Ovlivňuje použití transferového média EmbryoGlue úspěšnost embryotransferu?

Does EmbryoGlue transfer medium affect embryo transfer success rate?

Objective:

Verification of the effect of EmbryoGlue (EG) transfer medium enriched with hyaluronan on the embryo transfer success rate.

Design:

A prospective study.

Setting:

Fertimed, Fertility Treatment Centre, Olomouc.

Methods:

484 patients undergoing IVF + ET were engaged who were divided according to the medium used during transfer: Sage or Vitrolife culture medium (n = 135) and EG transfer medium (n = 349). The influence of other factors was also evaluated: age, number of received oocytes, percentage of fertilised oocytes, endometrium height on the day of transfer, number of preserved embryos, number of transferred embryos and the length of cultivation (48, 72, 96, 120 h). These factors were considered quantitative variables while the method of hormone stimulation, the type of culture medium and the application of EG were considered qualitative (categorical) variables.

Results:

With the use of EG the chances of conception increased by approximately 9%. The negative effect of higher age on implantation proportion and the positive effect of cultivation prolongation were proven. The effect of EG on miscarriages was not proven. The probability of miscarriage diminished with higher oocyte fertilisation. The culture medium used (Sage or Vitrolife) before the application of EG does not affect the gravidity result.

Conclusion:

Using the transfer medium of EmbryoGlue before embryo transfer affects the pregnancy rate (PR) in a positive manner. The influence on pregnancy loss with the application of EG was not proven.

Keywords:

EmbryoGlue, hyaluronan, IVF, in vitro fertilisation

Autoři: B. Zbořilová ^1,2; I. Oborná ^1,3; E. Tkadlec ^4,5; M. Procházka ^1,6; J. Březinová ⁷; A. Sobek jr. ¹; A. Sobek ¹
Působiště autorů: Fertimed, Olomouc/Polanka nad Odrou, vedoucí doc. MUDr. A. Sobek, CSc. ¹; Ústav biologie LF UP, Olomouc, přednosta doc. RNDr. V. Divoký, Ph. D. ²; Porodnicko-gynekologická klinika LF UP a FN, Olomouc, přednosta prof. MUDr. R. Pilka, Ph. D. ³; Katedra ekologie a životního prostředí PřF UP, Olomouc, vedoucí katedry prof. MVDr. E. Tkadlec, CSc. ⁴; Ústav biologie obratlovců AV ČR, Studenec, ředitel doc. Ing. M. Honza ⁵; Ústav lékařské genetiky FN, Olomouc, přednosta prof. MUDr. M Procházka ⁶; SpermBank International, Olomouc, JUDr. M. Polach ⁷
Vyšlo v časopise: Ceska Gynekol 2018; 83(3): 177-181

Souhrn

Cíl studie:

Ověřit vliv hyaluronanem obohaceného transferového média EmbryoGlue (EG) na úspěšnost embryotransferu.

Typ studie:

Prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:

Fertimed, centrum pro léčbu neplodnosti, Olomouc.

Metodika:

Do studie bylo zařazeno 484 pacientek podstupujících IVF + ET, které byly rozděleny podle použitého média při transferu: kultivační médium Sage nebo Vitrolife (n = 135) a transferové médium EG (n = 349). Byl hodnocen i vliv dalších faktorů: věku, počtu získaných oocytů, procenta fertilizovaných oocytů, výšky endometria v den transferu, počtu konzervovaných embryí, počtu přenesených embryí a délky kultivace (48, 72, 96, 120 h). Tyto faktory byly považovány za kvantitativní proměnné, zatímco způsob hormonální stimulace, typ kultivačního média a použití EG byly považovány za kvalitativní (kategorické) proměnné.

Výsledky:

Při použití EG se pravděpodobnost otěhotnění zvýšila průměrně o 9 %. Byl prokázán negativní vliv vyššího věku na implantační poměr a pozitivní vliv prodloužené kultivace. Vliv EG na potratovost prokázán nebyl. Pravděpodobnost potratu klesala s vyšší fertilizací oocytů. Typ použitého one-step kultivačního média (Sage nebo Vitrolife) před použitím EG neovlivnil výsledek gravidity.

Závěr:

Použití transferového média EmbryoGlue při embryotransferu pozitivně ovlivňuje pregnancy rate (PR). Ovlivnění těhotenských ztrát použitím EG prokázáno nebylo.

klíčová slova:

EmbryoGlue, hyaluronan, IVF, in vitro fertilizace

ÚVOD

Hyaluronan (HA), přirozeně se vyskytující makromolekula z rodiny glykosaminoglykanů, je bohatě zastoupen v tělních tekutinách a extracelulární matrix [19]. HA je také hlavním glykosaminoglykanem v sekretu dutiny děložní a vejcovodů. Bylo prokázáno, že zvyšuje adhezi typu buňka-buňka a buňka-extracelulární matrix, tedy i apozici a adhezi blastocysty v procesu implantace [19, 25, 27]. Byla prokázána dramaticky se zvyšující biosyntéza HA v embryu v době implantace s poklesem jeho produkce hned následující den, a to u myších [4] i lidských embryí [21].

Apozice a adheze hrají skutečně významnou roli v zahájení implantace. I proto jsou komerčně dostupná sekvenční média obohacována o různé složky s cílem zvýšit implantaci. Takovou složkou jsou např. proteiny, nejčastěji albumin, nověji také hyaluronan. Firma Vitrolife, Švédsko, přidává HA do svých kultivačních médií. Zatímco standardní single step kultivační médium G-TL, které se používá ke kultivaci embryí od fertilizace až do stadia blastocysty obsahuje vyšší koncentrace humánního sérového albuminu (5 mg/ml) a nižší koncentrace HA (0,125 mg/ml), u média EmbryoGlue (EG) je situace opačná. Médium obsahuje pouze 2,5 mg/ml rekombinantního humánního albuminu, ale 0,5 mg/ml HA. Navíc je EG obohaceno i o esenciální mastné kyseliny, zatímco G-TL médium obsahuje pouze neesenciální mastné kyseliny a také EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová), která u média EG zcela chybí (Singh, 2015, Vitrolife manuál http://www.vitrolife.com/Documents/Product%20manuals/Manual%20G-Series%20INTL%20v9-2.pdf).

SAGE 1-step médium obsahuje EDTA, humánní sérový albumin (5 mg/ml), mastné kyseliny, Gentamycin (0,01 mg/ml) a také HA v koncentraci 0,1 mg/ml (Origio manuál https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf13/K133707.pdf).

Cílem naší studie bylo ověření přínosu transferového média EG na implantaci embryí v porovnání se standardními one-step médii G-TL (Vitrolife, Švédsko) a SAGE 1-step (Origio, Dánsko) a dále jeho možný vliv na těhotenské ztráty v programu asistované reprodukce.

MATERIÁL A METODIKA

Do prospektivní studie bylo zařazeno 349 pacientek podstupujících IVF cyklus s embryo transferem v období od 1. 6. 2015 do 31. 12. 2017 na pracovišti FERTIMED, s.r.o., u nichž bylo při přenosu embryí použito transferové médium EG. Kontrolní skupinu tvořilo 135 pacientek, u kterých bylo použito kultivační médium (SAGE 1-Step 54% nebo G-TLVitrolife médium 46%). U vstupních parametrů (např. věk pacientek, počet získaných a oplozených oocytů, počet embryí aj.) obou souborů nebyl zjištěn významný rozdíl (tab. 1). U všech sledovaných pacientek byla použita metoda oplození ICSI a vzniklá embrya byla transferována po 48 (21 %), 72 (32 %), 96 (20 %) a 120 hodinách kultivace (27 %). Hodnocení kvality embryí bylo provedeno naším běžně používaným systémem hodnocení kvality. Hodnotili jsme počet buněk v embryu a procento fragmentace: (a) do 10 %, (b) 10–20 %, (c) 20–50 % a (d) fragmentace nad 50 % obsahu embrya. U skupiny s použitím EG byla embrya ekvilibrována před vlastním ET v tomto médiu vždy minimálně 20 minut a maximálně jednu hodinu, poté byla v tomto médiu (asi 20 µl) přenesena do dělohy. Embrya z kontrolní skupiny byla kultivována a transferována v kultivačním médiu (Sage, Vitrolife) a přenesena za stejných podmínek do dělohy, ale v kultivačním médiu Sage nebo Vitrolife. Za klinickou graviditu jsme označili těhotenství, u kterých byl ultrazvukem prokázán gestační váček s přítomnou nebo nepřítomnou akcí srdeční. Biochemické gravidity nebyly do studie zahrnuty.

**Tab. 1. Srovnání pacientek – vstupní parametry**

VÝSLEDKY

V modelech s jedním prediktorem (tab. 2) bylo prokázáno, že pravděpodobnost otěhotnění rostla s délkou kultivace, s počtem konzervovaných embryí a po stimulaci dlouhým protokolem s GnRH agonisty. Pravděpodobnost otěhotnění naopak klesala s věkem pacientky a se stoupajícím počtem transferovaných embryí. U ostatních proměnných byla podpora malá. Z kombinovaných modelů získaly největší podporu čtyři modely, které vždy obsahovaly věk, dobu kultivace a typ použité stimulace (tab. 3). Je tedy zřejmé, že tyto tři proměnné EG významně ovlivňují pravděpodobnost otěhotnění. Ve třech ze čtyř nejlepších modelů byla zastoupena také proměnná EG, což může naznačovat jistý slabší pozitivní efekt aplikace EG (tab. 3). Nejlepší model předpovídá, že pacientce při použití EG stoupá pravděpodobnost otěhotnění průměrně o 9 % (při délce kultivace 48 h o 5,4 %, 72 h o 7,4 %, 96 h o 9,2 %, 120 h o 9,8 %), vs. pacientky bez EG (tab. 2).

Podpora modelů s jedním prediktorem ve srovnání
s modelem jen s interceptem, který neobsahoval prediktor — **Tab. 2. Podpora modelů s jedním prediktorem ve srovnání s modelem jen s interceptem, který neobsahoval prediktor**

Struktura kombinovaných modelů, jejichž AIC se od
nejlepšího modelu lišilo o méně než 2 — **Tab. 3. Struktura kombinovaných modelů, jejichž AIC se od nejlepšího modelu lišilo o méně než 2**

**Tab. 4. Závislost PR na době kultivace a použití EG**

Z uvedené analýzy vyplývá, že jistá slabší podpora pro modely s EG existuje, neboť nejlepší modely pravidelně obsahují použité EG při ET. Potvrdili jsme však, že mnohem větší vliv na pravděpodobnost vzniku těhotenství má věk, délka kultivace a typ použité stimulace. Pacienti s EG měli větší pravděpodobnost otěhotnění.

DISKUSE

Médium EmbryoGlue (Vitrolife, Švédsko) je určeno k transferu lidských embryí, obsahuje vyšší koncentraci HA a nižší koncentraci albuminů, než je běžné v kultivačních médiích. V den implantace se produkce hyaluronanu v embryu výrazně zvyšuje, což koreluje s přeměnou buněk endometriálního stromatu v buňky deciduální a následující den produkce rychle klesá [4]. Je známo, že HA se účastní fyziologických procesů, jako je embryonální vývoj, migrace, adheze, proliferace a diferenciace buněk. Vlivem hyaluronanu stoupá adheze typu buňka-buňka a buňka-extracelulární matrix, což významně podporuje proces apozice a adheze blastocysty [19, 25, 27]. HA také nepřímo podporuje angiogenezi [22], tím se zlepšuje apozice a uchycení embrya, což jsou klíčové kroky v procesu implantace.

Počáteční studie vlivu HA na myších embryích prováděli Gardner et al. [5], kteří prokázali signifikantně zvýšenou implantaci embryí při použití hyaluronanu. Při studiu lidských embryí se potvrdilo, že hyaluronan může úspěšně nahradit lidský sérový albumin jako výhradní makromolekulu v médiu používaném při embryotransferu [24], což vedlo k vysokému počtu těhotenství [5]. Simon et al. [5] prokázali lepší pregnancy rate (PR) a implantation rate (IR) při použití média obohaceného HA v porovnání s albuminem, rozdíl nebyl významný a velikost souboru byla malá. Několik dalších studií také prokázalo vyšší míru PR a IR při ET v médii obohacenými o HA [8, 27, 9 16]. Schoolcraft et al. [21] popisují významně vyšší PR (EG 58,9 % vs. G2.2 48,5 %) i IR (EG 29 % vs. G2.2 21,7 %) při použití EG média. Sobodova et al. [24] prokázali vyšší PR ve skupině pacientek od 30 do 38 let při přenosu dvou embryí s použitím média EG (27,7 % vs. 15,3 %).

Závislost pravděpodobnosti otěhotnění na věku, době kultivace a aplikaci EG u pacientek bez EG (a) a s EG (b), jak ji předpovídá
nejlepší model pro pacientky stimulované lagon a s průměrným počtem oocytů — Obr. 1. Závislost pravděpodobnosti otěhotnění na věku, době kultivace a aplikaci EG u pacientek bez EG (a) a s EG (b), jak ji předpovídá nejlepší model pro pacientky stimulované lagon a s průměrným počtem oocytů

ZÁVĚR

U žen léčených pro neplodnost jsme prokázali, že EG zvyšuje pravděpodobnost otěhotnění v průměru o 9 % (kultivace 48 h 5,4 %, 72 h 7,4 %, 96 h 9,2 %, 120 h 9,8 %). Pravděpodobnost otěhotnění klesala v závislosti na věku pacientek v době odběru. Délka kultivace naopak pravděpodobnost otěhotnění zvyšovala. Použití EG média nemá vliv na aborty po asistované reprodukci. Transfer embryí v EG médiu se jeví jako velmi pozitivní.

RNDr. Blažena Zbořilová

Fertimed, s. r. o.

Boleslavova 2

772 00 Olomouc

e-mail: blazena_hladikova@email.cz

Zdroje

1. Balaban, B., Urman, B., Yakin, K., et al. High pregnancy and implantation rates can be achieved in blastocyst transfers using hyaluronan enriched culture and transfer médium. Fertil Steril, 2004, 82, Suppl. 2, p. 221.

2. Bontekoe, S., Johnson, N., Blake, D. Adherence compounds in embryo transfer media for assisted reproductive technologies. Cochrane Database of Systematic Reviews 2014, Issue 2.

3. Burnham, KP, Anderson, DR. Model selection and multimodel inference. a practical information-theoretic approach, 2nd ed. New York, USA, Springer, 2002.

4. Carson, DD., Dutt, A., Tang, JP. Glycoconjugate synthesis during early pregnancy: hyaluronate synthesis and function. Dev Biol, 1987, 120, p. 228–235.

5. Gardner, DK., Rodriegez-Martinez, H., Lane, M. Fetal development after transfer is increased by replacing protein with the glycosaminoglykan hyaluronan for mouse embryo culture and transfer. Hum Reprod, 1999, 14, p. 2575–2580.

6. Fancsovits, P., Murber, A., Tothne Gilan, Z., et al. Effect of hyaluronan containing transfermedia on pregnancy and implantation rates in human IVF-ET cycles. A prospective randomized study. Hum Reprod, 2011, 26, p. 24.

7. Fancsovits, P., Lehner, A., Murber, A., et al. Effect of hyaluronan-enriched embryo transfer médium on IVF outcome: A prospective randomized clinical trial. Arch Gynecol Obstet, 2015, 291, p. 1173–1179.

8. Friedler, S., Schachter, M., Strassburger, D., et al. A randomized clinical trial csparing recombinant hyaluronan/recombinant albumin versus human tubal fluid for cleavage stage embryo transfer in patients with multiple IVF-embryo transfer failure. Hum Reprod, 2007, 22, p. 2444–2448.

9. Hambiliki, F., Ljunger, E., Karlström, PO., Stavreus-Evers, A. Hyaluronan-enriched transfer médium in cleavage-stage frozen-thawed embryo transfers increases implantation rate without improvement of delivery rate. Fertil Steril, 2010, 94, p. 1669–1673.

10. Hazlett, WD., Meyer, LR., Nasta, TE., et al. Impact of EmbryoGlue as the embryo transfer médium. Fertil Steril, 2008, 90, p. 214–216.

11. Kano, K., Miyano, T., Kato, S. Effects of glycosaminoglycans on the development of in vitro-matured and fertilized porcine oocytes to the blastocyst stage in vitro. Biol Reprod, 1998, 58, p. 1226–1232.

12. Korosec, S., Virant-Klun, I., Tomazevic, T., et al. Single freshand frozen-thawed blastocyst transfer using hyaluronan-rich transfer médium. Reprod Biomed Online, 2007, 15, p. 701–707.

13. Leese, HJ. Formation and function of oviduct fluid. J Reprod Fertil, 1988, 82, p. 843–856.

14. Loutradi, KE., Prassas, I., Bili, E., et al. Evaluation of a transfer médium containing high concentration of hyaluronan in human in vitro fertilization. Fertil Steril, 2007, 87, p. 48–52.

15. Mahani, IM., Davar, R. Hyaluronic acid versus albumin inhuman embryo transfer médium. Eastern Mediterranean Health J, 2007, 13, p. 876–880.

16. Nakagawa, K., Takahashi, C., Nishi, Y., et al. Hyaluronan-enriched transfer médium improves outcome in patients with multiple embryo transfer failures. J Assist Reprod Genet, 2012, 29, p. 679–685.

17. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2017.

18. Ravhon, A., Nahum, H., Weissman, A., et al. Embryo transfer in hyaluronan enrichedtransfer médium does not improve pregnancy rate in IVF treatment. Fertil Steril, 2005, 84, p. 376–377.

19. Salustri, A., Camaioni, A., Di Giacomo, M., et al. Hyaluronan and proteoglycans in ovarian follicles. Hum Reprod UpDate, 1999, 5, p. 293–301.

20. Scott, JE., Heatley, F. Biological properties of hyaluronan in aqueous solution are controlled and sequestered by reversible tertiary structures, defined by NMR spectroscopy. Biomacromolecules, 2002, 3, p. 547–553.

21. Schoolcraft, W. Increased hyaluronan concentration in the embryo transfer médium results in a significant increase in human embryo implantation rate. Fertil Steril, 2002, 76, Suppl., p. 1–11.

22. Simon, A., Safran, A., Revel, A., et al. Hyaluronic acid can successfully replace albumin as the sole macromolecule in a human embryo transfer médium. Fertil Steril, 2003, 79, p. 1434–1438.

23. Singh, N., Gupta, M., Kriplani, A., Vanamail, P. Role of Embryo Glue as a transfer médium in the outcome of fresh non-donor in-vitro fertilization cycles. J Hum Reprod Sci, 2015, 8, p. 214–217.

24. Svobodova, M., Březinova, J., Oborna, I., et al. Transferové médium s hyaluronanem EmbryoGlue v programu IVF + ET. Čes Gynek, 2007, 72, s. 15–19.

25. Turley, E., Moore, D. Hyaluronate binding proteins also bind to fibronectin, laminin and collagen. Biochem Biophys Res Commun, 1984, 121, p. 808–814.

26. Urman, B., Yakin, K., Ata, B., et al. Effect of hyaluronan-enriched transfer médium on implantation and pregnancy rates after day 3 and day 5 embryo transfers: A prospective randomized study. Fertil Steril, 2008,90, p. 604–612.

27. Yanagishita, M. Proteoglycans and hyaluronan in female reproductive organs. Proteoglycans, 1994, 70, p. 179–190