Zkrácený referát: Imunogenetické a hormonální predispoziční markery systémových revmatických onemocnění, zejména systémového lupusu erythematodu

Souhrn

Úvod:
V multifaktoriální etiopatogenezi systémových revmatických chorob je nezbytná genetická vnímavost. PRL je účinný imunomodulátor, který podporuje rozvoj autoimunity. 

Cíle práce:
1. Zjistit imunogenetický background, HLA II. a I. třídy a alely mikrosatelitového polymorfismu transmembránové části exonu 5 genu MIC-A (dále MIC-A), u SLE a PsA. 2. Zjistit, zda PRL v séru a synoviální tekutině ovlivňuje klinický a laboratorní průběh RA. 3. Zjistit, zda se funkční polymorfismus -1149 G/T SNP mimohypofyzárního promotoru PRL genu podílí na rozvoji a fenotypu SLE, RA, PsA, SSc a zánětlivých myopatií. 

Metodika:
Genetické analýzy u souborů nemocných se SLE (n = 156), RA (n = 173), PsA (n = 100), SSc (n = 75), PM (n = 47) a DM (n = 68) a 123 zdravých jedinců: PCR-SSP (HLA I. a II. třídy), PCR-fragmentační analýza (MIC-A) a PCR-RFLP (-1149 G/T SNP PRL). Detekce PRL v séru a synoviální tekutině u 29 RA a 26 OA pomocí radioimunometrické analýzy. 

Výsledky:
1. Rizikové imunogenetické markery SLE v české populaci jsou alela HLA-DRB1*03 (pc = 0,008; OR 2,5) a haplotyp HLA-DRB1 *03-DQB1*0201 (pc <0,001; OR 4,54). Frekvence MIC-A5.1 je vyšší u SLE než u zdravých (pc =0,005; OR 1,88). MIC-A5.1 spolu s HLA-DRB1*03 výrazně zvyšuje riziko SLE, pc <0,000001; OR 9,71. Alela HLA-Cw*0602 je častější u PsA s psoriázou I. typu než u zdravých, pc <0,05; OR 3,33, 2. V séru i synoviální tekutině jsou hladiny PRL vyšší u RA (299,55 ± 27,28 a 338,85 ± 33,49 mIU/l) než u OA, 230,59 ± 16,61 a 245,97 ± 21,88 mIU/l, obě p<0,05. Hladiny synoviálního PRL korelují s DAS-28, p=0,010 a sérový PRL s tíží rentgenového postižení, p=0,014. 3. GT genotyp -1149 G/T SNP PRL se vyskytuje signifikantně častěji u nemocných s RA než u zdravých jedinců, pc =0,039; OR 1,82. Genotyp GG je signifikantně častější u SLE se začátkem choroby mezi 21.-40. rokem v porovnání s ostatními, pc =0,023; OR 2,94. Obdobně je genotyp TT vzácný u SSc nemocných se začátkem choroby po 45. roce (4,1 %) na rozdíl od nemocných se začátkem před 45. rokem (25 %), pc = 0,02; OR 0,13. 

Závěr:
Tato práce je první imunogenetickou studií u dvou závažných revmatických chorob, SLE a PsA, v české populaci. Zjistili jsme, že alela MIC-A5.1 výrazně zvyšuje riziko SLE u HLA-DRB1*03 pozitivních osob. U PsA s psoriázou I. typu jsme potvrdili rizikovou alelu HLA-Cw*0602. PRL ovlivňuje průběh systémových revmatických onemocnění - u RA reflektuje aktivitu a tíží onemocnění, distribuce genotypů -1149 G/T SNP PRL se liší kvůli závislosti na věku objevení se SLE a SSc. 

Klíčová slova:
systémový lupus erythematodes, psoriatická artritida, polymorfismus, alela, gen, prolaktin

1. ÚVOD

Systémová revmatická onemocnění jsou skupinou chorob se společným rysem v patogenezi – komplexní poruše imunitních mechanismů včetně porušení tolerance vlastních antigenů. Etiopatogeneza systémových revmatických onemocnění je široká, podílí se na ní genetická predispozice a působení faktorů, jako jsou hladiny pohlavních hormonů, infekce a stres. Podíl genetické vnímavosti na rozvoji onemocnění je u různých chorob různý, ale nezbytný. Samotný rozvoj onemocnění je několikastupňový proces a porucha regulace v imunitní odpovědi může nastat v kterékoliv fázi imunitní odpovědi. K závažným systémovým revmatickým onemocněním patří systémový lupus erythematodes (SLE), revmatoidní artritida (RA), psoriatická artritida (PsA), systémová sklerodermie (SSc) a zánětlivé myopatie – polymyositida (PM) a dermatomyositida (DM).

1.1 Genetická rizika a autoimunitních onemocnění

Genetika autoimunitních onemocnění vykazuje několik specifik. Autoimunitní choroby jsou, až na výjimky, polygenní a nevykazují klasickou mendelovskou dědičnost. I přesto se ale autoimunity vyskytují častěji v postižených rodinách. Agregace onemocnění v rodině je dána konstantou lambda (λs), která určuje poměr mezi prevalencí choroby mezi příbuznými postiženého jedince k prevalenci v běžné populaci, λs ≥ 5 znamená signifikantní spolupodíl genetických faktorů na rozvoj onemocnění. V rámci autoimunitních onemocnění se λs liší u jednotlivých onemocnění - λs u SLE je 30 (1, 2), u psoriázy (PV) 4-11, u PsA 27-47 (3), a pouze 5-10 u RA (4).

Hlavní rizikovou „autoimunitní“ lokalitou je oblast na krátkém raménku chromozomu 6, 6p21.3-22,2 (1, 3, 4). Obsahuje soubor genů hlavního histokompatibilního komplexu (MHC), včetně genů HLA (human leukocyte antigens) I. a II. třídy, neklasické HLA-geny, jako jsou geny MIC (MHC- class I related chain ) a geny spojené se zpracováním peptidu molekul HLA I. třídy, TAP 1, 2 (ATP-binding cassette transporter). HLA oblast je vysoce polymorfní, s vazebnou nerovnováhou mezi jednotlivými alelami a populačními odlišnostmi v rozložení alel a haplotypů (5). Úlohou HLA molekul je prezentace antigenů a polymorfismy v oblasti vazebných míst tuto jejich schopnost určují (6-10).

Geny MIC (-A, B, C, D, E, F a G) jsou uloženy 46.4 kb směrem k centromeře od HLA-B lokusu. Geny MIC-A a B jsou přepisovány do peptidu, MIC-C-G jsou pseudogeny. Oblast MIC-A i B je, obdobně jako HLA I. a II. třídy, vysoce polymorfní a prozatím bylo identifikováno 73 alel MIC-A. Produkt genu MIC-A je polypeptid složený ze tří domén – extracelulární (α1, α2, α3), transmembránové a cytoplasmatické. Polymorfismy v oblasti extracelulárních domén (exony 2.-4.) udávají variabilitu vazebného místa pro NKG2D receptor; rozlišují se alely s vysokou a nízkou afinitou (11). Mikrosatelitový polymorfismus s opakováním tripletu [GCT]_n v transmembránové části MIC-A (5. exonu) určuje 8 alel: MIC-A4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 a MIC-A5.1 (12). Některé MIC-A alely jsou shodné v extracelulární části, ale liší se v transmembránových alelách, na druhou stranu mezi některými extracelulárními a transmembránovými alelami existuje vazebná nerovnováha.

1.2 Hormonální změny a autoimunita

Autoimunitní onemocnění se vyskytují častěji u žen, u SLE až 9x častěji než u mužů, u ostatních je rozdíl méně výrazný (SSc 4-6:1, RA 4:1, zánětlivých myopatií 3:1) a v případě PsA je poměr vyrovnán (13). Tento rozdíl je dán vlivem estrogenů a prolaktinu (PRL) na imunitní systém. PRL je cirkulující hormon uvolňovaný z adenohypofýzy, ale i účinný cytokin: podporuje vyzrávání a proliferaci T, B lymfocytů a NK buněk a diferenciaci monocytů (14,15). V periferních mononukleárních buňkách PRL zvyšuje produkci interleukinů (IL)-2, IL-12, IL-1β, interferonu(IFN)-γ a tumor nekrotizujícího faktoru (TNF)-α (15,16). Imunostimulační aktivita PRL je částečně závislá na jeho syntéze v imunitních buňkách (15), kde je exprese PRL řízena odlišně od adenohypofýzy. Transkripce PRL genu (6p22.2) (13) začíná v adenohypofýze exonem 1 a v mimohypofyzárních lokalitách předsunutým exonem 1A (17). Před exonem 1A je 3000 bp rozsáhlá regulační oblast (18) obsahující v GATA sekvenci funkční jednonukleotidový polymorfismus (SNP), -1149 G/T, kdy alela G vede k vyšší produkci mRNA v lymfocytech.

2. HYPOTÉZY A CÍLE PRÁCE

• I Genetická predispozice je nezbytná pro rozvoj SLE. Geny MHC, hlavní rizikové SLE oblasti, vykazují výraznou populační variabilitu. Mikrosatelitový polymorfismus v transmembránové části genu MIC-A určuje schopnosti této molekuly reagovat na infekční podněty. Gen MIC-A je lokalizován v blízkosti HLA I. a II. třídy a mezi jednotlivými alelami mohou vznikat genové vazby a vytvářet rizikové SLE haplotypy.
• II Genetická predispozice a stres jsou podstatnými faktory v rozvoji PsA. MIC-A peptid je exprimován pod vlivem buněčného stresu a je rozpoznáván NKG2D receptorem NK buněk. Alely mikrosatelitového polymorfismu exonu 5 genu MIC-A jsou ve vazbě s alelami kódující extracelulární část. Mikrosatelitový polymorfismus exonu 5 genu MIC-A může být rizikovou oblastí pro PsA. Alely MIC-A a HLA I. třídy se mohou navzájem potencovat v riziku anebo být ve vazebné nerovnováze.
• III PRL je prozánětlivý cytokin a imunomodulátor syntetizovaný v imunitních buňkách. U RA se PRL v synoviální tekutině může podílet na přetrvávání a progresi choroby. Abnormální množství PRL může ovlivnit imunitní homeostázu. Exprese PRL v lymfocytech je regulována alternativním promotorem PRL genu, který v GATA sekvenci obsahuje funkční jednonukleotidový polymorfismus, -1149 G/T SNP, jehož G alela vede k vyšší produkci PRL a může být jedním z rizik pro rozvoj autoimunity. Vzhledem k blízkosti PRL genu ke genům MHC komplexu může být i součástí rizikových haplotypů.

Cíle práce

• a) Zjistit imunogenetický background, polymorfismy v HLA II. a I. třídy, u SLE a PsA v české populaci.
• b) Detekovat alely mikrosatelitového polymorfismu v transmembránové části genu MIC-A u nemocných se SLE a PsA a zjistit jejich podíl na vzniku onemocnění.
• c) Stanovit hladinu PRL v séru a synoviální tekutině u nemocných s RA a zjistit, zda ovlivňuje klinický a laboratorní průběh onemocnění.
• d) Detekovat funkční jednonukleotidový polymorfismus -1149 G/T PRL genu u SLE, RA, PsA, SSc, PM a DM a zjistit, zda se podílí na rozvoji a fenotypu onemocnění.

3. PACIENTI A METODIKA

Soubor pacientů: V rámci probíhajících výzkumných projektů na Revmatologickém ústavu v Praze bylo testováno: SLE (n=156), RA (n=173), PsA (n=100), SSc (n=75), PM (n=47) a DM (n=68) a 123 zdravých dobrovolníků. Stanovení hladin PRL v séru a synoviální tekutině bylo u 29 s RA a 26 s osteoartrózou (OA). Všichni jedinci podepsali informovaný souhlas.

Genetické analýzy: Detekce HLA I. a II. třídy: polymerázová řetězová reakce (PCR) se sekvenčně specifickými primery (Olerup SSP^TM, Genovision, Oslo, Norway).

Detekce mikrosatelitového polymorfismu exonu 5 MIC-A genu: PCR s analýzou fragmentů (206). Detekce PCR produktů elektroforetickou separací (Fragment analyzer v 1.02 software, Amersham Biosciences). Identifikace alel MIC-A4, A5, A5.1, A6 a A9 dle velikosti fragmentů (123bp, 126bp, 127bp, 129 bp a 139 bp).

Detekce -1149 G/T SNP mimohypofyzárního promotoru PRL genu: vlastní protokol PCR – RFLP; amplifikace 137 bp úseku mimohypofyzárního promotoru PRL genu s nově designovanými primery (forward: 5ę- GCAGGTCAAGATAACCTGGA-3ę, revers: 5ę- CATCTCAGAGTTGAATTTATTTCCTT-3ę). V reverzním primeru bylo vytvořeno artificiální místo pro restrikci ApoI endonukleázou, která byla použita pro RFLP.

Detekce PRL v séru a synoviální tekutině: Odběr synoviální tekutiny během terapeutické arthrocentézy, odběr krve následoval 1.- 5. den v dopoledních hodinách. Stanovení koncentrace PRL pomocí radioimunometrické metody (IRMA, Immunotech, Praha).

Statistické analýzy: Rozdíly v distribuci alel a genotypů byly analyzovány pomocí χ² testu nebo Fisherova exaktního testu. K statistickým analýzám byl použit Epi Info software (verze 3.3) a signifikance ustanovena P hodnotou <0,05 s Bonferroniho korekcí. OR hodnota byla stanovena pomocí Wolfovy metody s Haldanovou korekcí. Pro statistiku sérových hladin PRL byl použit program SPSS verze 17; byl použit studentův t-test (parametrické uspořádání dat) a Pearsonův korelační koeficient. Statistická signifikance byla hodnocena hodnotou P <0,05.

4. VÝSLEDKY

4.1 Imunogenetická analýza systémového lupusu erythematodu

Distribuci alel HLA-DRB1, HLA-DQB1 a MIC-A jsme testovali u 123 nemocných se SLE a 99 kontrol. Zjistili jsme signifikantní rozdíl v rozložení HLA-DRB1 p < 0,001 a HLA-DQB1 p < 0,005. U SLE je frekvence alel HLA-DRB1*03, *08 a *15 vyšší než u kontrolní skupiny (22,8 % vs. 10,6 %, 6,1 % vs. 2,0 % a 22,0 % vs. 14,7 %), pouze alela HLA-DRB1*03 udržela statistickou signifikanci, p_c = 0,008; OR 2,5 CI95% (1,44-4,27). Zjistili jsme vyšší frekvenci HLA-DQB1*0201, *0402 a *0602 alel u SLE v porovnání se zdravými (22,8 % vs. 10,6 %, 5,3 % vs. 1,5 % a 21,1 % vs. 13,1 %), pouze alela HLA-DQB1*0201 se statistickou signifikanci, p_c = 0,01; OR 2,5 CI95% (1,44-4,34). Frekvence HLA-DRB1*11 a HLA-DQB1*0301 je nižší u SLE než u kontrol, avšak bez statistické signifikace (viz graf 1 a graf 2).

Potvrdili jsme vazebnou nerovnováhu mezi HLA-DRB1*03-DQB1*0201, HLA-DRB1*08-DQB1*0402, HLA-DRB1*15-DQB1*0602 a HLA-DRB1*11-DQB1*0301 (p = 10^-5; p = 0,03; p = 10^-9; p = 10^-6). Haplotyp HLA-DRB1 *03-DQB1*0201 vyskytuje u 44,7 % SLE v porovnání s 15,2 % u zdravých, p_c <0,001; OR 4.54 (2,36-9,09).

Z alel mikrosatelitového polymorfismu exonu 5 MIC-A jsme detekovali: MIC-A4, A5, A5.1, A6 a A9. Zjistili jsme signifikantně vyšší frekvenci MIC-A5.1 u nemocných SLE (55,7 %) v porovnání se zdravými (39,9 %), p_c =0,005; OR 1,88 CI95%(1,29-2,77), kdežto MIC-A6 jen u 10,6 % SLE a u 19,7 % zdravých, p_c =0,035; OR 0,48 CI95%(0,28-0,82).

Vazbu mezi alelami HLA-DRB1 nebo HLA-DQB1 a alelami MIC-A jsme nezjistili. Kombinace MIC-A5.1 a HLA-DRB1*03 je však signifikantně častější u SLE (16,1 %) než u kontrol (2,0 %), p_c <0,000001; OR 9,71 CI95% (3,40-27,70), viz graf 3. Obdobně absence obou MIC-A6 a HLA-DRB1*11 je signifikantně častější u SLE, p_c =0,0003; OR 2,32 CI95% (1,47-3,70).

4.2 Imunogenetická analýza psoriatické artritidy

Distribuci alel HLA-Cw a MIC-A jsme testovali u 100 nemocných s PsA a 94 zdravých jedinců. Alela HLA-Cw*06 se objevuje častěji u nemocných s PsA v porovnání se zdravými jedinci, 36,0 % vs. 15,9 %, p_c <0,05; OR 2,56 CI95% (1,33-4,76). Tato asociace je dána primárně zvýšenou frekvencí alely HLA-Cw*0602 u nemocných s PsA, kteří mají psoriázu (PV) I. typu (33,4%), v porovnání se zdravými jedinci (10,0 %), p_c <0,05; OR 3,33 CI95% (1,44-7,69). U nemocných s PsA s PV II. typu jsme asociaci s alelou HLA-Cw*06 nezjistili.

Z alel mikrosatelitového polymorfismu transmembránové části genu MIC-A jsme detekovali 5 alel: MIC-A4, A5, A5.1, A6 a A9. Zjistili jsme vyšší frekvenci MIC-A9 u nemocných s PsA (46,0%), zvláště s PV II. typu (58,6%) v porovnání se zdravými jedinci (38,0 %), p_{(nekorigované)} = 0,05 a p_{(nekorigované)} = 0,017. Avšak po korekcích hodnoty p neudržely statistickou významnost (p_c = 0,250 a p_c = 0,085).

4.3 Analýza hladin prolaktinu v séru a synoviální tekutině u nemocných s revmatoidní artritidou

Detekce hladin PRL v séru a v synoviální tekutině byla provedena u 29 RA a 26 OA nemocných, u kterých byly vyloučeny všechny vlivy, které mohou ovlivňovat hladinu PRL.

U nemocných s RA jsme detekovali vyšší hladiny PRL jak v séru (299,55 ± 27,28 mIU/l), tak i v synoviální tekutině (338,85 ± 33,49 mIU/l) v porovnání s nemocnými s OA, 230,59 ± 16,61 a 245,97 ± 21,88 mIU/l, obě p <0,05. Hladina PRL v séru koreluje pozitivně s hladinou PRL v synoviální tekutině u obou onemocnění, RA (r=0,546, p=0,002) i OA (r=0,528, p=0,006).

Hladina PRL v synoviální tekutině byla signifikantně vyšší u RA nemocných s vysoce aktivní chorobou hodnocenou skórem DAS (disease-activity index) (DAS-28>5,1) v porovnání s nemocnými se střední a mírnou aktivitou (433,0 ± 62,5 mIU/l versus 318,3 ± 42,6 mIU/l). Obdobně hodnota DAS-28 signifikantně pozitivně koreluje s hladinou PRL v synoviální tekutině, r=0,485, p=0,010 (viz graf 5). Sérové hladiny PRL korelují signifikantně s tíží rentgenového postižení, hodnocenou podle Larsenova skóre, r=0,484, p=0,014, avšak s aktuální aktivitou choroby (DAS-28) však pouze nesignifikantně, (r=0,345, p=0,078).

4.4 Genetická analýza funkčního polymorfismu mimohypofyzárního promotoru PRL genu

Polymorfismus -1149 G/T SNP PRL genu byl sledován u nemocných se SLE (n=156), RA (n=173), PsA (n= 83), SSc (n=75), PM (n=47) a DM (n=68) a 123 zdravých jedinců.

GT genotyp je signifikantně častější u nemocných s RA (56,10 %) než u zdravých (41,50 %), p_c =0,039; OR1,82 CI95%(1,14-2,94). U dalších onemocnění jsme nezjistili rozdíl v rozložení alel a genotypů -1149 G/T SNP PRL genu. V případě SLE, se G alela vyskytuje u 63% nemocných s artritidou na rozdíl od nemocných bez artritidy (40%), p_c =0,0086; OR 2,56 CI95% (1,51-4,33). GG genotyp je signifikantně častější u SLE se začátkem choroby mezi 21. - 40. rokem (44,8 %) v porovnání s těmi, kdo onemocní dříve (15,8 %) anebo později (24,0 %), p_c =0,023; OR 2,94 CI95% (1,43-5,96). Neprokázali jsme žádnou asociaci mezi alelami nebo genotypy -1149 G/T SNP PRL genu a autoprotilátkovou aktivitou (anti-dsDNA, anti-Sm, anti-RNP, anti-SSA a anti-SSB). U SSc se genotyp TT se vyskytuje signifikantně méně často u nemocných se začátkem choroby po 45. roce (4,1 %) na rozdíl od nemocných se začátkem choroby v mladším věku (před 45. rokem, 25 %), p_c =0,02; OR 0,13 CI95% (0,02-0,69). U nemocných s PsA a zánětlivými myopatiemi není rozdíl v rozložení alel a genotypů v závislosti na jejich klinické nebo laboratorní charakteristice.

5. DISKUSE

Etiopatogeneze systémových revmatických onemocnění je multifaktoriální, podílí se na ní genetická predispozice a působení faktorů, jako jsou pohlavní hormony, infekce a stres. Tato práce je první imunogenetickou studií u SLE a PsA v české populaci. Sleduje také roli PRL u revmatických onemocnění – SLE, RA, PsA, SSc a zánětlivých myopatií.

5.1 Genetická predispozice systémového lupusu erythematodu

Genetická predispozice je nezbytná pro rozvoj SLE. V české populaci u SLE jsme zjistili asociaci s HLA-DRB1*03 alelou (p_c =0,008, OR 2,5) a HLA-DRB1*03-DQB1*0201 haplotypem (p<0,0001, OR 4,54). V různých populacích byly jako SLE - rizikové haplotypy identifikovány: HLA-DRB1*03-DQB1*0201, HLA-DRB1*15-DQB1* 0602 a DRB1*08-DQB1*0402 (9, 10, 19, 20). V naší práci vyšší frekvence haplotypů HLA-DRB1*15-DQB1*0602 a HLA-DRB1*08-DQB1* 0402 u nemocných SLE ztratily statistickou významnost, což není v evropských populacích ojedinělý nález. Fernando M et al. prokázala asociaci s HLA-DRB1*03, ale frekvence HLA-DRB1*15 a DRB1*08 byly obdobné u SLE a zdravých (21). HLA-DRB1*15 nebyla zjištěna jako riziková u španělské a norské populace (20, 22) a na Islandu a Polsku nebyla dokonce prokázána žádná asociace ani s HLA-DRB1*03 ani HLA-DRB1*15 (23, 24). Alela HLA-DRB1*15 ( a přidružený haplotyp) a SLE se tedy ukazuje v populaci afroamerické, asijské (19, 25), ale jen v některých evropských (10, 19, 26). Naše studie prokázala, že frekvence alel v oblasti HLA II. třídy (HLA-DRB1 a DQB1) je obdobná v české a dalších evropských populacích – tento nález je poučný pro další genetické analýzy a léčebné strategie. Odlišné imunogenetické pozadí choroby může vést k zapojení jiných imunologických mechanismů a odlišné odpovědi na farmakologickou léčbu.

Alela MIC-A5.1 mikrosatelitového polymorfismu transmembránové části genu MIC-A se vyskytuje signifikantně častěji u SLE nemocných, což je v souladu s italskou (27) a španělskou prací (28). V naší práci jsme zjistli důležitý poznatek: přítomnost MIC-A5.1 alely dramaticky zvyšuje riziko vzniku SLE u HLA-DRB1*03 pozitivních jedinců (OR 1,88 u MIC-A5.1, OR 2.5 u HLA-DRB1*03 a OR 9,71 u kombinace MIC-A5.1- HLA-DRB1*03). Efekt aditivního efektu MIC-A5.1 u HLA-DRB1*03-DQB1*0201 pozitivních jedinců byl prokázán i u céliakie (29). Alela MIC-A5.1 se liší od ostatních MIC-A alel tím, že obsahuje inserci G nukleotidu mezi druhou a třetí repeticí trinukleotidového mikrosatelitového polymorfismu [GCT], což vytváří předčasný stop kodon a výsledný protein této alely má zkrácenou transmembránovou část a zcela mu chybí cytoplasmatická část (30). Molekuly MIC-A jsou exprimovány pod vlivem buněčného stresu anebo infekce a jsou rozpoznávány NKG2D receptorem NK buněk, receptory γ∂ T lymfocytů a CD8+ T lymfocytů (11). Zde můžeme vysledovat potenciální zapojení této molekuly do patogeneze SLE. Infekce cytomegalovirem (CMV) patří k potenciálním rizikům pro rozvoj a progresi SLE. CMV ovládá mechanismus, díky němuž může uniknout imunitnímu dozoru. Je to ovlivněním exprese MICA: fyziologicky je buňka infikovaná CMV označena pro cytotoxické reakce (expresí stresových molekul, včetně MIC-A). CMV však produkuje protein UL142, který proteolýzou degraduje molekuly MIC-A v transmembránové části. Tato část však zkrácené molekule MIC-A5.1 chybí a její exprese tedy není při CMV infekcí snížena (31). V patogenezi SLE může následná cytotoxická reakce vést ke zvýšené náloži autoantigenů a u HLA-DRB1*03 pozitivních jedinců ke snazšímu zpracování autoantigenů a rozvoji autoimunity. V naší práci jsme bohužel nezjistili asociaci mezi MIC-A5.1 a autoprotilátkovou aktivitou a další dvě práce tuto skutečnost nepopisují. Rozsáhlejší bádání je nezbytné k pochopení vzájemných vztahů mezi MIC-A5.1 a SLE.

Novým, doposud nepublikovaným nálezem, je protektivní vliv alely MIC-A6 na rozvoj SLE, který je potencován současnou absencí alely HLA-DRB1*11. Alela MIC-A6 je ve vazbě s extracelulární alelou *009 (32) s nízkou afinitu k NKG2D receptoru (11). Protekce MIC-A6 tak může být vysvětlena preferencí alel s vyšší vnímavostí k NKG2D receptoru, cytotoxicitě a zvýšené náloži autoantigenů.

Lze shrnout, že práce týkající se imunogenetické predispozice SLE prokázala silnou asociaci mezi onemocněním a haplotypem HLA-DRB1*03-DQB1*0201. U HLA-DRB1*03 pozitivních jedinců je navíc riziko výrazně zvýšeno přítomností alely MIC-A5.1. Alela MIC-A6 mikrosatelitového polymorfismu transmembránové části molekuly MIC-A je nově identifikovaným protektivním markerem SLE.

5.2 Genetická predispozice psoriatické artritidy

PsA se vyskytuje u 7–42 % pacientů s PV (33). V genetice PV bylo prozatím identifikováno dvanáct rizikových lokalizací (PSORS 1-12), avšak pouze jedna z nich, PSORS 1, je spojena s rozvojem PsA (34, 35). Riziková oblast PSORS 1 obsahuje geny HLA, MIC-A, TNF-α a další.

Imunogenetická analýza PsA byla v české populaci provedena poprvé. Zjistili jsme, že výskyt alel HLA I. třídy je rozdílný mezi nemocnými s PsA a zdravou českou populací. Tento rozdíl je dán zvýšenou frekvencí HLA-Cw*06 alel (36,0 %) u pacientů s PsA při porovnání se zdravými osobami (15,9 %, p_c <0,05, OR 2,56). Frekvence alel HLA-Cw v české populaci jsou obdobné jako u sousedních evropských národů (35).

Nejčastější alelou HLA-Cw*06 je Cw*0602, která je signifikantně spojena s PsA u nemocných s PV I. typu. HLA-Cw*0602 alela se vyskytuje u 50, nemocných s kožní formou PV a je spojena se závažnějším průběhem (6, 36, 37). Naopak, u PsA bývá frekvence HLA-Cw*06 alel a potažmo HLA-Cw*0602 nižší, v rozmezí 17 % - 40 % (37, 38). V Polsku byly u 58 % PsA nemocných zjištěny alely HLA-Cw*06, údaj o rozlišení jednotlivých alel chybí (35). Na druhou stranu, Grubić et al. v chorvatské práci neprokázali asociaci mezi HLA-Cw*06 a PsA (39).

V rozložení alel mikrosatelitového polymorfismu transmembránové části MIC-A genu jsme nezjistili rozdíl mezi PsA a zdravými jedinci, ani vazebnou nerovnováhu mezi alelami HLA-Cw a MIC-A. Na druhou stranu, alela MIC-A9 se vyskytovala častěji u nemocných s PsA II. typu v porovnání s kontrolami, tento nález je však po korekci nevýznamný (p_c = 0,085). Alela MIC-A9 byla popsána jako riziková – Gonzalez et al. zjistili vyšší frekvenci MIC-A9 u PsA nemocných s polyartikulárním postižením (37) a výsledky potvrdil i u 52 židovských PsA nemocných (40). V chorvatské populaci u 58 nemocných však byla zjištěna vyšší frekvence MIC-A4 a ne MIC-A9 (39). Rozdíly v těchto studiích a naší práci mohou být dány odlišnou populační distribucí HLA alel, neboť MIC-A9 byla prokázána ve vazebné nerovnováze HLA-B*5701 a B*3801 (40). Dalším možným problémem jsou relativně malé počty testovaných jedinců a nejednotná nomenklatura v klinickém popisu PsA.

Lze shrnout, že imunogenetická analýza provedená u nemocných s psoriatickou artritidou potvrdila roli HLA-Cw*0602 v rozvoji artritidy u psoriázy, přičemž závisí na věku, kdy se kožní projevy onemocnění objeví. V naší populaci není rozdíl mezi alelami mikrosatelitového polymorfismu v transmembránové části MIC-A u PsA ve srovnání se zdravými kontrolami.

5.3 Prolaktin a systémová revmatická onemocnění

Zjistili jsme vyšší hladiny PRL v séru i synoviální tekutině u RA. U RA se předchozí práce u sérového PRL lišily - prokazovaly hladiny PRL vyšší (40, 41), shodné (42, 43) i nižší (44). Tyto rozdíly mohou být dány různou aktivitou RA - při aktivním onemocnění jsou zvýšeny cytokiny, IL-6 a IL-1β, které stimulují uvolnění PRL z hypofýzy. Další příčinou může být rozdílná charakteristika pacientů - v naší studii jsme zjistili signifikantní pozitivní korelaci mezi sérovou hladinou PRL a tíží rentgenologického postižení. Hladiny PRL v synoviální tekutině jsou vyšší než ty sérové a korelují s hladinami sérového PRL u RA i OA. PRL se může do synoviální tekutiny přesunout ze systémového oběhu (45) anebo může být syntetizován lokálně. PRL v synoviální tekutině pozitivně koreluje s aktivitou choroby charakterizovanou skórem DAS-28. V synovii PRL podporuje proliferaci T, B lymfocytů (14, 15) a synoviálních fibroblastů a syntézu metaloproteinázy 3 (46) a cytokinů – IFN-γ, TNF-α, IL-1β IL-6 (16, 47). Sérový PRL, jehož hladiny jsou zvýšeny při vysoké klinické aktivitě, se může dostat do synoviální tekutiny, narušit tam lokální rovnováhu a vést k strukturálním změnám typických pro RA.

V genetických analýzách nemocných SLE, RA, PsA , SSc a zánětlivých myopatií jsme sledovali výskyt funkční alely G -1149G/T SNP PRL genu. U nemocných SLE jsme nezjistili rozdíl ve frekvencích alel ani genotypů v porovnání se zdravými jedinci, což je ve shodě s italskou (48) a mexickou (49) prací. Tento výsledek se liší se od práce Stevens et al., který popsal vyšší frekvenci alely G u SLE (50). V naší práci jsme zjistili signifikantní asociaci mezi alelou G a artritidou u SLE: vyšší produkce PRL imunitními buňkami lokálně může podpořit přežívání chondrocytů (51). Artritida se u SLE projevuje jinak než u RA – ačkoliv může dojít k deformitám, nedochází k destrukci chrupavky a erozi kosti. Genotyp GG je častější u SLE se vznikem onemocnění mezi 21. až 40. rokem a genotyp TT se vyskytuje signifikantně méně často u SSc s počátkem onemocnění po 45. roku. Faktor věku na rozvoji autoimunitních onemocnění má důležitou roli zejména v kontextu hladin pohlavních hormonů. Genotyp GG s vyšší syntézou PRL v imunitních buňkách u nemocných v reprodukčním období může být zesilujícím faktorem pro účinek PRL na imunitní reakce, zejména na zrání autoreaktivních B lymfocytů (52, 53). Z druhé strany na věku závislá genetická predispozice byla popsána i u jiných autoimunit, například alely HLA II. třídy anebo polymorfismus -607C/A promotoru IL-18 se liší mezi nemocnými s autoimunním diabetem, který se manifestuje v dětství anebo v časné dospělosti (54, 55). Výsledek u SSc je nutno chápat kriticky, nižší frekvence genotypů TT může skrývat častější přítomnost genotypů bohatých na alelu G, které ale nejsou prozatím identifikované pro malé počty testovaných nemocných. Czuwara-Ladykowska a kol. recentně zjistila, že lymfocyty SSc pacientů produkují mRNA prolaktinu (56) a proto jsou nezbytné další studie na úrovni PRL gen-mRNA-protein u této choroby a v závislosti na jejím průběhu. U RA nemocných jsme zjistili vyšší výskyt heterozygotů G/T. Recentní americká asociační studie na rozsáhlém souboru 3405 RA identifikovala genotyp TT jako protektivní (57). Tato diskrepance by mohla být vysvětlena vazebnou nerovnováhou s jiným genetickým markerem, která ale nebyla u této práce provedena. V naší práci jsme nezjistili genetické vazby mezi alelami -1149G/T SNP PRL genu a HLA I. třídy (HLACw) a HLA II. třídy (HLA-DRB1 a HLA-DQB1). Detekce dalších genetických markerů a sledování haplotypů je proto nezbytné.

Lze shrnout, že zvýšené hladiny prolaktinu v séru a synoviální tekutině ovlivňují klinický a rentgenologický průběh revmatoidní artritidy a reflektují zánětlivou aktivitu choroby. Frekvence alel a genotypů jednonukleotidového funkčního polymorfismu v oblasti promotoru PRL genu variují v závislosti na věku začátku onemocnění a klinické manifestaci systémového lupusu erythematodu a systémové sklerodermie, neprokázali jsme však asociaci mezi tímto polymorfismem a psoriatickou artritidou a zánětlivými myopatiemi.

6. ZÁVĚRY

• I V české populaci je u nemocných SLE signifikantně vyšší frekvence alel HLA-DRB1*03 a HLA-DQB1*0201 a haplotyp HLA-DRB1 *03-DQB1*0201 je rizikovým pro SLE. Alela MIC-A5.1 je rizikovou, kdežto alela MIC-A6 protektivní pro SLE. Přítomnost MIC-A5.1 zvyšuje riziko SLE u HLA-DRB1*03 pozitivních osob.
• II HLA-Cw*0602 je spojena s PsA, která se objevuje u nemocných s PV I. typu. MIC-A9 alela se vyskytuje častěji u nemocných s PsA, kteří trpí PV II. typu, avšak k potvrzení této asociace je nutné rozšíření studie.
• III Hladiny PRL v séru a synoviální tekutině u RA jsou vyšší v porovnání s OA a hladina PRL v séru koreluje pozitivně s hladinou PRL v synoviální tekutině. U aktivního onemocnění koreluje signifikantně pozitivně PRL v synoviální tekutině s DAS28 a sérový PRL s tíží rentgenového postižení.
• IV Genotyp GT mimohypofyzárního promotoru PRL genu se vyskytuje častěji u nemocných s RA. Alela G a genotyp GG -1149 G/T SNP jsou spojeny s artritidou u SLE a začátkem onemocnění ve věkové skupině 21-40. Na druhou stranu, TT genotyp se objevuje signifikantně méně často u nemocných se SSc s manifestací choroby po 45. roku života.

Tato práce vznikla díky výzkumnému záměru MZ000023728 a grantu MZ ČR IGA-NS-10618

MUDr. Markéta Fojtíková, PhD.

Revmatologický ústav

Na Slupi 4

128 50 Praha 2