César Milstein (1927–2002)

V roce 1984 získali Nobelovu cenu za fyziologii nebo lékařství tři imunologové – Dán Niels Kaj Jerne, Němec Georges Jean Franz Köhler a Brit César Milstein (1). Prvního z nich jsme představili v ČLČ 2/2018, druhého v ČLČ 3/2018 a posledně jmenovaného připomene následující text.

Nedlouho před 1. světovou válkou přicestoval z dnešní Ukrajiny v tehdejším carském Rusku do argentinského přístavního města Bahía Blanca 14letý Lazar Miľštejn s tetou a strýcem pokročilého věku (2). Usadili se v nedaleké židovské osadě a chlapec se živil jako nádeník na farmě, železniční dělník i leštič nábytku (3). Brzy ovládl španělštinu, podepisoval se Lázaro Milstein a četl politickou literaturu (2). Tehdy se sblížil s mladými anarchisty a vstoupil do jejich Židovského racionalistického sdružení (3). Potkal také učitelku (4) Máximu z rodiny židovských přistěhovalců od Brestu Litevského (5) a oženil se s ní.

Jejich synové Oscar Héctor (*1920), César (*1927) a Ernesto (*1931) (6) byli zdárně vedeni k touze po vzdělání (7). Pouze César, narozený v Bahía Blanca 8. října 1927 (4) v domě nedaleko školy řízené Máximou Milsteinovou (7), si věčně jen hrál s dětmi na ulici a Knihou džunglí ani Tarzanem se zlákat nedal. Když se však začal zajímat o práci bratrance na vývoji antisér proti hadímu jedu a matka mu pak přinesla Lovce mikrobů, uznal chlapec vědce za pravé dobrodruhy a život tak vzrušující si umínil prožít sám. S tím zamířil na univerzitu v Buenos Aires (2).

BUENOS AIRES (1944–1958): PERÓN, EL PULPO A CELIA 

Roku 1944 se zapsal na Fakultu přírodních věd (4). Tam pak celou prezidentskou éru Juana Peróna prožil s hlavou plnou problémů argentinské společnosti (2). César, mezi přáteli anarchisty přezdívaný El Pulpo (Chobotnice), patřil k Perónovým odpůrcům (3) a práce ve studentském hnutí se mu stávala smyslem života (2). Pak ale vážný úraz skokem do mělké vody při fakultním pikniku jeho studium nadlouho přerušil. Po návratu na univerzitu objevil u laboratorního stolu po svém boku Celii Prilleltenskou a bylo to osudové setkání. Spolu roku 1952 (2) dostudovali k licenciátu chemie (4).

César pak pomýšlel na doktorát. V Buenos Aires proto navštívil prof. Luise Leloira (1906–1987), proslulého enzymologa (výzkum biosyntézy polysacharidů mu vynese Nobelovu cenu za chemii 1970). Leloir však neměl volné místo, poslal tedy Milsteina do ústavu biologické chemie tamní lékařské fakulty k žákovi laureáta Nobelovy ceny 1947 Bernarda A. Houssaye prof. Andrési Stoppanimu (1915–2003). Ten antiperónistovi a předsedovi Studentské unie Césarovi vysvětlil, že politicky nespolehlivým univerzitním ústavům hrozí ztráta podpory, a doporučil mu vzhledem k současným poměrům disertaci odložit (2). Milstein poslechl a roku 1953 se oženil. Na svatební cestě prodloužené na rok pak César a Celia projeli autostopem Evropu a několik měsíců pracovali v izraelských kibucech (4).

BUENOS AIRES (1954–1958): KINETIKA ENZYMU

Do Argentiny se vrátili v roce 1954 za poměrů natolik příznivějších, že Milstein mohl v Ústavu biologické chemie lékařské fakulty v Buenos Aires pod vedením prof. Stoppaniho zahájit kinetickou studii enzymu aldehyddehydrogenázy, byť bez finanční podpory (jej i Celii živil částečný úvazek v laboratoři klinické biochemie) (4) a ve skromných podmínkách (nejbližší spektrofotometr k měření aktivity enzymu byl o tři bloky dál v kardiologickém ústavu a César tam denně musel přenášet reagencia a enzymové preparáty) (2). Práci (El papel de los tioles en la oxidación enzimática del acetaldehido. University of Buenos Aires, 1957) však dokončil, vytěžil z ní doktorát chemie (4), několik článků a cenu Argentinské chemické společnosti za nejlepší disertaci roku (2).

CAMBRIDGE (1958–1960): AKTIVACE ENZYMU KOVY A SEKVENCE AMINOKYSELIN

Čerstvý Ph.D. přijal nabídku místa přednosty Oddělení molekulární biologie Národního ústavu mikrobiologie v Buenos Aires, ale po zisku stipendia Britské rady pro lékařský výzkum na doporučení Stoppaniho (4) nastoupil nejprve dvouletou studijní dovolenou, odplul s Celií do Anglie (2) a v Biochemickém ústavu Cambridgeské univerzity (4) se přihlásil u přednosty enzymové jednotky, odborníka na purifikaci a kinetiku enzymů Malcolma Dixona (1899–1985), u něhož Stoppani pracoval před válkou (2).

Nehodou při ústavní oslavě Nobelovy ceny za chemii 1958 pro spolupracovníka Fredericka Sangera (1918–2013) za objasnění aminokyselinové sekvence inzulinu César přišel o průběžné výsledky své studie mechanismu aktivace fosfoglukomutázy těžkými kovy, k dokončení kinetických experimentů s krystalickým enzymem však dospěl včas (2) a publikoval tři články (mj. On the mechanism of activation of phosphoglucomutase by metal ions. Biochem J 1961; 79: 574–584), kde aktivaci enzymu přisoudil nikoliv těžkým kovům samým, nýbrž jejich substituci hořčíkem (2). 

Kinetické experimenty však Milstein brzy opustil, aby se věnoval studiu sekvence aminokyselin fosfoglukomutázy. Tvrzení jiných badatelů, že aktivním místem se tento enzym podobá trypsinu, vyvrátil se Sangerem, když technikou značkování enzymu radiofosforem (5mCi) určil v aktivním místě fosfoglukomutázy sekvenci aminokyselin Thr-Ala-Ser-His-Asp (The amino acid sequence around the serine phosphate in phosphoglucomutase. Biochim Biophys Acta 1960; 42: 173–174, s F. Sangerem. – An amino acid sequence in the active centre of phosphoglucomutase. Biochem J 1961; 79, 456–469, s F. Sangerem). Vysloužil si druhý doktorát (4) i Sangerovu nabídku dalšího roku v Cambridgi, tu ale přijmout nemohl – svou argentinskou dovolenou už vyčerpal (2). 

BUENOS AIRES (1961–1963): SEKVENCE AMINOKYSELIN A PUČ

Roku 1961 se Milstein ujal vedení Oddělení molekulární biologie v Buenos Aires (2). Začal tam zkoumat mechanismus účinku enzymů fosfoglyceromutázy a bakteriální alkalické fosfatázy (4). S Noé Zwaigem určil sekvenci aminokyselin kolem aktivního místa alkalické fosfatázy (The amino acid sequence around the reactive serine residue in alkaline phosphatase of Serratia marcescens. Biochem J 1964; 92: 421–422, s N. Zwaigem), čímž předstihl newyorskou skupinu laureáta Nobelovy ceny 1953 za objev koenzymu A Fritze Lipmanna (1899–1986).

Ten pak za ním přijel do Buenos Aires zrovna v den vzplanutí vojenského puče. Toho dne byl ředitel Národního ústavu mikrobiologie odstraněn a Milstein, ač podporován Leloirem, po vyhození čtyř jeho pracovníků (2) rezignoval sám (4). Když o tom zpravil Sangera (2), od roku 1962 přednostu cambridgeského Oddělení chemie bílkovin Laboratoře molekulární biologie Rady pro lékařský výzkum (4), ten mu ihned nabídl smlouvu na 3 roky (2). V roce 1963 (8) se tedy Milstein s Celií vydali do Cambridge podruhé (4), tentokrát jako političtí emigranti a navždy.

CAMBRIDGE (1963–1974): ROZMANITOST PROTILÁTEK

Milstein v Cambridgi pokračoval ve výzkumu enzymů, brzy však studií disulfidových můstků v lehkých řetězcích imunoglobulinů (Disulphide bridges and dimers of Bence-Jones protein. J Mol Biol 1964; 9: 836–838) s technickou pomocí laboranta a později i častého spoluautora Johna M. Jarvise (2) vykročil na pole imunologie (4), nabízející i po nedávném objevu čtyřřetězcové struktury molekul imunoglobulinů Porterem a Edelmanem (1962) spoustu dosud nezodpovězených otázek molekulární podstaty jejich rozmanitosti.

Milsteina zlákala představa srovnávání primárních sekvencí různých protilátek a neprodleně ji začal uskutečňovat (2). Při srovnávacích studiích sekvencí imunoglobulinových řetězců (počínaje článkem Comparative peptide sequences of kappa- and lambda-chains of human immunoglobulins. J Mol Biol 1966; 21: 203–205) odhalil aminoterminální lokalizaci strukturální podstaty rozmanitosti v polypeptidových řetězcích protilátek. Při hledání původu této rozmanitosti s Jihoafričanem Sydney Brennerem (* 1927, laureát Nobelovy ceny 2002) v dopise časopisu Nature vzkřísil a rozvinul teorii somatické hypermutace (Origin of antibody variation. Nature 1966; 211: 242–243, se S. Brennerem). Spoluautorkou řady publikací z let 1968–1987 byla (počínajíc článkem A tryptic peptide containing a unique serine phosphate residue in rabbit phosphoglucomutase. Biochem J 1968; 109: 93–99) Celia Prilleltensky-Milstein – Césarova žena pracující v jiné cambridgeské laboratoři.

V dusné atmosféře července 1968, měsíc před vpádem vojsk Varšavské smlouvy, vystoupil Milstein v Praze na 5. konferenci Federace evropských biochemických společností (FEBS) s přednáškou o svých strukturních studiích heterogenity imunoglobulinů (9). S Celií pak trávil dovolenou sjížděním Lužnice na kánoi (10).

CAMBRIDGE (1974–1976): KÖHLER A MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY

V červnu 1974 u něho nastoupil basilejský postdok Georges Köhler s myšlenkou tvorby buněčné linie produkující jedinou čistou protilátku: injikovat antigen myši, z její sleziny extrahovat protilátkotvorné lymfocyty s několikadenní životností a fúzovat je s nekonečně se dělícími myelomovými buňkami vypěstovanými in vitro. Trvalé pokračování tvorby téže čisté protilátky proti injikovanému antigenu ve zkumavce by pak nádorová polovina hybridní buňky – hybridního myelomu – zajistila v dceřiných buňkách. Milstein ho vyslechl a přes nejisté vyhlídky souhlasil, že má smysl to zkusit.

Köhler se tedy pustil do práce a koncem prosince 1974 ji dovedl do úspěšného konce. Milstein otcem myšlenky nebyl, ale inspirativním dohledem, porozuměním a podporou přispěl k vynálezu metody tvorby čistých „monoklonálních“ protilátek proti kterémukoliv antigenu v neomezeném množství po neomezenou dobu, pro svou specificitu použitelných v diagnostice či cílení léčebných prostředků na konkrétní tkáně těla.

Metodu vývoje nepřetržitých buněčných linií tkáňové kultury pocházejících z fúze myšího myelomu s buňkami myší sleziny imunizovaného dárce a tvořících protilátky proti ovčím erytrocytům popsali Köhler a Milstein v článku zkráceném na přání redakce na formát dopisu (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 495–497, s Köhlerem).

Oba si uvědomovali hodnotu vynálezu, ale tuto první praktickou metodu masové výroby monoklonálních protilátek si patentovat nedali (2).

Milstein byl v roce 1975 zvolen členem britské Královské společnosti (8). Köhler se v následujícím roce vrátil do Basileje (1976).

CAMBRIDGE (1976–1984): PRŮKAZ UŽITEČNOSTI MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK

Milstein pak při selekci protilátek proti hlavnímu histokompatibilnímu komplexu potkana prokázal užitečnost monoklonálních protilátek pro identifikaci i purifikaci konkrétních antigenů (Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature 1977; 266: 550–552, spoluaut. G. Galfrè a kol.).

V roce 1980, kdy byl jmenován přednostou cambridgeského Oddělení chemie bílkovin a nukleových kyselin (4), obdržel Cenu Louisy Grossové Horwitzové, roku 1981 Cenu Alfreda P. Sloana jr. (4); Köhler byl pokaždé opomenut. Až cenu Alberta Laskera dostali v roce 1984 Milstein i Köhler spolu s Američanem Michaelem Potterem, jejich badatelským předchůdcem (4).

STOCKHOLM (1984): NOBELOVA CENA

Téhož roku 1984 byl Milstein spolu s Köhlerem a bývalým ředitelem Basilejského ústavu pro imunologii Nielsem Kajem Jernem poctěn třetinovým dílem Nobelovy ceny za fyziologii nebo lékařství „za teorie týkající se specifičnosti ve vývoji a kontrole imunitní soustavy a za objev principu tvorby monoklonálních protilátek“ (1). 8. prosince 1984 měl ve Stockholmu nobelovskou přednášku (From the structure of antibodies to the diversification of the immune response. Nobel lecture, 8 December 1984. Biosci Rep 1985; 5: 275–297, EMBO J 1985; 4: 1083–1092).

10. prosince 1984 pak trojici laureátů představil švédskému králi profesor imunologie Karolinského ústavu ve Stockholmu Hans Wigzell na téže slavnosti, kde Nobelovu cenu za literaturu pro nepřítomného českého básníka Jaroslava Seiferta převzala jeho dcera Jana. V prezentační adrese uvedl Wigzell Jerneho jako velkého teoretika imunologie a připomněl zejména jeho teorii tvorby protilátek přirozeným výběrem, teorii původu rozmanitosti protilátek a teorii imunitní sítě. Následně popsal přínos Köhlera a Milsteina v objevu monoklonálních protilátek, jenž čistou protilátku učinil široce dostupnou pro experimentální i klinické použití (1).

CAMBRIDGE (1984–2002): LAUREÁT S KARDIOSTIMULÁTOREM

Vzpomínky na pobyt v Československu před sovětskou invazí oživil Milstein v rozhovoru poskytnutém M. Novakovi (9) v červenci 1991, kdy už trpěl poruchami srdečního rytmu a v Královské papworthské nemocnici dostal kardiostimulátor (2). Nadále si pak v harmonickém, byť bezdětném (4) manželství dopřával celoživotní potěšení nejen z návštěv operních a činoherních představení v Londýně a Cambridgi, ale i z plavby po okolí na motorovém člunu či plachetnici, a dokonce raftingu na divoké vodě v Chile v roce 1992 (2).

Po odstoupení z vedení pracoviště byl od r. 1995 úředně na odpočinku. S Johnem M. Jarvisem a se svou bývalou studentkou – teď už postdoktorandkou Cristinou Radaovou – však v laboratoři pracoval až do pátku před nedělí 24. března 2002 (8), kdy – pět dní (2) po odevzdání posledního společného článku (AID-GFP chimeric protein increases hypermutation of Ig genes with no evidence of nuclear localization. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 7003–7008, s C. Radaovou a J. M. Jarvisem) – zemřel v Cambridge na srdeční selhání.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Pavel Čech

Kabinet dějin lékařství 3. LF UK

Ruská 87, 100 00  Praha 10

e-mail: pavel.cech@lf3.cuni.cz