Vliv oxidačního stresu na mužskou plodnost

Súhrn

Reaktivní formy kyslíku a dusíku (RONS) jsou nezbytné pro fyziologickou funkci spermií. Jejich koncentrace ale musí být udržována na úrovni, při které nedochází k poškození buněk. Po překročení této hranice působí ve formě oxidativního stresu patologicky na mnoho biologických struktur. Klíčovou roli v udržení této rovnováhy hrají antioxidanty. U mužů se oxidativní stres řadí mezi důležité faktory způsobující problémy s jejich plodností. Přehledový článek se komplexně zabývá vlivem RONS a antioxidantů na mužskou plodnost a nastíňuje možnosti léčby i dalšího výzkumu v této aktuální problematice asistované reprodukce.

Klíčová slova:
reaktivní formy kyslíku a dusíku, antioxidanty, spermie, mužská neplodnost, kyselina askorbová.

REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU A DUSÍKU

Reaktivní formy kyslíku a dusíku (RONS) jsou látky, které mají značný fyziologický i patologický význam. Reagují s různými biologickými strukturami – mastnými kyselinami a lipidy, aminokyselinami a proteiny, nukleovými kyselinami i s řadou nízkomolekulárních metabolitů, koenzymů a jiných součástí živé hmoty [34]. Mezi RONS patří i volné radikály, tedy vysoce reaktivní sloučeniny, jejichž alespoň jeden orbital obsahuje jediný nepárový elektron. Vyznačují se tendencí vyvolávat řetězové reakce, nízkou aktivační energií, krátkým poločasem života a malou velikostí, čímž je usnadněn jejich průchod do buňky přes buněčnou membránu. Jedním z nejreaktivnějších volných radikálů je hydroxylový radikál, který může iniciovat peroxidaci lipidů vytržením vodíku z nenasycené mastné kyseliny. Dále sem patří například superoxidový anion, peroxylový radikál či oxid dusnatý.

Zdroje RONS mohou být vnějšího i vnitřního původu. Vnitřní zdroje zahrnují dýchací řetězec v mitochondriích, metabolismus cytochromu P450, peroxisomy a buňky imunitního systému. Mezi vnější zdroje patří xenobiotika, látky přítomné v životním prostředí a různé druhy záření [27]. V seminální plazmě mužů jsou nejdůležitějšími zdroji RONS leukocyty a spermie [30]. Předpokládá se, že oxidativní stres vyvolaný RONS zapříčiní 30–80 % případů mužské neplodnosti [3, 23].

LEUKOCYTY A SPERMIE JAKO VÝZNAMNÝ ZDROJ REAKTIVNÍCH SLOUČENIN KYSLÍKU A DUSÍKU

Peroxidáza-pozitivní leukocyty představují hlavní zdroj RONS v seminální plazmě mužů. Řadí se sem polymorfonukleáry, které tvoří 50–60 % leukocytů obsažených v seminální plazmě, a makrofágy, které představují 20–30 % seminálních leukocytů. Aktivované leukocyty jsou schopné produkovat až stonásobně větší množství RONS než neaktivované leukocyty. K aktivaci leukocytů dochází během infekce či zánětu [30].

Leukocyty obsažené v seminální plazmě pocházejí většinou ze semenných váčků a prostaty, ale mohou být přítomné i v nadvarleti. Jestliže jsou zdrojem leukocytů semenné váčky či prostata, setkávají se leukocyty se spermiemi až během ejakulace, kdy jsou spermie chráněny antioxidanty seminální plazmy. V případě, že leukocyty pocházejí z nadvarlete, působí na spermie mnohem delší dobu a riziko poškození spermií RONS může být mnohem větší [31].

Spermie produkují RONS na úrovni své cytoplazmatické membrány, a především mitochondrií [15, 26, 30]. Nejvyšší hladiny RONS produkované spermiemi byly naměřeny u nezralých spermií s abnormální morfologií hlavičky a s retencí přebytečné cytoplazmy. Naopak nejnižší hladiny produkovaly nezralé zárodečné buňky a zralé spermie [13]. Nezralé spermie s abnormální morfologií mohou vyvolat poškození zralých spermií [15] a RONS produkované těmito spermiemi mohou při delším působení poškodit epitel semenotvorných kanálků, způsobit atrofii varlat a redukovat produkci spermií [13].

VNĚJŠÍ ZDROJE REAKTIVNÍCH SLOUČENIN KYSLÍKU A DUSÍKU

Na mužskou plodnost má vliv i mnoho vnějších faktorů. Mezi významné látky patří ftaláty, se kterými se můžeme setkat v různých plastových obalových materiálech u potravin a kosmetiky. Ftaláty ovlivňují spermatogenezi a představují hrozbu pro genetickou informaci spermií [2].

Testikulární oxidativní stres významně zvyšují těžké kovy a kouření cigaret. Časté kouření se také podílí na snížení antioxidantů v seminální plazmě a zhoršených parametrech spermiogramu mužů [16, 20, 36]. Zvýšené hladiny leukocytů a také RONS byly zjištěny u neplodných pacientů kuřáků. Existují pro to dvě možná vysvětlení. Metabolity vznikající při kouření mohou vyvolat zánětlivou reakci v pohlavním sytému muže, při které dojde k uvolnění prozánětlivých mediátorů (IL6 a IL8) a k aktivaci leukocytů, které produkují RONS. Druhou možností je, že toxické metabolity mohou poškodit spermatogenezi, a tím dojde k aktivaci leukocytů, které se snaží odstranit poškozené spermie [30].

Zdá se, že novým významným faktorem, ovlivňujícím jak morfologicko-funkční hodnoty spermií, tak míru oxidativního stresu, se stává záření vycházející z nevhodně nošených mobilních telefonů [11].

BIOLOGICKÁ ÚLOHA REAKTIVNÍCH FOREM KYSLÍKU A DUSÍKU

Malé množství RONS (peroxid vodíku, superoxidový radikál a oxid dusnatý) působí příznivě při některých procesech nutných pro oplodnění vajíčka [15]. Spermie obsažené v ejakulátu nejsou schopné ihned oplodnit vajíčko a v ženském pohlavním ústrojí prodělávají několik dozrávacích změn (kapacitace spermií). Díky tomuto procesu jsou spermie schopné vázat se na glykoproteinový obal vajíčka (zona pellucida) a podstoupit akrozomovou reakci – exocytózu akrozomu, která spermii usnadní průchod glykoproteinovým obalem vajíčka a umožní jí spojení s vajíčkem a jeho fertilizaci [1].

Na tvorbě peroxidu vodíku se podílí samotná spermie během kapacitace. Nízké hladiny peroxidu podporují kapacitaci a s ní spojené další děje a naopak vysoké koncentrace tento proces inhibují [5, 28].

ANTIOXIDANTY

RONS jsou nezbytné pro fyziologickou funkci spermií, ale musí být kontrolovány a jejich koncentrace udržována na úrovni, kdy nedochází k poškození buněk. Tato funkce je zajišťována antioxidanty přítomnými v seminální plazmě [22]. Antioxidační obranný mechanismus zahrnuje tři úrovně ochrany: prevenci tvorby RONS, záchyt a odstranění již vzniklých radikálů a opravu poškozených biomolekul.

Antioxidanty poskytují své elektrony volným radikálům, a tím dochází k ukončení řetězové reakce. Ztrátou elektronu se z antioxidantů stávají také volné radikály, které ale nejsou nebezpečné. Jednotlivé antioxidanty spolu vzájemně spolupracují a funkce jednoho antioxidantu často podmiňuje účinek jiného [34]. Zdrojem antioxidantů může být samotná cytoplazma spermií. Podstatná část se ale nachází v seminální plazmě.

Mezi hojně zastoupené antioxidanty v seminální plazmě patří vitaminy, především vitaminy A, C a E. Vitamin E hraje důležitou roli v ochraně buněčné membrány spermií před působení RONS, během níž se sám oxiduje na tokoferolový radikál. Zpět na tokoferol je redukován prostřednictvím vitaminu C [7]. Dále se sem řadí prvky selen a zinek [15].

Velkou skupinu antioxidantů tvoří proteiny vázající ionty kovů. Tím, že je ion kovu navázán na protein, není schopen katalyzovat produkci volných radikálů Fentonovou reakcí. Mezi tyto proteiny se řadí například albumin, ceruloplazmin, transferin, feritin a myoglobin [19]. Dalšími významnými antioxidanty v seminální plazmě jsou kyselina močová, koenzym Q₁₀, taurin a hypotaurin, karotenoidy (ß-karoten), flavonoidy, L-karnitin, melatonin a pyruvát.

Seminální plazma zdravých mužů obsahuje významně vyšší hladiny antioxidantů než plazma mužů s poruchami plodnosti [18]. To může být způsobeno větší produkcí RONS u nemocných mužů. Podáváním antioxidantů pacientům s poruchami plodnosti dochází ke zlepšení parametrů spermiogramu. K léčbě se mohou užívat samotné antioxidanty, například vitaminy C a E, či jejich vzájemná kombinace s dalšími antioxidanty, jako je koenzym Q₁₀, albumin, glutathion, selen, zinek a další. Užíváním antioxidantů dochází k poklesu peroxidace lipidů, zvýšení pohyblivosti spermií, zvýšení počtu spermií, zlepšení jejich morfologie a k poklesu fragmentace DNA spermií [15, 19].

KYSELINA ASKORBOVÁ JAKO VÝZNAMNÝ ANTIOXIDANT

Kyselina askorbová je triviální označení vitaminu C (2-oxo-L-threo-hexono-1,4-lakton-2,3-endiol). Mnoho savců dokáže syntetizovat v játrech kyselinu askorbovou z glukózy. Lidé a některé další druhy zvířat tuto schopnost postrádají v důsledku ztráty enzymu gulonolaktonoxidázy, který je důležitý pro syntézu prekurzoru kyseliny askorbové 2-oxo-L-gulonolaktonu. Množství vitaminu C v lidském těle je tedy závislé na příjmu z potravy [21].

Kyselina askorbová poskytuje dva elektrony z dvojné vazby mezi druhým a třetím uhlíkem ve své molekule, a tím se sama oxiduje. Poskytnutím elektronu jiným sloučeninám brání jejich oxidaci, a proto je označována jako antioxidant. Ztrátou jednoho elektronu se z kyseliny stává volný radikál označovaný jako kyselina semidehydroaskorbová či askorbylový radikál. Ve srovnání s jinými volnými radikály je tento radikál poměrně stabilní, s biologickým poločasem 10^-5s, a je jen málo reaktivní. Ztrátou druhého elektronu vzniká kyselina dehydroaskorbová. Askorbylový radikál a kyselina dehydroaskorbová mohou být v biologických systémech redukovány zpět na kyselinu askorbovou, například pomocí glutathionu. Redukce ovšem není úplná a část kyseliny dehydroaskorbové je nevratně hydrolyzována za vzniku 2,3-dioxogulonové kyseliny, která je dále metabolizována na xylózu, xylonát, lyxonát a oxalát [24].

Koncentrace kyseliny askorbové je v seminální plazmě až 10krát vyšší než v krevní plazmě. V několika studiích byla prokázána souvislost mezi hladinou kyseliny askorbové a plodností. U mužů s nižšími hladinami kyseliny askorbové bylo zjištěno zvýšené poškození DNA spermií [12, 33]. V jiné studii byli pacienti rozděleni do skupin podle výsledků spermiogramů. Pacienti zařazení do skupiny normospermie vykazovali nejvyšší hladiny kyseliny askorbové, za nimi následovala skupina pacientů s normálním počtem spermií, ale s poruchami jejich pohyblivosti a morfologie, následovali pacienti se sníženým počtem spermií a na posledním místě s nejnižšími hladinami skončili pacienti, u kterých spermie nebyly nalezeny (azoospermie) [10]. Rozdílné hladiny kyseliny askorbové byly naměřeny i u kuřáků a nekuřáků [9, 20].

OXIDAČNÍ STRES

Za fyziologických podmínek je v organismu ustavena rovnováha mezi množstvím volných radikálů, RONS a antioxidanty. Zvýšená tvorba RONS nezralými spermiemi a leukocyty, snížená koncentrace antioxidantů nebo případně kombinace obojího vedou k vyvolání oxidačního stresu [32].

Potenciálními cíli oxidačního stresu jsou všechny buněčné komponenty obsahující lipidy, proteiny, nukleové kyseliny a sacharidy. Rozsah poškození vyvolaných oxidačním stresem nezávisí pouze na množství zapojených RONS, ale také na délce jejich působení a dalších faktorech, jako je teplota, tlak kyslíku a okolní prostředí [19].

Zvýšená produkce RONS a vznik oxidačního stresu ve varlatech je spojována s některými onemocněními, která často bývají i příčinou neplodnosti mužů. Jde především o infekční onemocnění močových a pohlavních cest, kryptorchismus, varikokélu, torzi varlat, diabetes a nerovnováhu v hladinách pohlavních hormonů. Rovněž byla nalezena závislost mezi zvýšenou produkcí RONS a sníženou pohyblivostí spermií [6]. Negativní vliv na funkci varlat a zvýšenou produkci RONS má také příliš velká námaha a některé látky vnějšího prostředí, zahrnující kouření, alkohol, těžké kovy a různé druhy záření [7]. Vysoké hodnoty RONS se vyskytují přibližně u 40 % mužů, kteří mají problémy s plodností [25].

Spermie jsou k účinku RONS obzvláště vnímavé. Jejich cytoplazmatická membrána obsahuje totiž velké množství fosfolipidů, sterolů, nasycených a polynenasycených mastných kyselin [29]. Naproti tomu jsou v cytoplazmě nízké koncentrace antioxidačních enzymů (superoxiddismutáza, glutathionperoxidáza, glutathionreduktáza), které oxidativnímu stresu brání [31]. Volné radikály napadají především polynenasycené mastné kyseliny a způsobují kaskádu chemických reakcí nazývaných peroxidace lipidů. V prvním kroku – iniciaci – dojde k odtržení atomu vodíku z nenasycené mastné kyseliny a vzniku radikálu. Tento radikál může reagovat s molekulou kyslíku a vzniká peroxylový radikál. Ten je schopen vytrhnout elektron z další nenasycené mastné kyseliny, a tím dochází k propagaci reakce. Reakce pokračuje tak dlouho, dokud se radikál mastné kyseliny nesetká s jiným radikálem nebo například s vitaminem E. Tím dojde k ukončení řetězové reakce – terminaci [19]. Vedlejšími produkty peroxidace lipidů jsou mimo jiné malondialdehyd a 4-hydroxynonenal, které slouží jako ukazatele poškození biomolekul vlivem oxidačního stresu [29].

Peroxidací lipidů se mění struktura a funkce cytoplazmatické membrány. Dochází ke změně propustnosti membrány a k hromadění iontů (hlavně sodíku a vápníku) uvnitř buňky, což vede k její destrukci [32].

V nejzávažnějších případech dochází působením volných radikálů k poškození integrity DNA. DNA spermií je chráněna před oxidačním stresem dvěma způsoby: maximální kondenzací chromatinu spermií a antioxidanty přítomnými v seminální plazmě. Reaktivní formy kyslíku a dusíku poškozují DNA formou různých modifikací všech bází, delecí, posunem čtecího rámce, mohou způsobovat různé typy genových mutací, jako je bodová mutace a polymorfismus, které vedou ke snížení kvality spermií. Běžným produktem oxidace DNA je 8-hydroxy-2-deoxyguanosin, který slouží také jako ukazatel míry oxidativního poškození DNA. Při vážnějším poškození genetické informace ztrácejí spermie schopnost fertilizace oocytu, popřípadě může docházet k abnormálnímu růstu embryí, časným potratům a negativnímu vlivu na fetální vývoj jedince.

MOŽNOSTI LÉČBY

Snížení hladiny RONS v seminální plazmě může zlepšit některé parametry spermií, důležitých především pro správnou vazbu spermií na buněčnou stěnu vajíčka a jeho fertilizaci [6]. Příznivý vliv by zde mohlo mít podávání vitaminu E, C a selenu [17, 14]. V případě ztráty schopnosti spermie přirozeně fertilizovat oocyt je nutná léčba v centrech asistované reprodukce. U základních metod intrauterinní inseminace a in vitro fertilizace se léčbou obchází především snížená pohyblivost spermií, často způsobená účinkem RONS [6, 8]. K selekci spermie, která fertilizuje oocyt, ale dochází stále přirozeně. Při metodě ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie) dochází k injektování spermie tenkou skleněnou kapilárkou přímo do cytoplazmy oocytu, čímž se obchází neschopnost spermie překonat bariéru buněčné stěny oocytu. Hrozí ale použití spermie s vážnějším poškozením DNA, neboť se uměle překonává přirozená bariéra selekce spermií vazbou oocyt – spermie [4, 35]. Vážnější poruchy zasahující samotnou genetickou informaci a integritu chromatinu spermií odhalí analýza integrity chromatinu ve spermiích (Sperm Chromatin Structure Assay, SCSA). Při vážnějším poškození integrity chromatinu se doporučuje možnost léčby za použití dárcovských reprodukčních buněk.

RNDr. Radek Hampl, Ph.D.

Centrum asistované reprodukce Sanus

Rokycanova 2798

530 02 Pardubice