Detekce placentárně specifických mikroRNA v mateřské cirkulaci

Souhrn

Cíl studie:
Zaměřili jsme se na detekci mikroRNA v mateřské cirkulaci v průběhu fyziologického těhotenství. Do studie jsme zahrnuli mikroRNA (miR-135b a miR-517a), jejichž přítomnost byla již dříve popsána v mateřské cirkulaci, mikroRNA (miR-518b, miR-517a) se zvýšenou expresí v placentách pacientek v době klinické manifestace preeklampsie a dále všechny mikroRNA, které byly dle databáze miRNAMap placentárně specifické (vykazovaly významnou expresi v placentě a nulovou nebo minimální expresi v ostatních tkáních).

Typ studie:
Pilotní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, Gynekologicko-porodnická klinika, 3. lékařská fakulta Univerzity Karlovy, Praha.

Metodika:
Z 1 ml mateřské plazmy získané ve 12., 16. a 36. gestačním týdnu a 200 μl periferní krve zdravých žen bez známek těhotenství byla izolována RNA obohacená o frakci malých RNA (včetně mikroRNA). Následně byla příslušná mikroRNA přepsána do cDNA pomocí specifického stem-loop primeru a detekována pomocí PCR v reálném čase.

Výsledky:
Ze souboru testovaných mikroRNA byly vyloučeny mikroRNA, které nebyly detekovány v mateřské cirkulaci v průběhu těhotenství (miR-136, miR-519a) a rovněž mikroRNA, které byly detekovány v periferní krvi zdravých žen bez známek těhotenství (miR-34c, miR-224, miR-512-5p, miR-515-5p, miR-516-5p, miR-518f*, miR-519d, miR-519e).

Závěr:
Pro další sledování přítomnosti placentárně specifických mikroRNA v mateřské cirkulaci v průběhu gravidity a pro diferenciaci mezi fyziologickým a patologickým průběhem gravidity (preeklampsie, IUGR) ve stejném gestačním stáří bylo na základě těchto výsledků vybráno 6 mikroRNA (miR-517*, miR-518b, miR-520a*, miR-520h, miR-525, miR-526a).

Klíčová slova:
mikroRNA, těhotenství, placenta, plazma, PCR v reálném čase.

ÚVOD

MikroRNA (mikroRNA, miRNA) jsou krátké jednořetězcové molekuly, které patří do rodiny tzv. nekódujících ribonukleových kyselin, jejichž velikost se pohybuje v rozmezí 18 až 25 nukleotidů [13, 14]. Vznikají kaskádou dějů z primárního vlásenkového transkriptu (pri-miRNA) [5, 9, 16, 19, 24] a v cytoplazmě buněk se stávají součástí miRISC (microRNA-induced silencing comlex) komplexu [10], který se přes miRNA váže na 3’UTR (untranslated region) oblast cílové mRNA a ovlivňuje její další funkce v organismu [22]. Nedávné experimentální práce upozornily na významnou roli mikroRNA v posttranskripční regulaci exprese genů [7, 8, 11, 14]. Primárním úkolem mikroRNA v organismu je regulace genové exprese klíčových biologických dějů, nejčastěji inhibicí translace mRNA [8] s následným útlumem proteosyntézy, méně obvykle přímou degradací mRNA [10, 18, 20, 23]. Vliv mikroRNA byl prokázán v mnoha fyziologických a patologických procesech (např. buněčný vývoj, diferenciace, proliferace, apoptóza, mezibuněčná komunikace, karcinogeneze, rozvoj kardiovaskulárních onemocnění atd.) [2, 3, 12, 21].

V lidském organismu bylo doposud identifikováno přibližně 750 různých mikroRNA, přičemž tento počet není pravděpodobně konečný [13, 15, 17]. Každý typ mikroRNA reguluje genovou expresi desítek až stovek genů, přičemž se předpokládá, že mikroRNA se podílejí na mechanismu kontroly genové exprese zhruba jednou třetinou. Vzhledem k široké paletě dějů, které mikroRNA v organismu ovlivňují, je věnována velká pozornost výzkumu identifikace charakteristických profilů mikroRNA u jednotlivých onemocnění a jejich potenciální využití pro diagnosticko-prognostické a terapeutické účely. Za objev mechanismu RNA interference (indukce degradace mRNA transkriptů pomocí dvoušroubovicové krátké RNA molekuly) u C. elegans byla v roce 2006 udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu (Andrew Z. Fire; Craig C. Mello) [1, 6, 22].

Nedávno publikované pilotní studie [4] popsaly přítomnost některých mikroRNA v periferní krvi těhotných žen (miR-141, miR-149, miR-299-5p, miR-135b a miR-517a), které byly po porodu v mateřské cirkulaci nedetekovatelné.

V naší pilotní studii jsme se zaměřili na detekci mikroRNA v mateřské cirkulaci v průběhu fyziologického těhotenství. Do studie jsme zahrnuli některé mikroRNA (miR-135b a miR-517a), jejichž přítomnost byla již dříve popsána v mateřské cirkulaci [4], mikroRNA (miR-518b, miR-517a) se zvýšenou expresí v placentách pacientek v době klinické manifestace preeklampsie [25] a dále všechny mikroRNA, které podle databáze miRNAMap (http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw) byly placentárně specifické (vykazovaly významnou expresi v placentě a nulovou nebo minimální expresi v ostatních tkáních) (tab. 1).

SOUBOR A METODIKA

Soubor pacientek

Celkem bylo testováno 23 těhotných žen v 12., 16. a 36. gestačním týdnu s fyziologickým průběhem gravidity a 5 zdravých žen bez známek těhotenství. Všechny pacientky poskytly informovaný souhlas s odběrem periferní krve pro toto vyšetření.

Metodika

Izolace plazmy z periferní krve matky

Plazma byla připravena z 5 ml nesrážlivé periferní krve (EDTA) nejpozději 24 hodin po odběru centrifugací při 1200 g po dobu 10 minut. Poté byla plazma stočena znovu a skladována při –80 °C až do dalšího zpracování.

Abychom minimalizovali riziko kontaminace vzorků, prováděli jsme veškeré zpracování biologického materiálu v laminárním boxu třídy II. a pro pipetaci jsme používali aerosol resistentní špičky.

Izolace mikroRNA z mateřské plazmy a přepis do cDNA

1 ml mateřské plazmy byl inkubován s 3 ml Trizol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Po 10minutové inkubaci při pokojové teplotě s 0.8 ml chloroformu následovala 15minutová centrifugace při 12 000 g a 4 °C. Vodná fáze byla přenesena do nové zkumavky a RNA byla vysrážena po přidání 1/3 násobku objemu 100 % ethanolu. Následně byla získána RNA obohacená o frakci malých RNA pomocí mirVana^TM miRNA Isolation Kitu (Ambion, Austin, Texas, USA) dle originálního protokolu výrobce. RNA byla eluována 100 μl elučního pufru. Reziduální DNA byla odstraněna pomocí 5 μl DNAázy (Dnase I, Fermentas International, Ontario, Canada).

16,7 μl eluátu bylo použito pro přepis RNA do cDNA s využitím specifického komerčního „stem-loop“ primeru pro konkrétní mikroRNA a TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kitu (Applied Biosystem, Branchburg, New Jersey, USA) za následujících podmínek 30 minut 16 °C, 30 minut 42 °C, 5 minut 85 °C a 15 minut 4 °C na 7500 real-time PCR system (Applied Biosystem, Branchburg, New Jersey, USA). Koncentrace a čistota celkové RNA a RNA obohacené o frakci malých RNA byla stanovena na spektrofotometru NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).

Detekce mikroRNA v mateřské plazmě pomocí PCR v reálném čase

Detekce byla provedena na 7500 real-time PCR system (Applied Biosystem, Branchburg, New Jersey, USA) s využitím TaqMan Universal PCR Master Mixu a komerčních setů pro jednotlivé mikroRNA obsahujících specifické primery a 5’- FAM, 3’- MGB značenou sondu (Applied Biosystem, Branchburg, New Jersey, USA) v reakčním objemu 35 μl s 15 μl cDNA. Podmínky PCR reakce byly nastaveny podle manuálu výrobce [10-min preinkubace při 95 °C nutná pro aktivaci AmpliTaq Gold DNA polymerázy; dále 40 cyklů při 95 °C 15 s (denaturace DNA) a 60 °C 1 min (anelace a syntéza DNA)]. Každý vzorek byl analyzován v 8jamkových stripech ve 3 replikátech. Pozitivní výsledek byl hodnocen jako detekce fluorescenčního signálu v jamce před 40. cyklem (Ct < 40). Jako pozitivní kontrola byla využita frakce RNA obohacená o mikroRNA izolovaná z fetální části placenty. Každá analýza zahrnovala negativní kontroly (bez přítomnosti cDNA templátu a/nebo reverzní transkriptázy).

VÝSLEDKY

Intra- a inter-assay variabilita pro jednotlivé mikroRNA systémy

Koeficient variability pro jednotlivé mikroRNA systémy v rámci jedné analýzy se pohyboval v rozmezí 0 % – 1,6 % (intra-assay variabilita). Koeficient variability pro jednotlivé mikroRNA systémy v rámci různých analýz provedených v různých dnech dosahoval hodnot 0,4 % – 6,8 % (inter-assay variabilita).

Detekce jednotlivých mikroRNA v mateřské cirkulaci u těhotenství s fyziologickým průběhem a kontrolní skupiny (zdravé ženy bez známek těhotenství)

Metodika izolace a detekce mikroRNA v placentě a mateřské plazmě byla zavedena a optimalizována s využitím všudypřítomné tkáňově nespecifické miR-16, kterou jsme dále používali jako kontrolu pro ověření přítomnosti mikroRNA v RNA obohacené o frakci malých RNA.

Všechny testované mikroRNA byly spolehlivě detekovány ve fetální části placenty v rozmezí 16,2 – 35,2 cyklu. MikroRNA (miR-136 a miR-519a) s pozdější amplifikací v placentární tkáni (Ct 31,0 a 35,2) nebyly detekovatelné v mateřské cirkulaci v průběhu gravidity.

Některé mikroRNA (miR-34c, miR-224, miR-512-5p, miR-515-5p, miR-516-5p, miR-518f^*, miR-519d a miR-519e), které vykazovaly podle databáze miRNAMap významnou expresi v placentě a nulovou nebo minimální expresi v ostatních tkáních, byly detekovány i v periferní krvi zdravých žen bez známek těhotenství. Tyto mikroRNA jsme se rozhodli dále netestovat, přestože mateřská plazma vykazovala vyšší koncentrace některých mikroRNA (miR-512-5p, miR-515-5p, miR-516-5p a miR-519d) v plazmách těhotných žen (zejména ve 3. trimestru gravidity) než v periferní krvi zdravých žen bez známek těhotenství.

Pouze 6 mikroRNA (miR-517^*, miR-518b, miR-520a^*, miR-520h, miR-525 a miR-526a) nebylo detekováno v periferní krvi zdravých žen bez známek těhotenství a současně byly spolehlivě detekovány v plazmách těhotných žen (pozitivní signál amplifikace ve většině replikátů v dřívějších amplifikačních cyklech Ct) v průběhu těhotenství.

Z hodnot amplifikačních cyklů je zřejmé, že množství některých z těchto mikroRNA (miR-517^*, miR-518b, miR-520a^*, miR-520h a miR-525) se kontinuálně zvyšuje v mateřské cirkulaci s postupujícím těhotenstvím, neboť nejvyšší koncentrace byly nalezeny právě v 36. týdnu těhotenství (obr. 1). Mir-135b byla spolehlivě detekovatelná v mateřské cirkulaci pouze ve 3. trimestru gravidity. Výsledky analýzy jsou shrnuty v tabulce 2.

DISKUSE

Metodika byla optimalizována tak, aby bylo možné vyšetřit z 1 ml mateřské plazmy alespoň 6 různých mikroRNA. Pouze ty mikroRNA (miR-517^*, miR-518b, miR-520a^*, miR-520h, miR-525 a miR-526a), které nebyly detekovatelné v periferní krvi zdravých žen bez známek těhotenství a současně byly spolehlivě detekovány v plazmách těhotných žen, byly vybrány pro další sledování kvantitativních změn v průběhu gravidity a jako potenciální markery pro diferenciaci mezi fyziologickým a patologickým průběhem gravidity souvisejícím s placentární insuficiencí (preeklampsie a/nebo intrauterinní růstová retardace).

Vycházíme z předpokladu, že těhotenské komplikace související s placentární insuficiencí (preeklampsie a intrauterinní růstová retardace - IUGR) lze charakterizovat unikátním profilem up-regulovaných a down-regulovaných placentárně specifických mikroRNA, které lze detekovat v mateřské cirkulaci jako součást apoptotických tělísek trofoblastu. Předpokládáme, že přítomnost a koncentrace jednotlivých placentárně specifických mikroRNA v mateřské cirkulaci se mohou významně lišit mezi těhotenstvím s fyziologickým a patologickým průběhem ve stejném gestačním stáří. Předpokládáme, že by bylo v budoucnu možné sledovat profil a koncentrace placentárně specifických mikroRNA v mateřské cirkulaci u těhotných žen s rizikem pozdějšího rozvoje závažné preeklampsie a IUGR.

Tato práce vznikla za podpory výzkumného záměru MŠMT MSM 0021620806 a projektu specifického vysokoškolského výzkumu grantové agentury UK 260707/SVV/2010.

Doc. RNDr. Ilona Hromadníková, Ph.D.
Oddělení molekulární biologie a patologie buňky
3. lékařská fakulta Univerzity Karlovy
Ruská 87
100 00 Praha 10
e-mail: ilona.hromadnikova@lf3.cuni.cz