitu (Mo-Bio) od 200 českých pacientů s různými typy agenezí zubů. Produkty PCR byly připraveny pomocí modifikované polymerázy Kapa 2G Robust Hot Start (Kapa Biosystems) vzhledem k vysokému podílu GC oblastí v DNA sekvenci. Amplikony byly sekvenovány pomocí genetického analyzátoru ABI 3130 Prism (Life Technologies). Výsledné sekvence byly porovnány se standardními sekvencemi a mutace byly popsány z hlediska jejich možného vlivu na proteinovou strukturu.

Byl identifikován nový polymorfizmus v genu pro MSX1, který způsobuje záměnu aminokyseliny Ala40Gly. Jak jsme v naší studii zjistili, tento polymorfizmus se objevuje jak u osob s hypodoncií, tak u kontrolních osob s plnou denticí. Dále byly nalezeny intronové polymorfizmy a exonové polymorfizmy, které nezpůsobují aminokyselinové záměny. Tyto změny v nukleotidové sekvenci nemají přímý vliv na proteinovou strukturu, ale mohou mít vliv na stabilitu a regulaci genové exprese. Další výzkum bude zaměřen na rodinné studie ve vztahu k polymorfizmům v genu pro MSX1 a agenezím zubů (resp. hypodoncie, oligodoncie) a na analýzu dalších genů pro proteiny zapojené do odontogeneze.

Projekt je podporován grantem IGA MZČR reg. č.: NT/11420 – 6/2010.

RASopathies and their molecular diagnostics

Čižmárová M.¹, Košťálová Ľ.², Bóday A.³, Tavares P.⁴, Kovács L.², Ilenčíková D.²

¹Laboratórium klinickej a molekulovej genetiky II. detskej kliniky DFNsP a LF UK Bratislava, Slovenská republika

²II.detská klinika DFNsP a LF UK, Bratislava, Slovenská republika

³Gendiagnostica Bratislava s.r.o., Slovenská republika

⁴CGC Genetics, Porto, Portugalsko

e-mail: cizmarova.m@gmail.com, michaela.cizmarova@dfnsp.sk

Noonan syndrome (NS), LEOPARD syndrome (LS), Cardio-facio-cutaneous syndrome (CFC), Costello syndrome (CS) and Neurofibromatosis-Noonan syndrome (NFNS) represent a family of genetically related disorders with similar spectrum of phenotypic signs especially such as typoval facial features, short stature and hereditary heart abnormalities. Other clinical manifestations of these syndromes are cutaneous anomalies and changes of nerve system so they are collectively called neuro-facio-cardio-cutaneous syndromes. Because of involvement the causal genes for these syndromes in RAS-MAPK signaling pathway they are also called RASopathies. These genes are: PTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, BRAF, NRAS, HRAS, MEK1, MEK2, SHOC2, CBL and NF1.

The diagnostics of RASopathies is more difficult in regard of similarity of their phenotypic manifestations. So molecular analysis has become an important key to confirm the clinical diagnosis in patients with RASopathies. This study has been focused on identification of mutations in causal genes and also on their correlations with phenotypic manifestations of these syndromes.

PTPN11 is the main causal gene for NS and LS and it was analyzed as the first. We have already examined 19 patients by mutation analysis of PTPN11 gene which consisted of polymerase chain reaction and direct sequencing of 15 coding exons. We identified three heterozygous point mutations. These mutations were located in exons 8 (c.854T>C), 13(c. 1471C>T) and 3 (c.188A>G). Mutations are the most often clustered in these exons. When no mutation in PTPN11 gene had been found in examined patients, multiplex PCR followed. This method enables the detection of 80 point mutations in 8 genes associated with RASopathies: 46 mutations in 4 genes causal for NS and 34 mutations in other genes for CFCF, CS and LS. Currently we are working on establishment of mutation analysis of other genes associated with NS, LS and CS: SOS1, RAF1 and HRAS genes. This study contributes to the creation of the RASopathy mutation database not only in Slovakia but also on international level and it allows to improve the RASopathy diagnostics.

Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) – favorable facts for molecular genetic testing

Ďurovčíková D.¹, Horská A.¹, Křepelová A.², Genčík A.³, Ilenčíková D.⁴

¹Slovak Medical University, Viliam´s Izakovič Institute of Genetics and Molecular Medicine, Dept of Medical Genetics, University Hospital, Bratislava, Slovakia

²Dept of Biology and Medical Genetics, 2nd Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic

³Medgene sro., Bratislava, Slovakia

⁴Children´s University Hospital, Bratislava, Slovakia

e-mail: darina.durovcikova@gmail.com

Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) is rare disorder (incidence 1 : 13 700), characterized by overgrowth, congenital anomaly and predisposition to tumor development in childhood. BWS is caused by epigenetic or genomic alterations which disrupt genes in one or both of the two imprinted domains on chromosome 11p15.5.

After the ocurrence of various types of genetic pathology in BWS, new strategies of molecular genetic testing have been established.

We present diagnostic experiences, BWS prevalence in Slovakia and some clinical data crucial for molecular genetic testing. Association of birth defects such as Exomphalos, Macrosomia, Gigantismus; previously recognised as a typical features of BWS, were absent in our patients. BWS may be underestimated because of its mild symptomatology in some cases, not easily diagnosed. Mutations outside the chromosome 11p15.5 region reported recently, extend the challenges in the diagnosis and genetic counseling of individuals and families with BWS. Development of new treatment strategies is very important moment for early diagnosis confirmation of this rare disorder by molecular genetic methods.

Od roztroušené sklerózy k X-vázané hereditární hypofosfatemické rachitidě

Faldynová L.¹, Plevová P.¹, Šilhánová E.¹, Procházka V.², Šenkeříková M.³, Zapletalová J.⁴

¹Oddělení lékařské genetiky FN, Laboratoř DNA diagnostiky, Ostrava 4

²Ústav radiodiagnostický FN, Ostrava

³Oddělení lékařské genetiky LF, Hradec Králové

⁴Ústav lékařské biofyziky LF UP, Olomouc

e-mail: lucie.faldynova@fno.cz

Roztroušená skleróza je autoimunitní onemocnění, v jehož patofyziologii se podle jedné z teorií může podílet nedostatek vitaminu D. Vyslovili jsme proto hypotézu, že některé varianty v genu VDR pro receptor vitaminu D by mohly predisponovat ke vzniku roztroušené sklerózy.

Metodou přímé sekvenace na genetickém analyzátoru ABI3130 byla vyšetřena kódující oblast, tj. exony 3–10, genu VDR u 24 pacientů s diagnózou roztroušené sklerózy. U 19 z nich, tj. u 79 %, byla nalezena misense varianta c.2T>C, která vede na úrovni proteinu k záměně p.Met1Thr. Její výskyt u pacientů s roztroušenou sklerózou byl vyšší, než se uvádí v databázích pro evropskou populaci (60 %). Proto byla provedena populační studie výskytu této varianty metodou RT-PCR s použitím FRET sond u 197 vzorků DNA osob bez roztroušené sklerózy s cílem zjistit frekvenci této varianty v české populaci. V kontrolní populaci byla zjištěna varianta c.2T>C u 159 osob, tj. u 81 %, rozdíl nebyl statisticky významný (p = 0,790, Fisherův exaktní test). Patogenní zárodečné mutace genu VDR způsobují hereditární rachitis. Analýza genu byla nabídnuta pro klinickou diagnostiku. K vyšetření genu byl odeslán pacient s hereditární rachitidou. Po zvážení klinických a laboratorních nálezů bylo stanoveno jako pravděpodobnější poškození genu PHEX. Byla provedena přímá sekvence celé kódující sekvence, tj. exonů 1–22, genu PHEX na genetickém analyzátoru ABI3130. Byla nalezena sestřihová mutace v akceptorovém sestřihovém místě c.1587 – 1G>A v hemizygotním stavu. Jedná se o dosud nepopsanou mutaci, kterou lze považovat za patogenní, tj. za příčinu hereditární X-vázané hereditární hypofosfatemické rachitidy u probanda.

Práce byla podpořena grantovým projektem Krajského úřadu Moravsko-slezského kraje 01934/2011/RRC.

Gonadální mozaicismus při diagnostice monogenně dědičných onemocnění – kasuistiky

Gaillyová R., Valášková I., Kadlecová J., Bittnerová A.

Oddělení lékařské genetiky FN, Brno

e-mail: gaillyova@fnbrno.cz

Duchennova svalová dystrofie a syndrom prodlouženého QT intervalu jsou známá, monogenně dědičná onemocnění, která jsou běžně vyšetřována na pracovištích lékařské genetiky. Atypický výskyt onemocnění se známou mendelovskou dědičností, případně známému typu dědičnosti neodpovídající nosičství mutace resp. přenašečství choroby v rodokmenu někdy vyžaduje doplňující vyšetření (analýza DNA dalších příbuzných, analýza DNA izolované z ejakulátu, bukálního, vaginálního a cervikálního stěru) i vyloučení nonpaternity.

Odhalení, resp. podezření na gonadální mozaicismus je významné pro určení rizika opakování onemocnění v rodině, genetické poradenství a doporučení prenatálních vyšetření.

Renaissance of the role of the clinical genetician in molecular analysis

Gencik-Guillier Z., Gencik A.

Medgene (Bratislava), Diagenos (Osnabrück)

e-mail: a.gencik@osnanet.de

New technologies like molecular cytogenetics, second generation sequencing, analysis of exom and genom are entering in the everyday praxis of clinical geneticians.

Based on our experience with more than 1000 examinations with oligo array CGH, 500 patients with NGS, analysis of around 150 genes on 23 panels and 10 analysis of exoms we reevaluate the actual role of clinical genetician in the molecular diagnostic.

Supported by concrete examples, we present the decisive role of clinical genetician in evaluating the significance of defined genomic changes, concerning mainly variable expressivity or different inter- and intra– familiary penetrance. As a matter of fact, with simplified bioinformatic processes and with application of selective filters, the importance of the right indication and interpretation is increasing and this not only with regard to the phenotypes and the sequence variants, but progressively also with regard to the pathomechanisms on molecular, cellular, transcriptional and biochemical level. Thanks to the possibility of the analysis of the exom and genom the clinical genetics is leaving its asymetric position of announcing the results of molecular analysis in the sense of „one mutation establishes a diagnosis“. Human genetics is becoming a fullfletched clinical discipline, in which the focus is the care of the patient with genetic changes and the care of his family. While the molecular-laboratory results help to establish the diagnosis, the main task of the physician specialised in clinical genetics centers on the care of the patient by taking in account the complex pathogenic processes on different levels. His task includes specifycing the indication, the diagnosis and the prognosis, the decision of causal or symptomatic therapy, the recognition of the risk factors and their prevention and the establishement of the probability of transmission on the next generations.

In this way we make an important path towards the individualised medicine, the consequences of which are going to be larger than those of personalised medicine, like we start to know them in other subspecialities (oncogenetics, microbiology, evolutional genetics). Individual medicine is not only taking into account the changes of one or more genes, but will gradually enclose the variability of the whole genome or of its parts, including for example epigenetic influences.

Preimplantační genetická diagnostika translokací metodou array CGH

Horák J.^1,2, Horňák M.^1,2, Beránková K.^1,2, Musilová P.^1,2, Oráčová E.¹, Trávník P.¹, Veselá K.¹, Rubeš J.²

¹Repromeda s.r.o., Brno

²Výzkumný ústav veterinárního lékařství v.v.i., Brno

e-mail: jhorak@repromeda.cz

Translokace jsou strukturními aberacemi chromozomů, při kterých mezi dvěma různými chromozomy dojde k fúzi, anebo ke vzájemné výměně částí jejich ramen. Oblasti zlomů v ramenech chromozomů leží většinou mimo geny a regulační oblasti, a proto výskyt translokace v karyotypu není obvykle spojen se změnou fenotypového projevu jedince. Při tvorbě pohlavních buněk dochází během meiózy k rozchodu chromozomů, což u jedinců s translokací vede k tvorbě nebalancovaných gamet (18,6–80,7 %). Pokud se nebalancovaná gameta spolupodílí na vzniku embrya, dochází během těhotenství nejčastěji ke spontánnímu potratu aneuploidního plodu, anebo ve vzácných případech k narození dítěte s vážnými vývojovými vadami a mentální retardací. Nosičství translokace snižuje fertilitu jedince a tento efekt je o to výraznější ve spojení s dalšími faktory snižujícími fertilitu.

Preimplantační genetická diagnostika (PGD) je časnou formou prenatálního vyšetření embrya prováděnou ještě před zavedením embrya do dělohy matky a před jeho implantací v děloze. Výběr euploidních embryí vhodných k transferu do dělohy získaných pomocí technik in vitro fertilizace (IVF) a vzniklých z balancovaných gamet přenašeče reciproké translokace snižuje frekvenci potratů, zvyšuje fertilitu a umožňuje narození zdravého dítěte.

V současné době metoda array CGH umožňuje provedení PGD translokací na DNA čipech a srovnání s dříve používanou metodou FISH poskytuje vyšší spolehlivost, snadnější provedení a zároveň umožňuje screening aneuploidií u všech 24 chromozomů člověka. V naší studii jsme shrnuli zkušenosti s metodou array CGH u IVF cyklů s PGD translokací na našem pracovišti.

Vývoj chromozomových abnormalit v lidských IVF embryích

Horňák M.^1,2, Beránková K.^1,2, Horák J.^1,2, Oráčová E.², Trávník P.², Veselá K.², Rubeš J.^1,2

¹Výzkumný ústav veterinárního lékařství v.v.i., Brno

²Repromeda s.r.o., Brno

e-mail: hornak@vri.cz

Preimplantační genetická diagnostika (PGD) představuje ranou formu prenatálního screeningu prováděnou před implantací embrya do dělohy matky na pólových tělískách nebo na embryích získaných technikou in vitro fertilizace (IVF). Přestože je prokázán negativní dopad chromozomových poruch na vývoj a implantaci lidských IVF embryí, jejich rutinní screening je ztížen zejména výskytem post-zygotických mitotických poruch vedoucích k chromozomovému mozaicismu. Tento druh chromozomových abnormalit vykazuje značnou dynamiku vývoje zejména od raných embryí po vyšší stadia blastocyst.

S použitím metody arrayCGH jsme sledovali výskyt a vývoj chromozomových poruch u raných lidských IVF embryí. Doposud jsme vyšetřili 928 blastomer bioptovaných z raných embryí a 132 biopsií trofoblastu vyšších stadií embryí – blastocyst. Embrya, u kterých bioptovaná blastomera vykazovala chromozomové abnormality, byla následně dovyšetřena ve vyšším stadiu. ArrayCGH oproti doposud používané metodě FISH nabízí screening všech 24 chromozomů a detekci částečných chromozomových abnormalit. Rovněž, v porovnání s metodou FISH, přináší vyšší úspěšnost a spolehlivost detekce aneuploidií. Nevýhodu arrayCGH je omezená detekce polyploidií.

Cílem naší studie je určení frekvence aneuploidií a jejich charakter u jednotlivých typů biopsií a popis vývoje chromozomových abnormalit v lidském IVF embryu, to vše s ohledem na optimální provedení PGD. Přestože jsme dovyšetřili relativně malý počet embryí, naše výsledky poukazují na dynamický vývoj těchto poruch u lidských IVF embryí. Rovněž jsme získali cenné informace o původu a o korelaci chromozomových abnormalit s vývojem embryí.

Problematic diagnostics of an overlapping syndrome – juvenile polyposis and hereditary haemorrhagic telangiectasia

Ilencikova D.¹, Kovacs L.¹, Paalova E.², Skorvaga M.³

¹Department of Pediatrics Comenius University Medical School Hospital, Bratislava, Slovakia

²Department of Clinical Genetics, University Children´s Hospital, Kosice, Slovakia

³Cancer Research Institute, Slovak Academy of Sciences, Department of Molecular Genetics, Bratislava, Slovakia

e-mail: denisa.ilencikova9@gmail.com

Here, we present the case of 16-year-old male with a very demanding childhood disease burden characterized by abdominal pains, colon polyposis, rectal bleeding and epistaxis from the age of 6. This patient exhibited a SMAD4 mutation resulting in a very rare genetic disorder, a combined syndrome of juvenile polyposis syndrome (JPS) and hereditary haemorrhagic telangiectasia (HHT). JP-HHT patients usually exhibit both epistaxis and telangiectases, although these symptoms may not be as severe or numerous as the symptoms observed in HHT patients. Our patient developed epistaxis and digital clubbing, but HHT was recognized and diagnosed after a molecular diagnosis. For this reason, the molecular diagnosis of JP-HHT is of vital importace to both JP and HHT patients, who must be carefully screened for all of the manifestations of both diseases. Currently, there is great effort to summarize relevant information that allows us to recommend an optimal surveillance and cancer prevention program for mutation carriers. Thus, this case report presentation with a literature review and a detailed description of the clinical course of the affected child may contribute to improvements in the clinical management of children with JPS and HHT.

Hereditární arytmické syndromy a jejich klinická a molekulárně genetická diagnostika

Novotný T.¹, Kadlecová J.², Valášková I.², Raudenská M.³, Andršová I., Floriánová A., Vašků A.³, Gaillyová R.², Špinar J.¹

¹Interní kardiologická klinika FN a LF MU, Brno

²Oddělení lékařské genetiky FN a LF MU, Brno

³Ústav patologické fyziologie LF MU, Brno

e-mail: tnovotny@fnbrno.cz

Úvod: Hereditární arytmické syndromy jsou choroby spjaté se zvýšeným rizikem maligních arytmií i náhlé smrti. U velké části pacientů jsou příčinou mutace genů pro iontové kanály myokardu.

Metody: Vyšetřili jsme příslušníky celkem 67 rodin s klinickou diagnózou syndromu dlouhého QT intervalu (LQTS). V těchto rodinách bylo prováděno komplexní klinické vyšetření a mutační analýza genů KCNQ1, KCNH2, SCN5A, KCNE1, KCNE2 včetně promotorových oblastí. Dále byli vyšetřováni členové sedmi rodin s výskytem katecholaminergní polymorfní komorové tachykardie (CPVT), u probandů byly analyzovány vybrané oblasti genu RyR2.

Výsledky: Ve skupině LQTS byly nalezeny mutace genu KCNQ1 ve 22 rodinách, KCNH2 v sedmi rodinách, v další rodině se jednalo o složený heterozygotismus. V rámci vstupního vyšetření byla klinická diagnóza stanovena jen u 66 % nosičů mutací, následný ergometrický test dokázal identifikovat 89 % postižených. Ve skupině CPVT byla klinická diagnostika zcela závislá na zátěžovém testu, mutace genu RyR2 byly nalezeny u čtyř probandů ze sedmi (57 %).

Závěry: Zátěžový ergometrický test je základním pilířem klinické diagnostiky hereditárních arytmických syndromů. Mutační analýza asociovaných genů umožní identifikaci symptomatických nosičů potenciálně nebezpečné mutace a zavedení odpovídajících opatření k prevenci náhlé smrti.

Výzkum je podporován projektem specifického výzkumu MUNI/A/0811/2011 projektem (Ministerstva zdravotnictví) koncepčního rozvoje výzkumné organizace 65269705 (FN Brno).

Mutace v genech PKD1, PKD2 a PKHD1 v rodinách s polycystickou chorobou ledvin v České republice

Obeidová L.¹, Štekrová J.¹, Reiterová J.², Elišáková V.¹, Kohoutová M.¹, Tesař V.²

¹Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN, Praha

²Klinika nefrologie 1. LF UK a VFN, Praha

e-mail: lena.obeidova@gmail.com

Autozomálně dominantní polycystická choroba ledvin (ADPKD) je nejčastější geneticky podmíněné renální onemocnění a postihuje přibližně jedno z 1000–400 živě narozených dětí. ADPKD je onemocnění, které je charakterizováno vznikem renálních cyst a u pacientů se mimo jiné projevuje arteriální hypertenzí, infekcemi močových cest a nefrolitiázou. Přibližně polovina pacientů dosáhne chronického selhání ledvin (ESRD) do 70 let. ADPKD je způsobena mutacemi v genech PKD1 (85 % případů) a PKD2 (15% případů).

Dalším typem polycystické choroby ledvin je autozomálně recesivní PKD s nižší incidencí (přibližně 1 : 20 000), ale se závažnějším průběhem. Třicet až padesát procent novorozenců s ARPKD umírá krátce po porodu a pacienti, kteří přežijí toto období, dosahují chronického selhání ledvin v adolescenci či při dosažení dospělosti. ARPKD je způsobena mutacemi v genu PKHD1.

Molekulární diagnostika ADPKD je prováděna pomocí vazebné analýzy využívající vysoce polymorfních mikrosatelitních markerů či přímou diagnostikou metodami DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), heteroduplexovou analýzou či MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) s následnou sekvenací. V poslední době byla mezi metody přímé diagnostiky přidána i metoda HRM (high resolution melting) a NGS (next generation sequencing), a to i pro PKHD1 gen u pacientů s ARPKD.

Zatím byla v naší laboratoři provedena diagnostika PKD1 genu v přibližně 150 rodinách a mutace byly nalezeny u 57 z nich. Většina mutací byla unikátních pro Českou republiku. Diagnostika genu PKD2 byla provedena přibližně u 200 pacientů a v 38 rodinách byla nalezena pravděpodobně kauzální mutace. Více jak polovina mutací byla v tomto genu nalezena v 1. exonu.

Nové technologie používané v molekulární genetice mohou jednoznačně zrychlit identifikaci mutací v genech PKD a PKHD1, čímž umožní včasnou presymptomatickou a prenatální molekulární diagnostiku u pacientů s polycystickou chorobou ledvin. Do budoucnosti lze očekávat rozšíření mezinárodních databází mutací, které mohou mít význam pro interpretaci výsledků, stanovení prognózy, prevence a léčebných zásahů u jejich nositelů.

Podporováno z grantových projektů IGA MZCR NT 13090-4 a PRVOUK- P25/LF1/2.

Preimplantační genetická diagnostika monogenních chorob metodou PGH – naše pětileté zkušenosti a nejzajímavější kazuistiky

Putzová M., Soldátová I., Borgulová I., Krautová L., Krutílková V., Míka J., Křen R., Stejskal D.

GENNET, s.r.o.

e-mail: martina.putzova@gennet.cz

Preimplantační genetická diagnostika (PGD) monogenních chorob se na našem pracovišti provádí od roku 2007, naše výsledky každoročně prezentujeme na národních i mezinárodních fórech.

Metodika úzce navazuje na techniky in vitro fertilizace (IVF) a je založena na analýze a vyloučení genetických abnormalit u embryí v časném stadiu jejich vývoje ještě před transferem zpět do dělohy a následnou implantací. PGD monogenně podmíněných chorob v naší laboratoři vychází z principu preimplantační genetické haplotypizace (PGH). V současné době máme v našem centru zavedenu diagnostiku šedesáti čtyřech monogenních onemocnění. PGD diagnostiku jednotlivých genů zavádíme dle požadavků našich pacientů, a proto se seznam genů, které jsme touto metodou schopni diagnostikovat, neustále rozšiřuje. PGD diagnostiku nabízíme jako vyžádanou službu rovněž širokému spektru pacientů IVF center, s kterými v České republice spolupracujeme. V příspěvku budou prezentovány souhrnné výsledky a nové zajímavé kazuistiky z naší dosavadní praxe.

Studium efektů missense mutací v enzymu PheOH pomocí teoretických metod

Réblová K.¹, Hrubá Z.², Fajkusová L.²

¹Ceitec MU, Brno

²CMBGT, Dětská nemocnice FN, Brno

e-mail: kristina@physics.muni.cz

Missense mutace v jaterním enzymu PheOH (fenylalaninhydroxyláza), který katalyzuje hydroxylaci fenylalaninu na tyrosin, způsobují autozomálně recesivní dědičné onemocnění metabolismu – fenylketonurii (PKU). Mutace buď porušují katalytickou funkci enzymu (funkční mutace), nebo častěji ovlivňují stabilitu proteinu a vedou k problémům při foldování (strukturní mutace). Strukturní mutace jsou často spojeny se změnou velikosti aminokyseliny, hydrofobicity/náboje a také se ztrátou strukturně důležitých kontaktů, jakými jsou vodíkové vazby a stacking. V současnosti je popsáno více než 550 různých mutací v genu pro PheOH (http://www.pahdb.mcgill.ca) a pro některé z nich jsou určeny vztahy mezi genotypem a fenotypem.

Mutace mají různě devastující vliv na strukturu a funkci enzymu PheOH a lze je roztřídit na mutace způsobující lehkou formu PKU (non-PKU HPA), střední formu PKU (variant PKU) a těžkou formu PKU (classical PKU). Na našem pracovišti bylo v minulých letech diagnostikováno více než 650 pacientů s PKU. Při molekulárně biologických analýzách jsme detekovali sedm nových missense mutací (p.N167Y, p.T200N, p.D229G, p.F263S, p.L358F, p.K396R a p.I406M), které nebyly dříve popsány a u kterých není znám fenotypový projev. U těchto missense mutací jsme provedli strukturní analýzu pomocí bioinformatických nástrojů a molekulově dynamických simulací s cílem odhadnout jejich vliv na strukturu a funkci PheOH. Rovněž jsem provedli strukturní analýzu mutací převážně asociovaných s těžkou nebo lehkou formou PKU.

Cystická fibróza, vývoj metodických postupů molekulární diagnostiky

Valášková I., Nečasová J., Gaillyová R.

Oddělení lékařské genetiky FN, Brno

e-mail: ivalaskova@fnbrno.cz

Detekce mutace F508del v CFTR genu byla první metodou přímé DNA analýzy, kterou zahájila provoz laboratoř DNA diagnostiky na našem pracovišti v roce 1990. Naše laboratoř má tedy 22letou zkušennost s testováním CFTR genu a u většiny CF pacientů je schopna provést potvrzení diagnózy CF na molekulární úrovni identifikací dvou mutantních CF alel, buď ve formě jedné mutace v homozygotním stavu, nebo dvou různých mutací v smíšeném heterozygotním stavu.

K detekci nejfrekventovanějších mutantních alel bylo využíváno široké spektrum různých diagnostických metod a byla zavedena „kaskádovitá“ strategie pro rutinní molekulární diagnostiku CF zahrnující mutační a vazebnou analýzu (přímá a nepřímá diagnostika).

Vysoký počet vyšetření prováděných v našem CF programu vyžaduje rychlý, bezpečný a jednoduše interpretovatelný test. Tyto požadavky definitivně splňuje zavedený „in house“ diagnostický test založený na analýze bodu tání fluorescenčně značených prob po vysokorychlostní PCR amplifikaci prováděný na real-time. Touto metodou je po izolaci DNA z krve detekováno sedm pro genotyp významných CF mutací (F508del, CFTRdele2,3(21kb), G542X, G551D, R553X, N1303K, R117H) za méně než jednu hodinu s citlivostí okolo 85 %. To znamená, že u většiny CF pacientů je detekována nejméně jedna mutovaná alela.

Senzitivita vyšetření v našem CF programu je zvyšována detekcí dalších 29 častých CF mutací, prováděnou pomocí hybridizačního kitu INNO-LIPA CFTR19, INNO-LIPA CFTR17. Scoring 50 CF mutací provádíme metodou ARMS (Amplification refractory mutation system) pomocí kitu Elucigene CF-EU2v1, kdy vyšetřené mutace představují cca 93 % všech mutací genu CFTR vyskytujících se u českých pacientů s cystickou fibrózou.

Uvedenými postupy však nejsme schopni detekovat raritní a neznámé CF sekvenční varianty. Proto provádíme scanning celé kódující oblasti genu CFTR. Postupně jsme využívali rozličné vyhledávací metody jako DGGE, SSCP s následnou sekvenací. Tyto postupy nám umožnily identifikovat, kromě jiných, tři doposud nepopsané sekvenční varianty. V současné době používáme k scannigu genu CFTR metodický postup multiplexní amplifikace specifických cílových sekvencí kombinované s následným sekvenováním za využití platformy sekvenování nové generace. Tento metodický postup umožňuje vysoce výkonné a finančně efektivní sekvenování, a tím přináší v krátké době správné a přesné výsledky. Do rutinního vyšetření genu CFTR zavádíme také analýzu exprese.

Některé sekvenční varianty mohou vést k poruše sestřihu. Pro ověření aberantního sestřihu jsme zavedly metodické postupy detekce poruchy sestřihu na úrovni cDNA.

DNA analýza CFTR genu je využívána pro postnatální, prenatální i preventivní vyšetření. Při DNA diagnostice CFTR genu spolupracujeme především s centry pro cystickou fibrózu pro děti a dospělé, centry asistované reprodukce, neonatology, pediatry, gynekology, gastroenterology a dalšími specialisty. Nedílnou součástí DNA diagnostiky na našem pracovišti je i genetické poradenství v rodinách s výskytem CF včetně vyhledávání nosičů mutací CFTR genu. Jsme jedním ze dvou center v České republice, kde se provádí molekulárně genetické vyšetření novorozeneckého screeningu CF.

V našem sdělení prezentujeme vývoj analýz CFTR genu ve sledovaném období 22 uplynulých let, počty, použité metodiky, indikační skupiny, záchyt mutací CFTR genu a jejich geografické rozložení ve spádové oblasti jižní Morava. Úspěšnost naší diagnostiky dokumentujeme na několika kazuistikách.

Senzitivita, špecificita a pozitívna prediktívna hodnota DHPLC ako pre-skríningovej metódy pri DNA diagnostike monogénového diabetu

Valentínová L.¹, Hučková M.¹, Mašindová I.¹, Balogová M.¹, Staník J.^1,2, Klimeš I.¹, Gašperíková D.¹

¹Laboratórium diabetu a porúch metabolizmu & DIABGENE, Ústav experimentálnej endokrinológie, Slovenská Akadémia Vied, Bratislava, Slovakia

²I. detskská klinika Lekárskej Fakulty Univerzity Komenského a Detskej Fakultnej Nemocnice s Poliklinikou, Bratislava, Slovakia

e-mail: lucia.valentinova@savba.sk

Úvod: Monogénový diabetes vzniká mutáciou jedného z génov riadiacich funkciu beta buniek pankreasu a zapríčiňuje 1–2 % všetkých prípadov diabetes mellitus. Klinické podozrenie na toto ochorenie je nutné potvrdiť DNA analýzou. Na rýchlu DNA diagnostiku sa donedávna využívala DHPLC ako pre-skríningová metóda, avšak údaje o jej senzitivite pri skríningu pacientov s monogénovým diabetom sa líšia.

Cieľom práce preto bolo: 1. re-analyzovať priamym sekvenovaním vzorky v minulosti analyzované DHPLC metódou, 2. na základe získaných výsledkov stanoviť senzitivitu, špecificitu a pozitívnu prediktívnu hodnotu tejto pre-skríningovej metódy a 3. zhodnotiť vhodnosť DHPLC metódy na skríning mutácií u pacientov s klinickým podozrením na monogénový diabetes.

Metóda: DHPLC (denaturačná vysokoúčinná kvapalinová chromatografia) je založená na principe rozdielnej rýchlosti vyplavovania heterogénnych a homogénnych molekúl DNA z kolóny v závislosti od ich teploty topenia. Touto technikou je možné stanoviť prítomnosť zmeny v DNA, ale nevieme určiť presný typ zmeny (polymorfizmus alebo mutácia). Za účelom stanovenia senzitivity, špecificity a pozitívnej prediktívnej hodnoty DHPLC sa všetky vzorky re-analyzovali priamym obojsmerným sekvenovaním.

Výsledky: DHPLC pre-skríningovou metódou sa analyzovalo spolu 94 probandov; 6 na gén GCK, 23 na HNF1a a 65 na HNF4a (spolu 880 vzoriek exónov a promótorov), pričom sa identifikovalo 152 pozitívnych vzoriek a 728 negatívnych vzoriek. Pôvodne sa sekvenačnou analýzou zo 152 DHPLC pozitívnych vzoriek detekovali štyri typy mutácií: dve v GCK (-71G>C, F419S) v dvoch vzorkách, jedna v HNF1a (R131Q) v jednom vzorke a jedna v HNF4a (-136A>G) v jednom vzorke. V 145 DHPLC pozitívnych vzorkách sa sekvenovaním identifikovali polymorfizmy. Následnou re-analýzou všetkých DHPLC negatívnych vzoriek sa zo 728 vzoriek sekvenačne potvrdilo 725 vzoriek a tri boli falošne negatívne, z toho jedna mutácia HNF4a (S419X) a dva polymorfizmy. Na základe týchto výsledkov sa stanovila špecificita pre DHPLC 99,6 % a senzitivita na 98,0 %. Pozitívna prediktívna hodnota testu určená z celkového záchytu polymorfizmov a mutácií je 98 %. Na druhej strane pozitívna prediktívna hodnota testu vzhľadom na záchyt kauzálnych mutácií je iba 2,6%, stanovená ako podiel počtu mutácií k celkovému počtu pozitívnych vzoriek určených DHPLC (4/152).

Záver: Pre-skríningová technika pomocou DHPLC je vzhľadom na vysokú senzitivitu a špecificitu veľmi citlivá metóda. Nízka pozitívna prediktívna hodnota testu, s ohľadom na záchyt kauzálních mutácií, odráža vysoký počet falošne pozitívnych výsledkov (súvisiaci s vysokým výskytom polymorfizmov v génoch HNF1a, GCK a HNF4a), ktoré treba analyzovať aj sekvenačne, čím sa predlžuje celkový čas a finančné náklady analýzy. DHPLC sa javí skôr metódou voľby pre analýzu jednej definovanej mutácie u veľkého počtu pacientov.

Podporené projektmi „Transendogen“ (ITMS kód projektu 26240220051), VEGA 2/0151/11 a Slovenskou diabetologickou spoločnosťou.

DNA diagnostika bakterií způsobujících močové infekce

Vargová L., Lochman J., Šerý O.

Laboratoř DNA diagnostiky, Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno

e-mail: lydiavargova@mail.muni.cz

Diagnostika a léčba močových infekcí činí nemalé potíže. Močové infekce způsobené Mycoplasma genitalium/hominis, Ureaplasma urealyticum/parvum a Chlamydia trachomatis způsobují tzv. nespecifické uretritidy. Neisseria gonorrhoea je původcem kapavky. Všechny uvedené bakterie se přenášejí sexuálně. Největší prevalence pohlavně přenosných močových infekcí je u sexuálně aktivních mužů i žen ve věku od 15 do 25 let. Mezi základní příznaky patří časté nucení k močení, vaginální výtoky nebo výtoky z močové trubice, bolest a dysurie. Infekce mají také často asymptomatický průběh a nejsou-li řádně vyléčeny, mohou vést k závažným poruchám plodnosti. Možnými diagnostickými metodami jsou sérologická nebo kultivační vyšetření, jejichž senzitivita a spolehlivost nebývají dostačující. Nejpřesnější metodou stanovení je DNA diagnostika, z níž se v poslední době používá především RealTime PCR umožňuje detekovat minimálně o 15 % více pozitivních případů než kultivační vyšetření. RealTime PCR detekci lze provádět z klinického materiálu, jako je moč, vaginální a cervikální stěry, sperma nebo stěry z močové trubice.

V naší studii bylo analyzováno 96 vzorků moči od pohlavně aktivních vysokoškolských studentů. Bakteriální DNA byla izolována dle upraveného protokolu za pomocí komerčně dostupného izolačního kitu UltraClean BloodSpin DNA Isolation Kit (MoBio, USA). Pro RealTime PCR detekci byly využity diagnostické soupravy EliGene^® Mycoplasma hom/gen LC, EliGene^® Ureaplasma LC, EliGene^® Chlamydia trachomatis LC a EliGene^® Neisseria LC (ELISABETH PHARMACON, ČR).

Na souboru vzorků byla prokázána přítomnost bakteriálního původce Chlamydia trachomatis v jednom případě. DNA Ureaplasma urealyticum/parvum byla nalezena v devííti analyzovaných močích a Neisseria gonorrhoea byla detekována u jednoho vzorku. Mycoplasma genitalium/hominis nebyla v testovaném souboru vzorků nalezena. Na základě porovnání dat z dotazníku lze potvrdit bezpříznakový průběh infekce u některých účastníků pozitivních na přítomnost Chlamyda trachomatis nebo Ureaplasma urealyticum/parvum.

Práce byla podporována grantovým projektem TIP MPO č. FR-TI1/478.

Large-scale deletions on 22q13.33 and 12q24.33 detected in patients with mitochondrial disorders

Vondráčková A.¹, Veselá K.¹, Tesařová M.¹, Beránková K.¹, Stránecký V.¹, Honzík T.², Hansíková H.², Zeman J.¹

¹KDDL LF UK a VFN, Praha

²1. LF UK a VFN, Praha

e-mail: avond@lf1.cuni.cz

Mitochondrial disorders represent a group of clinically and genetically heterogeneous diseases whose molecular-genetic diagnosis is challenging. The standard diagnostic approach is direct DNA sequencing of candidate genes whose list is steadily growing. Nevertheless, this technique does not enable to detect large heterozygous deletions. To avoid this, gene-specific custom oligonucleotide array-based CGH are used. Alternatively, SNP arrays with high marker density may be utilized. The aim of this study is to analyze large-scale deletions in group of 15 patients with mitochondrial disorder of unknown etiology.

Methods: Genome-Wide Human SNP 6.0 array (Affy-metrix) was used for genotyping of DNA isolated from leucocytes of patients. Detected deletions were confirmed by TaqMan Copy Numer Assays (Applied Biosystems).

Results: In 20% of patients, large deletions as a cause of the mitochondrial disease were found. In 2 of them, 175-kb, 87-kb resp. heterozygous deletions on 22q13.33 affecting SCO2 and TYMP genes were detected. Missense point mutations in TYMP, SCO2 genes resp. were identified by direct sequencing on the other allele. Patient 1 with MNGIE phenotype inherited c.261G>T in TYMP from father and 175-kb deletion from mother. A novel mutation c.667G>A in SCO2 resulting in substitution p.Asp223Asn was found on maternal allele of patient 2 in combination with 87-kb deletion inherited from father. Interestingly, 175-kb deletion on 22q13.33 partially overlaps with two described copy-number variations (CNV; variation_5192 and variation_4139). According to Database of Genomic Variants (Iafrate et al, 2004), these two CNVs spanning TYMP and SCO2 genes occurs with 7% frequency in control samples. In patient 3, homozygous 5-kb deletion on 12q24.33 affecting exon 4 of PUS1 gene was revealed. Additionally, clinical phenotype of patient 2 and patient 3 did not fully correspond with symptoms usually observed in other SCO2 and PUS1 patients respectively.

Conclusions: Genome-Wide Human SNP 6.0 Array allowing detection of deletions larger than 700 bp was successfully used to determine genetic diagnosis in 3 out of 15 patients. Copy-number variations occur frequently in human genome based on the results of whole-genome analyses and they may overlap with many genes associated with clinical phenotypes including mitochondrial disorders.

Supported by research project IGA NT/11186, IGA NT-13114-4/2012, SVV 264 502, GA UK 28410.

Vyšetření HLA ve vztahu k celiakii dle nových doporučení ESPGHAN

Vraná M.¹, Dobrovolná M.¹, Szitányi P.²

¹Odd. HLA analýzy, Národní referenční laboratoř pro DNA diagnostiku ÚHKT, Praha

²Klinika dětského a dorostového lékařství 1. LF UK a VFN, Praha

e-mail: milena.vrana@uhkt.cz

Celiakie je hereditární autoimunitní onemocnění dětí a dospělých způsobené nesnášenlivostí lepku (glutenu). Jedinou současnou kauzální terapii představuje bezlepková dieta. Prevalence onemocnění ve vyspělých zemích je 0,5–2 %, v České republice se odhaduje 40 000–50 000 nemocných. Asi polovina onemocnění je diagnostikována v dětském a dorostovém věku. V lednu 2012 vydala Evropská společnost pro dětskou gastroenterologii, hepatologii a výživu (ESPGHAN) nová doporučení pro diagnostiku celiakie (1). Jedním ze základních diagnostických kritérií je i stanovení HLA genotypu.

Dle těchto kritérií jsou vázané s celiakií tyto HLA genotypy: HLA-DRB1*03/ DQA1*05:01/ DQB1*02:01 (cis heterodimer), HLA-DRB1*11/ DQA1*05:05/DQB1*03:01 současně s HLA-DRB1*07/ DQA1*02:01/ DQB1*02:02 (trans heterodimer) a méně zastoupený genotyp HLA-DQA1*03:01/ DQB1*03:02.

Při nepřítomnosti těchto genotypů u vyšetřované osoby s nejasnou etiologií obtíží je diagnóza celiakie nepravděpodobná. Vzhledem k vysoké populační frekvenci těchto genotypů u zdravé populace, ale nelze v žádném případě jejich přítomnost interpretovat jako potvrzení diagnózy CD bez klinických projevů a dalších vyšetření: serologických parametrů (EMA, aTTG) a enterobiopsie.

Od roku 2009 organizuje Národní referenční laboratoř pro DNA diagnostiku kontroly kvality „Stanovení HLA znaků asociovaných s chorobami“. Jedním z vyšetření je i stanovení HLA alel asociovaných s diagnózou celiakie. Na základě zasílaných výsledků lze shrnout tyto poznatky: Metody používané v genetických laboratořích v České republice pro stanovení HLA ve vztahu k celiakii detekují různé spektrum HLA alel či alelických skupin. Většinou jsou laboratořemi využívány komerční kity s certifikací CE-IVD. Informace uvedené v příbalových letácích těchto kitů nejsou vždy zcela pochopitelné, což může vést i k chybné interpretaci získaných výsledků. Také nomenklaturní nekonzistence (sérologické značení vs. genotypizační, neplatné názvosloví alel), která je bohužel i v doporučení ESPGHAN, zvyšuje zmatek v uvádění výsledků jednotlivých laboratoří. Ne vždy se také zúčastněným laboratořím podařilo vyjádřit jasně vztah k účelu vyšetření (nejasná typizace, vztah k celiakii), některé interpretace nerespektují nová ESPGHAN kritéria. Z těchto důvodů mají vydávané výsledky sníženou vypovídací hodnotu pro klinické zadavatele, v některých případech došlo i k chybám v interpretaci. Striktní dodržení aktuální platné nomenklatury HLA dle mezinárodních standardů IMGT a kritérií ESPGHAN pro testování HLA ve vztahu k celiakii je základem pro racionální rutinní využití HLA vyšetření pro stanovení diagnózy celiakie. Klinický lékař očekává jasné vyjádření genetika o přítomnosti asociovaných alel a v případě klinických projevů, současně s nejméně 10násobně zvýšenými hodnotami aTTG (v závislosti na laboratoři) může stanovit diagnózu celiakie a indikovat celoživotní bezlepkovou dietu bez provedení enterobiopsie.

Literatura

Husby et al. European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition

Guidelines for the Diagnosis of Coeliac Disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition 2012; 54(1): 136–160.

dokončení v příštím čísle