Štúdium lokálnych anestetík
Časť 191: Využitie umelých neurónových sietí pri štúdiu korelácií medzi vypočítanými a nameranými hodnotami retenčných faktorov k v rôznych separačných systémoch v skupine bázických esterov alkoxysubstituovanej kyseliny fen

Česká verzia English info

Studies of local anaesthetics
Part 191 – Utilization of artificial neural networks in the study of correlations between the calculated and measured values of retention factors k in various separation systems in the group of basic esters of alkoxy-substituted phenylcarbamic acid

Artificial neural networks (ANN) were utilized to predict the HPLC retention factor k of a group of basic esters of alkoxyphenyl-substituted phenylcarbamic acid. Very good results were obtained in the prediction of three investigated systems: phenyl column, acetonitrile/water mobile phase (retention factor kPhAc), phenyl column, methanol/water mobile phase (retention factor kPhMe), and C18 column, acetonitrile/water mobile phase (retention factor kC18Ac), which are expressed by the dependences of the retention factor predicted vs. the retention factor experimentally measured. The intercepts and the slopes of the obtained dependences were close to 0 and 1, respectively. The results for the system C18 column, methanol/water mobile phase were not sufficiently suitable for the k prediction.

Key words:
local anaesthetics – prediction of HPLC retention factor – artificial neural networks

Autoři: T. Ďurčeková ¹; K. Boronová ¹; J. Lehotay ²; J. Mocák ¹; J. Čižmárik ³; N. Denderz ²
Působiště autorů: Univerzita sv. Cyrila a Metoda v Trnave, Fakulta prírodných vied, Katedra chémie ¹; Slovenská technická univerzita v Bratislave, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Ústav analytickej chémie ²; Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie ³
Vyšlo v časopise: Čes. slov. Farm., 2010; 59, 205-209
Kategorie: Původní práce

Souhrn

V skupine bázických esterov alkoxysubstituovanej kyseliny fenylkarbámovej sa využili umelé neurónové siete (ANN – artificial neural network) na predikciu HPLC retenčného faktora k. Veľmi dobré výsledky predikcie sa získali pre tri vyšetrované systémy: fenylová kolóna, mobilná fáza acetonitril/voda (retenčný faktor kPhAc), fenylová kolóna, mobilná fáza metanol/voda (retenčný faktor kPhMe) a C18 kolóna, mobilná fáza acetonitril/voda (retenčný faktor kC18Ac), ktoré sú vyjadrené závislosťami predikovaného retenčného faktora voči experimentálne nameranému. Úseky, ako aj smernice týchto zistených závislostí sa blížia k 0, resp. k 1. Výsledky pre systém C18 kolóna, mobilná fáza metanol/voda (retenčný faktor kC18Me) na predpoveď k neboli veľmi vhodné.

Kľúčové slová:
lokálne anestetiká – predikcia HPLC retenčného faktora – umelé neurónové siete

Úvod

Termín umelé neurónové siete (ANN – artificial neural network) je daný historickým vývojom, keď vznik prvých umelých neurónových sieti bol inšpirovaný biologickými systémami. Existujú viaceré definície neurónovej siete. Jedna z nich, najvhodnejšia, je, že neurónová sieť je výpočtový model, zostavený na základe abstrakcie vlastností biologických nervových systémov. Základnou vlastnosťou umelých neurónových sietí je schopnosť abstrakcie, z ktorej vyplýva, že pravidlá určujúce vzťahy medzi vstupnými a výstupnými hodnotami prezentované vo vhodnej forme sú všeobecne aplikovateľné pre ktorýkoľvek skúmaný problém s príslušnými vstupnými hodnotami. Preto sa ANN využívajú vo výskume i v regulačnej technike v priemyslových aplikáciách.

Hlavným znakom neurónovej siete je jej štruktúra, t.j. vrstvy neurónov prepojených spojmi, po ktorých sa šíria signály. Jednou z najvýznamnejších vlastností neurónových sietí je, že dokážu univerzálne aproximovať funkcie ¹⁾, aj také, ktoré sú nelineárne a zložité.

Úlohou neurónových sietí je schopnosť spracovávať úlohy a adaptovať sa na zmenu vstupných hodnôt. Využitie ANN vychádza z ich základných vlastností: učia sa z predchádzajúcej skúsenosti metódou spätného šírenia chýb, sú schopné klasifikovať nelineárne separovateľné problémy a v spojitej oblasti hodnôt premenných sú univerzálnymi aproximátormi funkcií. Táto ich schopnosť sa v chemickej praxi využíva napr. na dizajnovanie štruktúry zlúčenín, cielené na ich potenciálne použitie ako liečiv ²⁾. Detailnejší opis fungovania neurónovej siete s rovnakými základnými vlastnosťami je uvedený v teoretickej časti našej práce ³⁾.

V skupine bázických esterov kyseliny fenylkarbámovej metóda umelých neurónových sietí bola dosiaľ aplikovaná v prácach^4–7), kde sa zistilo, že má potenciálne veľký význam v predikcii povrchovej a infiltračnej lokálnej anestézie.

Cieľom tejto práce je overiť a aplikovať tieto doterajšie poznatky v skupine ďalších, inak substituovaných bázických esterov kyseliny fenylkarbámovej a predikovať im prislúchajúce hodnoty retenčných faktorov k, ktoré sú dôležitým ukazovateľom lipofility lokálnych anestetík.

POKUSNÁ ČASŤ

V práci sa študovala séria zlúčenín patriacich do skupiny bázických esterov alkoxyfenylkarbámovej kyseliny, ktoré boli pripravené podľa prác ^{8, 9)}. Chemická štruktúra skúmaných esterov alkoxyfenylkarbámových kyselín je znázornená na obrázku 1.

**Obr. 1. Štruktúra študovaných derivátov alkoxyfenylkarbámových kyselín, n = 2 – 6 (dĺžka postranného reťazca)**

Na meranie hodnoty retenčného faktora HPLC metódou sa použila kolóna Separon^® SGX C18 a Separon^® SGX Phenyl; v obidvoch prípadoch bola veľkosť častíc 5 μm, dĺžka 15 cm, priemer 0,32 cm. Na meranie sa použili dve mobilné fázy, prvá obsahovala 50 % metanolu vo vode a druhá 60 % acetonitrilu vo vode, rýchlosť prietoku bola 1,0 ml/min, použitý diódový detektor meral v rozmedzí 210–290 nm. Návažok študovaných látok bol 1 mg/1 ml, dávkoval sa objem 20 μl. Retenčné faktory k boli získané pomocou nameraného retenčného času t_r a mŕtveho času t podľa všeobecne používaného vzťahu k = (t_r – t)/t.

Na modelovanie najlepšej neurónovej siete sa použil softvér Statistica 7.0 ¹⁰⁾. Ako vstupné premenné v neurónových sieťach sa použili tieto kontinuálne premenné: molová hmotnosť M, koeficienty lipofility log P v 9 rozličných formách (ALOGPs, ACLogP, miLogP, ALOGP, MLOGP, KOWWIN, XLOGP2, XLOGP3, AvlogP), koeficienty rozpustnosti log S v 3 rozličných formách (ALOGpS, ACLogS, AvlogS), na ktorých výpočet sa použil softvér ALOGPS, ver. 2.1 ¹¹⁾. Ďalej sa použilo 10 chemických posunov v ¹³C NMR (uhlíkov C1 až C6, C8, C10, C12 a ich priemer Call) a napokon 10 premenných¹H NMR (vodíkov H4 až H6, kvartérny qH, H10, po dve dvojice H11a a H11b, H12a a H12b a priemer všetkých Hall); všetky boli simulované softvérom ACDLabs, ver. 7.0 ¹²⁾. Z nich sa podľa korelačnej analýzy vybrali iba tie, ktoré významne korelovali s príslušným retenčným faktorom (keďže veľký počet premenných nepriaznivo ovplyvňuje výpočet neurónovej siete). Ako vstupné kategorické premenné sa použili: n (dĺžka postranného reťazca), Rtypen (typ substituenta R², 1 – A, 2 – P, 3 – PP, v tabuľke 1), Pno (poloha alkoxy-skupiny, 1-orto, 2‑meta). Cieľovými premennými (na výstupe ANN) boli retenčné faktory kPhAc, kPhMe, kC18Ac a kC18Me.

**Tab. 1. Základné charakteristiky študovaných látok**

Pri optimalizácii architektúry neurónových sietí sa použil trojvrstvový perceptrón zložený z (a) 13 vstupných, 2 skrytých a 1 výstupného neurónu pri predikcii kPhAc, (b) 16 vstupných, 3 skrytých a 1 výstupného neurónu pri predikcii kPhMe, (c) 19 vstupných, 2 skrytých a 1 výstupného neurónu pri predikcii kC18Ac. Predikcia retenčného faktora sa uskutočnila pre zlúčeniny náhodne rozdelené do tréningového (train), výberového (selection) a testovacieho (test) súboru. Rozdelenie zlúčenín do uvedených troch súborov bolo vykonané automaticky pomocou generátora náhodných čísel. Uskutočnilo sa bez vplyvu autorov v module softvéru Statistica, ktorý vykonáva výpočty umelých neurónových sietí. Najdôležitejšie výsledky neurónových sietí predstavujú predikcie retenčného faktora zlúčenín testovacieho súboru. Zlúčeniny zaradené do testovacieho súboru sú uvedené v tabuľke 2.

**Tab. 2. Namerané a predikované hodnoty retenčných faktorov kPhAc, kC18Ac, kPhMe pre zlúčeniny v testovacom súbore**

VÝSLEDKY A DISKUSIA

V doterajších prácach, ktoré boli venované vzťahom štruktúra – aktivita v skupine lokálno anestetických účinných bázických karbamátov, boli zistené súvislosti medzi lipo/hydrofilnou vyváženosťou molekuly a účinnosťou, niektorými elektrónovými deskriptormi a anestetickou účinnosťou, ako aj inými fyzikálnochemickými vlastnosťami a anestetickou účinnosťou. Z týchto štúdií vyplynula nutnosť pripravovať látky s vysokou lipofilitou a s alkoxysubstituentom umiestneným na benzénovom jadre. Predpoklady vysokej lokálnej anestetickej účinnosti uvedených látok sa potvrdili v práci ¹³⁾.

Pre štúdium derivátov kyseliny fenylkarbámovej z hľadiska potenciálneho farmaceutického využitia má zásadný význam povrchová anestetická aktivita A i infiltračná anestetická aktivita B, čo bolo publikované v prácach^{8, 9)}. Základné parametre študovaných látok sa uvádzajú v tabuľke 1. Ako cieľové premenné sa použili retenčné faktory opísané vyššie.

Metóda HPLC sa použila predovšetkým na modelovanie podmienok penetrácie uvedených látok k aktívnemu centru. Z tohto hľadiska sa využili dve stacionárne chemicky viazané fázy – C18 kolóna, kde sa predovšetkým uplatňujú nepolárne interakcie, a fenylová kolóna, kde prevažujú interakcie cez ð-ð komplexy. Mobilné fázy sa zvolili tak, že v prípade metanolu ide o donor H⁺ iónov a acetonitril je akceptorom H⁺. Takýmto modelovaním sa mohli preskúmať vplyvy, ktoré majú podstatný vplyv na penetráciu.

Výsledky sú znázornené formou grafu predikovaných hodnôt voči experimentálne zisteným hodnotám (obr. 2, 3 a 4). Úsek a smernica získaných regresných rovníc sa signifikantne nelíšili od 0 a 1, čo sú očakávané ideálne hodnoty. Vykonané t-testy, ktoré pre každú regresiu osobitne zisťovali významnosť hodnoty úseku aj smernice, príslušnú vypočítanú t-hodnotu porovnávali s kritickou hodnotou testu (pre 95 % pravdepodobnosť). Vo všetkých prípadoch bola potvrdená štatistická významnosť obidvoch regresných parametrov.

**Obr. 2. Priamka regresie pre kPhAc. Softvér STATISTICA 7, počet vstupných premenných: 13, počet skrytých neurónov: 2, počet výstupných neurónov: 1**

**Obr. 3. Priamka regresie pre kPhMe. Softvér STATISTICA 7, počet vstupných premenných: 16, počet skrytých neurónov: 3, počet výstupných neurónov: 1**

**Obr. 4. Priamka regresie pre kC18Ac. Softvér STATISTICA 7, počet vstupných premenných: 19, počet skrytých neurónov: 2, počet výstupných neurónov: 1**

Z analýzy chýb (porovnania predikovaných a experimentálnych retenčných faktorov) vyplýva, že (a) pre systém fenylová kolóna, mobilná fáza acetonitril/voda bola priemerná absolútna chyba 3,46 %, minimálna chyba -12,3 % a maximálna chyba je +5,18 %, (b) pre systém fenylová kolóna, mobilná fáza metanol/voda bola priemerná absolútna chyba 3,21 %, minimálna chyba -7,98 % a maximálna chyba +5,04 % a (c) pre systém C18 kolóna, mobilná fáza acetonitril/voda bola priemerná absolútna chyba 5,88 %, minimálna chyba -10,7 % a maximálna chyba +12,6 %. Tieto údaje sa získali z tabuľky 2, ktorá demonštruje konkrétne namerané a predikované hodnoty retenčných faktorov pre tri rozličné kombinácie stacionárnej a mobilnej fázy v HPLC derivátov kyseliny fenylkarbámovej. Uvedené údaje svedčia o veľmi dobrej predikčnej schopnosti použitej metódy.

Podľa citlivostnej analýzy (sensitivity analysis), ktorá sa uskutočnila po výpočte neurónovej siete, sa zistilo poradie významnosti vstupných premenných (a) pre systém fenylová kolóna, mobilná fáza acetonitril/voda: n, Rtypen, AClogS, M, Pno, C4, H5, XLOGP2, C3, Call, H11a, C6 a C10, (b) pre systém fenylová kolóna, mobilná fáza metanol/voda: n, Rtypen, ALOGPs, ALOGpS, C12, H12a, Pno, H5, C4, C6, M, C13C3, C5, C11, H12b a C10, (c) pre systém C18 kolóna, mobilná fáza acetonitril/voda: n, Rtypen, H12a, C12, C8, ALOGpS, C11, M, C3, C10, ALOGPs, C2, C6, H5, Call, Pno, H12b, qH a C4.

Na základe uvedených výsledkov možno konštatovať, že na predikciu hodnoty k uvedených látok je vhodné použiť umelé neurónové siete so vstupnými premennými, ktorých poradie dôležitosti je uvedené v predchádzajúcom odstavci. Aj keď poradie premenných pre rôzne podmienky separácie nie je rovnaké, v troch úspešne použitých HPLC systémoch sa vždy ako veľmi významné premenné prejavili n, Rtypen a sčasti aj Pno, ktoré priamo charakterizujú štruktúru, ale aj vhodné formy log P a log S charakterizujúce lipofilitu a rozpustnosť a tiež molová hmotnosť M. Z NMR premenných systémy s fenylovou kolónou najlepšie charakterizuje C4 (chemický posun na štvrtom uhlíku), zatiaľ čo C12 a C8 (chemické posuny na dvanástom resp. ôsmom uhlíku) sú charakteristické pre systémy s kolónou C18.

ZÁVERY

Predpoveď hodnôt retenčných faktorov, charakterizujúcich separáciu derivátov kyseliny fenylkarbámovej, ktoré vykazujú anestetickú aktivitu, bola veľmi uspokojivo vyriešená pre tri vyšetrované varianty chromatografických podmienok. Na predikciu sa využili optimalizované umelé neurónové siete, ktorých architektúra umožňuje spoľahlivé riešenie nelineárnych problémov, o aké išlo aj v tomto štúdiu. V tomto aspekte sa použitá metóda výpočtu diametrálne líši od mnohonásobnej lineárnej regresie, ktorá dokáže riešiť iba lineárne problémy ²⁾.

Autori ďakujú za podporu grantov VEGA (projekty 1/1005/09 a 1/1066/09), ako aj diplomantke S. Prachovej za pomoc pri výpočtoch.

Došlo 2. srpna 2010

Přijato 10. září 2010

Adresa pre korešpodenciu:

prof. Ing. Ján Mocák, DrSc.

Katedra chémie, Fakulta prírodných vied, Univerzita sv. Cyrila a Metoda

Nám. J. Herdu 2, 917 01 Trnava, Slovenská republika

e-mail: jan.mocak@ucm.sk

Zdroje

1. Sinčák, P., Andrejková, G.: Neurónové siete I. Košice: ELFA Press 1996.

2. Zupan, J., Gasteiger, J.: Neural networks in chemistry and drug design. 2nd ed. Weinheim: Wiley 1999.

3. Nemeček, P., Ďurčeková, T., Mocák, J., Waisser, K.: Chemometrical analysis of computed QSAR parameters and their use in biological activity prediction. Chem. Pap., 2009; 63, 84–91.

4. Hatrík, Š., Lehotay, J., Čižmárik, J.: Study of relationship between surface anaesthesia, and chromatographic properties of alkoxy esters of phenylcarbamic acids by neural network method. Part 1., Collect. Czech. Chem. Commun., 1995; 60, 960–965.

5. Hatrík, Š., Lehotay, J., Čižmárik J.: Neural network method, the tool for studying biological activity of compounds. Relationship between infiltration anaesthesia, coded structural information and chromatographic properties applied in homologous series of alkoxysubstituted esters of phenylcarbamic acids. Chem. Pap., 1995; 49, 149–154.

6. Hatrík, Š., Lehotay, J., Čižmárik J.: Possibility of anaesthetical activity prediction of N-(pyrrolidinyl) ethylesters of alkoxyphenylcarbamic acids. Collect. Czech. Chem. Commun., 1995; 60, 1410–1414.

7. Hroboňová, K., Hatrík, Š., Lehotay, J., Čižmárik J.: Study of local anestetics. Part 146. Correlation between local anaesthesia, coded structural information and chromatographic properties for homologous series of alkoxysubstituted esters of phenylcarbamic acid using neural network. Pharmazie, 1999; 54, 44–47.

8. Búčiová, Ľ., Borovanský A., Čižmárik, J., Csöllei J., Švec P., Kozlovský, J., Račanská, E., Beneš L.: Štúdium vplyvu obmien v spojovacom reťazci na biologickú aktivitu v skupine bázických fenylkarbamátov. Čes. a slov. Farm., 1987; 36, 339–344.

9. Búčiová, Ľ., Csöllei J., Borovanský A., Čižmárik, J., Račanská, E.: Príprava a účinnosť 1-etoxymetyl-2-(1-pyrolidinyl), 2-piperidíno- a 2-(1-perhydroazepinyl)--etylesterov kyseliny o- a m-alkoxyfenylkarbámovej. Čes. a slov. Farm. 1991; 40, 102–105.

10. Data Mining, Statistical Analysis, Software and Services (cit. 2010-01-05), http://www.statsoft.com/.

11. Virtual Computational Chemistry Laboratory (cit. 2010-01-05) http://www.vcclab.org/lab/alogps/.

12. ACD/LABs: (cit. 2010-01-05) http://www.acdlabs.com/home/.

13. Greksáková, O., Pešák, M., Čižmárik, J., Beneš, L., Borovanský, A.: Fyzikálno-chemické vlastnosti niektorých bázických esterov kyseliny 2-heptyloxyfenylkarbámovej. Čes. a slov. Farm., 1983; 32, 279–281.