Implantace a diagnostika receptivity endometria

Súhrn

Cíl studie: Přehled problematiky mechanismů receptivity endometria při implantaci embrya a možnosti její diagnostiky.

Typ studie: Přehledový článek.

Název a sídlo pacoviště: Porodnicko-gynekologická klinika, FN a LF UP Olomouc; Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP Olomouc.

Výsledky: Endometrium je velmi dynamická tkáň procházející cyklickou proliferací, diferenciací a transportem buněk, zvláště pak buněk imunitního systému. Vše se děje v závislosti na změně cirkulujících ovariálních hormonů estradiolu a progesteronu. Remodelování endometria v době implantace embrya je kontrolováno v časoprostoru intenzitou senescence deciduálních buněk a efektivitou jejich imunologické likvidace. Receptivita endometria může být dnes hodnocena jak na bázi transkriptomického profilování biopsie endometria pomocí ERA systému, tak i proteomickou analýzou endometriálního sekretomu nebo cervikálního hlenu pomocí metod diferenční gelové elektroforézy (DIGE) a hmotnostní spektrometrie (MS).

Závěr: Vzhledem k nejnovějším poznatkům v oblasti fyziologie a molekulární biologie endometria by bylo zajímavé aplikovat proteomické přístupy v hledání kandidátních biomarkerů ze vzorků získaných pokud možno neinvazivními postupy a aplikovat je v klinické praxi.

Klíčová slova: implantace, endometriální receptivita, proteomická analýza, sekretom, cervikální hlen

ÚVOD

Endometrium je dynamická tkáň procházející cyklickou regenerací a degenerací, která je založena nejen na změně cirkulujících ovariálních hormonů estradiolu a progesteronu, ale také na řadě různých cytokinů, které regulují optimální vývoj endometriálních a imunitních buněk. Cyklické změny endometria jsou rozděleny na jednotlivé fáze: proliferační, sekreční, ischemickou a menstruační. Pokud nedojde k otěhotnění, dochází k rozpadu tkáně následovanému její regenerací. Hlavním cílem tohoto komplexního procesu je úspěšná adheze, invaze a placentace plodu s další regenerací postpartum [11].

IMPLANTAČNÍ OKNO ENDOMETRIA

Koncept implantačního okna (window of implantation, WOI) definovaného jako krátké období v menstruačním cyklu, kdy se endometrium připravuje na nidaci embrya, byl poprvé navržen v roce 1956 [16]. Toto období trvá čtyři až pět dnů v době, kdy je možné detekovat maximální hladinu progesteronu v krvi. Na počátku devadesátých let minulého století byl koncept implantačního okna jako časového intervalu, ve kterém je nutné přenést embryo pro co největší šanci na implantaci, demonstrován Navotem a spol. [28]. V roce 1999 byla na základě detekce změn koncentrací estron 3-glucuronidu a pregnandiol 3-glucuronidu v moči stanovena ovulace a následně nejvhodnější doba pro implantaci embrya na 8–10 dní po ovulaci [42]. Do úvah o receptivitě endometria ale nebyly zahrnuty individuální rozdíly nebo hormonální léčba předcházející embryotransferu (kontrolovaná ovariální stimulace, IVF v nativním cyklu, substituční hormonální terapie).

V dnešní době je možno díky novým diagnostickým metodám, jako je například transkripční profilování, přesněji klasifikovat období nejvyššího implantačního potenciálu a optimální receptivity endometria [34, 39]. Další, prozatím experimentální diagnostickou metodou je proteo­mická analýza endometriálního sekretu, popřípadě cervikálního hlenu, dnes většinou prováděná pomocí metod hmotnostní spektrometrie. Tyto metody dovolují velmi přesně detekovat různé proteiny přítomné v získaném vzorku. Role endometria není omezena jen na implantaci embrya, ale také na vytvoření adekvátního prostředí pro další rozvoj embrya. Postimplantační vývoj je spojen s rozvojem komunikace mezi embryem a endometriem na základě signálních molekul a zajištění kontinuálního zdroje živin pro rostoucí embryo. Mezibuněčné interakce jsou přenášeny proteiny, cytokiny a jejich inhibitory, růstovými faktory, receptory nebo modulátory. Poslední studie však ukazují, že endometrium mnohem dynamičtěji kontroluje implantaci embrya, než se doposud myslelo.

AKTIVITA METALOPROTEINÁZ JAKO SOUČÁST PROCESU IMPLANTACE EMBRYA

Matrix-metaloproteinázy (MMP) jsou skupinou enzymatických proteinů s proteolytickou aktivitou, hrajících zásadní roli v procesu remodelace endometria (obr. 1). Syntéza MMP proteinů je regulována mnoha faktory včetně steroidních hormonů, růstových faktorů, cytokinů, onkogenů [26]. Proteolytická aktivita MMP proteinů závisí na typu tkáně, lokálním pH a aktivitě jejich tkáňových inhibitorů (TIMP). Bylo zjištěno, že tyto inhibitory (TIMP 1–4) nejenže regulují aktivitu metaloproteináz, ale také se účastní stimulace růstu tkání, angiogeneze a apoptotických procesů [43].

Důležitou součástí stability endometria je kontinuálně exprimovaný enzym MMP-2 ve stromálních buňkách endometria [20]. Exprese MMP-2 pozitivně koreluje s koncentrací estradiolu a negativně s hladinou progesteronu. Produkce MMP-2 dosahuje maxima v pozdně sekreční fázi cyklu a po jejím poklesu na konci cyklu dochází k rozpadu endometriální tkáně a počátku menstruace [20].

Dalším nepostradatelným enzymem je MMP-9, který se podílí na degradaci kolagenu IV a elastinu, jež jsou jednou z hlavních komponent extracelulární matrix (ECM). MMP-9 je exprimován ve stromálních buňkách endometria (hESC) jako neaktivní zymogen pro-MMP-9 [30]. Se zvýšením koncentrace jak estradiolu, tak i progesteronu klesá koncentrace pro-MMP-9, zatímco koncentrace MMP-9 zůstává stabilní a je nezávislá na poklesu koncentrace progesteronu [6]. TIMP-2 je protein syntetizovaný pouze fibroblasty a endoteliálními buňkami a má vysokou afinitu k MMP-2 a aktivované formě MMP-9. Naproti tomu glykoprotein TIMP-1 je produkován více typy buněk a má vysokou afinitu k pro-MMP-9. [27].

Na základě studie Cheginiho z roku 2003 bylo zjištěno, že jedna z hlavních cest aktivace pro-MMP-9 je pomocí relativně nedávno objevené metaloproteinázy MMP-26 [18]. MMP-26 je lokalizována pouze v epiteliálních buňkách endometria (hEEC) s narůstající intenzitou exprese v průběhu proliferační fáze cyklu, maximem v období ovulace a následnou klesající tendencí v pozdně sekreční fázi cyklu. V menstruační fázi již nebyla MMP-26 exprese detekovatelná [33]. V prostředí in vitro kultivace byla prokázána regulace exprese MMP-26 prostřednictvím jak estradiolu, tak i progesteronu [33]. Maximální exprese MMP-26 v časné sekreční fázi cyklu je doprovázena expresí jejího inhibitoru TIMP-4. V hESC buňkách byla detekována mRNA, ale pouze velmi nízká úroveň samotného TIMP-4 inhibitoru. Samotný enzym TIMP-4 byl detekován v apikální části hEEC, kde plní svou funkci regulace MMP-26 [32]. Tento fakt podporuje skutečnost, že v endometriálním sekretu byl detekován pouze TIMP-4 bez MMP-26, který tak omezuje aktivitu MMP-26 na oblast hEEC [32]. Na základě in vitro experimentů s Ishikawa buňkami a BeWo sferoidy bylo později zjištěno, že MMP-26 se aktivně účastní implantace embrya (obr. 1) a její samotná exprese je regulována transkripčním faktorem homeobox a 10 (HOXA-10) [23]. Exprese HOXA-10 spolu s dalším transkripčním faktorem HOXA-11 byla u 31 žen s endometriózou značně snížena a korelovala s objektivním nálezem vrásčitější struktury endometria, než tomu bylo v případě 26 kontrol [21]. V roce 2017 bylo dále zjištěno, že samotný transkripční faktor HOXA-10 je modifikován prostřednictvím small ubiquitin-like modifier 1 (SUMO1). Touto modifikací dochází ke snížení stability HOXA-10 a inhibici implantace embrya demonstrované in vitro na Ishikawa buňkách a BeWo sferoidech [22]. Vysoká úroveň modifikace HOXA-10 pomocí SUMO1 byla zjištěna u žen s opakovaným potrácením (RIF) v průběhu sekreční fáze cyklu endometria vzhledem ke kontrolní skupině pacientek [22].

Na základě výše zmíněných skutečností můžeme tvrdit, že MMP-26 spolu s MMP-9 a TIMP-4 tvoří důležitou složku v procesu implantace embrya na pozadí imunologického procesu decidualizace. MMP-26 je spolu s TIMP-4 vhodným kandidátem na potenciální biomarkery receptivity endometria.

PROCES DECIDUALIZACE ENDOMETRIA REGULUJE PRŮBĚH IMPLANTACE EMBRYA

Proces implantace je v mnohém podobný karcinogenezi. Dochází k destrukci endometriálních epiteliálních buněk implantujícím embryem, enzymatickému narušení matrix stromatu a nakonec k invazi maternální deciduy a vnitřního myometria. Invaze semialogenního fetálního trofoblastu je tolerována i kontrolována deciduální reakcí [35]. Nekontrolovatelná invaze trofoblastu do endometria může způsobit v případě nadměrné invaze klinicky manifestovanou placentu accreta nebo v případě neadekvátní invaze ohrozit plod a způsobit řadu těhotenských komplikací, jako je například intrauterinní růstová restrikce, preeklampsie nebo potrat v raném i pozdním stadiu gravidity [35]. Bylo zjištěno, že proces decidualizace začíná explozí volných radikálů pomocí aktivace signalizační dráhy NADPH oxidázy 4 (NOX-4) [37]. Signály dráhy NAD(P)H oxidázy 4 (NOX-4) jsou spouštěčem exprese dalších genů decidualizace s cílem zajistit optimální receptivitu endometria pro úspěšnou implantaci embrya. Samotný proces decidualizace je založen na základě prozánětlivé odpovědi kontrolované nejen progesteronem, ale také signalizační dráhou protein-kinázy A (PKA) a produkcí cyklického adenozin-monofosfátu (cAMP) [11].

Podstatou decidualizace je vytvoření lokálního edému, koncentrace a proliferace uterinních natural killer (uNK) buněk s následnou extenzivní remodelací hESC specializované deciduální buňky, které koordinují jak nidaci embrya, tak i samotné vytváření placenty [11, 44]. Deciduální buňky a buňky trofoblastu embrya mezi sebou aktivně signalizují jednak na bázi chemotaxe prostřednictvím různých cytokinů, ale také pomocí exozomů, což jsou nano-vezikuly o průměru 40–150 mm. Ty obsahují různé signalizační molekuly jak solubilní, tak i membránově vázané [14]. Velmi důležitou úlohu ve správné signalizaci s nidovaným embryem sehrávají uterinní natural killer buňky (uNK) (obr. 1), které se odlišují od periferních NK buněk na základě přítomnosti dvou povrchových antigenů CD56+ a CD16+ [40]. Tyto uNK buňky produkují velké množství různých signalizačních molekul (leukémie inhibující faktor – LIF, TNF-α, INF-γ, interleukin IL-1β, GM-CSF, TGF-β1, inhibitory metaloproteináz – TIMP-1,TIMP-2,VEGF aj.) důležitých pro správný vývoj nidovaného embrya a zaručují, že embryo bude obklopeno převahou kompetentních deciduálních buněk [4, 5, 40]. Tato selektivní likvidace senescentních deciduálních buněk umožní vznik již zmíněné imuno-privilegované deciduální matrix. V těhotenství uNK buňky exprimují senescentní markery a jsou spíše proangiogenní než cytotoxické [36], což napomáhá vaskularizaci v oblasti nidovaného embrya a následně také i přísunu živin pro další vývoj nidovaného embrya [36]. V průběhu decidualizace spouští akutní senescence subpopulace hESC buněk několikastupňový proces, jehož cílem je transformace cyklujícího endometria v gestační tkáň.

Deciduální buňky jsou tak schopny na základě vzájemné signalizace upravit migrační aktivitu vzhledem k implantujícímu embryu a jeho kvalitě. Tyto buňky ale nedokážou rozlišit mezi normálním a abnormálním embryem u pacientek s opakovaným potrácením [41]. Tato implantační kompetence endometria je závislá od schopnosti IL-15 aktivovaných uNK buněk selektivně likvidovat senescentní deciduální buňky prostřednictvím exocytózy cytotoxických granulí v luteální fázi cyklu. Pokud v endometriu není přítomna žádná další patologie, tak by při zajištění funkčnosti tohoto mechanismu měl být reprodukční potenciál endometria maximální [4]. Proliferace hESC buněk je zajištěna kombinací signálních molekul, mezi něž patří heparin-vázající EGF-like růstový faktor (HB-EGF), LIF a interleukin IL-1β. Vedle proliferace je motilita hESC buněk zvýšena prostřednictvím CD82, který je známý metastatický supresor a ve značné míře je exprimován v deciduálních buňkách [12].

Komplexní remodelace endometria je kontrolována v čase jak proliferací hESC buněk a intenzitou senescence deciduálních buněk, tak i efektivitou jejich imunologické likvidace [4]. V diferencujících hESC buňkách je přítomen FOXO1, hlavní deciduální transkripční faktor zodpovědný za zástavu buněčného cyklu a indukci důležitých genů v procesu decidualizace, jako jsou prolaktin (PRL) a IGF-vázající protein 1 (IGFBP1). Exprese FOXO1 je regulována jak cAMP, tak i progesteronem [38]. FOXO1 byl také označen jako spouštěč senescence buněk ovariálního karcinomu, které byly ovlivňovány progesteronem [8]. Absencí FOXO1 v buňkách dochází také k omezení exprese IL-8, IL-6 a aktivity enzymu β-galaktosidázy asociovaného se senescencí (SAbG). SAbG je biomarker běžně používaný pro senescentní buňky, bohužel ale postrádá specificitu [25]. Právě při procesu decidualizace dochází paralelně ke stabilizaci p53 a zvýšené expresi p16, inhibitoru cyklin dependentní kinázy (CDK). Inhibice CDK vede k zastavení proliferace a buněčného cyklu [4]. Jako potenciální proteinové biomarkery receptivity endometria byly stanoveny lamin B1 (LMNB1), high mobility group box 2 (HMGB2), histone H2A variant macroH2A (mH2A), nucleosome linker histone H1 (H.H1 and trimethylated lysine 9 on histone H3 (H3K9Me3). Tato histonová varianta se vyskytuje ve formě heterochromatinu, která je přítomna v senescentních buňkách (SAHF) [4].

TRANSKRIPTOMICKÝ PODPIS RECEPTIVITY ENDOMETRIA

Jednou z možností, jak adekvátně definovat receptivitu endometria, je prostřednictvím charakterizace cyklických změn v endometriálním transkriptomu. Technologie DNA microarray je schopna simultánní analýzy transkriptomu u tisíců různých genů. Výsledky této transkriptomické analýzy dávají možnost charakterizace genové exprese na úrovni mRNA a vytvoření specifického profilu pro každý odebraný vzorek endometria [29].

Studie z roku 2004 Horcajadase a spol. zkoumala více než 12 000 genů pomocí DNA microarray technologie v období prereceptivním (LH peak + 2 dny) a receptivním (LH peak + 7 dnů) z bioptických vzorků lidského endometria [17]. Nalezeno bylo od 90 do 323 pozitivně regulovaných genů a 46–377 negativně regulovaných genů v receptivní fázi. Pouze u tří genů [osteopontin (stukturní protein), apolipoprotein D (transportér) a Dickkopf/DKK1 (signalizace)] byla data konzistentní mezi jednotlivými studiemi. Nicméně Diaz-Gimeno et al. [7] zavedli v roce 2011 diagnostický test ERA (endometrial receptivity array) zahrnující 238 kandidátních genů. Z nich 134 je transkripčně definováno. Cílem ERA testu je tzv. datování a patologická klasifikace endometria. Limitací testu je nutnost odběru bio­psie a s tím spojená invazivita výkonu společně s potenciální variabilitou genové exprese způsobené odběrem malého vzorku endometriální tkáně v určité lokální oblasti, která nemusí nutně poukazovat na celkový stav receptivity endometria. S vývojem technologií se naskytla další alternativa diagnostiky receptivity endometria pomocí proteomických technik a analýz endometriálního sekretomu nebo cervikálního hlenu.

PROTEOMICKÉ PŘÍSTUPY V DIAGNOSTICE RECEPTIVITY ENDOMETRIA

Složení proteomu endometria je velmi komplexní a jeho analýza může být ovlivněna jak preanalytickou fází odběru vzorku, tak i post-translačními modifikacemi analyzovaných proteinů [2]. Hlavní komponenty endometriálního sekretomu jsou cytokiny, močovina, glukóza, aminokyseliny, metaloproteinázy a jejich inhibitory, imunoglobuliny, muciny, α-1 antitrypsin prekurzor, haptoglobulin, transferrin a další proteiny [1, 31]. Některé z proteinů mohou sloužit jako biomarkery pro stanovení receptivity endometria (tab. 1). Komplexní profil proteomických biomarkerů nabízí techniky diferenční gelové elektroforézy (DIGE), multiplex imunoassay či hmotnostní spektrometrie (MS) z různých typů vzorků.

Vzorek pro proteomickou analýzu může být získán buď přímo z endometria biopsií [9], laváží, nebo odběrem endometriálního sektretu [3]. Laváží je možno získat až desetkrát více proteinů než aspirací díky uvolnění dalších proteinů z glykokalyxu endometria. Alternativní metodou je získání vzorku z cervikálního hlenu [13] nebo cervikální zátky [24]. Výhodou odběru cervikálního hlenu je neinvazivní přístup. Podle Boomsma 2010 nebyl odběr endometriálního sekretu katétrem pro embryotransfer doprovázen snížením implantation rate [3]. S příchodem vysoce výkonné high-through­put tandemové hmotnostní spektrometrie (MS) začalo být možné kvantifikovat z jednoho vzorku jeho komplexní proteomické složení. V roce 2009 Dominguez et al. porovnali vzorky receptivního a nereceptivního endometria pomocí DIGE. Kandidátní skupiny proteinů byly poté z gelu vyjmuty a analyzovány pomocí MALDI-MS. Výsledky studie označily stathmin-1 a annexin A2 jako rozdílně regulované proteiny a potenciální proteinové biomarkery [9].

Počátky proteomických studií endometria se datují do šedesátých let minulého století, kdy se jako hlavní metoda používala imunodifuze a reakce se specifickými protilátkami proti hledanému proteinu [10]. Výsledky první komplexní proteomické studie naznačily, že glycodelin na rozdíl od leukémii inhibujícího faktoru (LIF) koreluje s histologickým nálezem maturace endometria. Zatím jedna z největších studií zahrnovala vzorky endometriálního sektretu odebraného před embryotransferem u 210 IVF pacientek. Výsledky proteomické analýzy pomocí multiplex immunoassay odhalily dalších 17 potenciálních regulátorů implantace, interleukiny 1-β, 5, 6, 10, 12, 15, 17 a 18, TNF-α, INF-γ, eotaxin, VEGF, Dickkopf homolog 1, heparin-vázající epidermální růstový faktor (HB-EGF), INF-γ indukující 10 kd protein (IP-10), monocyt chemoatraktant protein (MCP-1), macrophage migration inhibitory factor. Hlavními markery byly stanoveny IL 1-β a TNF-α [15]. Pomocí DIGE Chen et al., definovali 196 proteinů, které jsou odlišně produkovány endometriem v proliferační a sekreční fázi. Bohužel většina proteinů nebyla ve shodě s daty získanými na základě genetických analýz. Pouze šest proteinů se shodovalo s proteomickými daty [19]. Za příčinu neshody byla označena lokální variace exprese vyšetřovaných genů, protože biopsie reprezentuje pouze 2–4 % povrchu epitelu. Rozdíly mohly být dále způsobeny heterogenitou odebrané endometriální tkáně (epiteliální, stromální buňky, žlázy, komponenty vaskularizace apod.), která ve výsledku exprimuje různé proteomické profily [19]. Naproti tomu odběr a analýza endometriálního sekretu nebo cervikálního hlenu je méně invazivní alternativou než biopsie a je schopna poskytnout komplexní obraz receptivity endometria díky technikám, jako je hmotnostní spektrometrie.

ZÁVĚR

Receptivita endometria může dnes být hodnocena jak konvenční analýzou transkriptomu pomocí ERA systému, tak i proteomickou analýzou endometriálního sekretomu nebo cervikálního hlenu prostřednictvím hmotnostní spektrometrie. Vzhledem k nejnovějším poznatkům v oblasti fyziologie endometria by bylo vhodné se zaměřit na bližší výzkum biomarkerů účastnících se regulace imunitní odpovědi na úrovni deciduy, signalizace uNK buněk a komunikace mezi buňkami trofo­blastu embrya a stromálními buňkami endometria. Kandidátní biomarkery by mohly sloužit jako podklad pro klinickou aplikaci nové alternativní diagnostické metody receptivity endometria.

Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. NV-08-00291.

Veškerá práva podle předpisů na ochranu duševního vlastnictví jsou vyhrazena.

Zkratky

ATR3 – activating transcription factor 3

CD82 – cluster of diferenciation 82

CDK – cyklin dependentní kinázy

DIGE – diferenční gelová elektroforéza

ECM – extracelulární matrix

ERA – endometrial receptivity array

GM-CSF – granulocyte-macrophage colony stimulating factor

H.H1 – nucleosome linker histone H1

H3K9me3 – trimethylated lysine 9 on histone H3

HB-EGF – heparin-vázající EGF-like růstový faktor

hCG – lidský chorionový gonadotropin

hEEC – lidské epiteliální buňky endometria

hESC – lidské stromální buňky endometria

HMGB2 – high mobility group box 2

HOXA-10 – homeobox a 10

IGFBP1 – IGF-vázající protein 1 (gen)

IL – interleukin (obecně)

INF-γ – interferon gamma

IP10 – INF-γ indukující 10 kd protein

IVF – in vitro fertilizace

LIF – leukémie inhibující faktor

LMNB1 – lamin B1

MALDI (MS) – matrix-assisted laser desorption/ionization MS

MCP-1 – monocyt chemoatraktant protein

mH2A – histone H2A variant macroH2A

MMP – matrix metaloproteináza (obecně)

MS – mass spectrometry

NOX-4 - NAD(P)H oxidáza 4

p16 – tumour suppresor protein p16 (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)

p53 – tumour suppresor protein p53 (transformation-related protein 53)

PG – prostaglandiny

PRL – prolaktin (gen)

RIF – repeated implantation failure (opakované potrácení)

S100A10 – S100 calcium-binding protein A10 (p11)

SAbG – senescence-associated b-galactosidase

SAHF – senescence-associated heterochromatin formation

SUMO1 – small ubiquitin-like modifier 1

TIMP – tkáňový inhibitor MMP

TNF-α – tumor necrosis factor alpha

uNK – uterine natural killer

VEGF – vascular endothelial growth factor

WOI – window of implantation (implantační okno)

Mgr. Michal Dvořan

Porodnicko-gynekologická klinika

FN a LF UP

I. P. Pavlova 6

779 00 Olomouc

e-mail: michal.dvoran@fnol.cz