Štúdium lokálnych anestetík: Časť 206*
Micelizácie vybraných kvartérnych amóniových solí odvodených od heptakaínu

Súhrn

Použitím absorpčnej spektroskopie UV/VIS s pyrénom bola preskúmaná micelizácia vybraných kvartérnych amóniových solí odvodených od heptakaínu (látky s pracovným označením H22, H26, H27, H29, H34, H37, H + Al a H + B) vo vodných prostrediach a derivát H34 v 3 mol/l etanolovom roztoku pri teplote 25 °C. V homologickom rade študovaných bromidov H22, H26, H27 a H29 hodnoty cmc exponenciálne závisia od počtu atómov uhlíka n_C v hydrofóbnom reťazci: ln (cmc) = –3,131–0,421n_C. Voľná Gibbsova energia prenosu jednej metylénovej skupiny alkylového reťazca z vodnej fázy do vnútra micely pri teplote 25 °C má hodnotu (–0,421 ± 0,034)RT.

Kľúčové slová:
heptakaín • kvartérne amóniové soli • kritická micelová koncentrácia • pyrén • sigmoidálna-Boltzmannova rovnica • alkohol

Úvod

Dlhoročným predmetom štúdia Katedry farmaceutickej chémie Farmaceutickej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave sú bázické estery substituovanej kyseliny fenylkarbámovej, ktoré preukazujú lokálne anestetickú, β-adrenolytickú, antiarytmickú, spazmolytickú, antivírusovú či antimikrobiálnu aktivitu¹⁾. Cieľom tohto výskumu bola a je syntéza takých derivátov, ktoré vykazovali silnú biologickú aktivitu, vysokú stabilitu a čo najmenšie nežiaduce účinky ako systémovú toxicitu či dráždivosť. Výsledkom tohto rozsiahlého štúdia bol výskum a vývoj štyroch nových originálnych potenciálnych liečiv, a to: pentakaíniumchloridu, heptakaíniumchloridu, karbizokaíniumchloridu ako lokálnych anestetík a látky H + B (heptakaíniumbenzylchloridu), ktorý okrem lokálnej anestézie vykazoval aj antiarytmické účinky.

Molekuly týchto derivátov májú amfifilnú povahu, kde charakteristický intermediárny, spojovací reťazec predstavuje karbamátová skupina –NH-COO- s najčastejšie dvojuhlíkovým reťazcom, ktorý môže byť cyklizovaný či vetvený. Hydrofóbnu časť tvorí substituované benzénové jadro. Hydrofilná polárna hlavička je prezentovaná kvartérnym dusíkom, ktorý môže byť súčasťou heterocyklu.

Výsledkom dvojakej povahy molekuly takýchto látok je, že už v nízkej koncentrácii v roztoku preukazujú dva významné a charakteristické typy správania sa: adsorpcia na medzipovrchoch a agregácia v roztoku. Vzniknuté koloidné agregáty sa nazývajú micely a v závislosti od tvaru amfifilnej látky a od jej koncentrácie v roztoku nadobúdajú rôzne podoby.

Akonáhle sa dosiahne kritická micelová koncentrácia (cmc), pri ktorej sa v roztoku začína formácie miciel, dochádza k mimoriadnym zmenám. Zo závislostí niektorých fyzikálno-chemických vlastností od koncentrácie amfifilnej látky je možné rozličnými metódami a postupmi stanoviť hodnotu cmc.

Hodnoty kritických micelových koncentrácií vybraných derivátov substituovanej kyseliny fenylkarbámovej sa determinujú využitím absorpčnej spektroskopie vo UV oblasti spektra pomocou molekuly pyrénu ako sondy.

Cieľom predloženej práce je štúdium agregačných vlastností roztokov vybraných kvartérnych amóniových solí odvodených od heptakaínu vo vodnom a pyrénovom prostredí pri teplote 25 °C.

Pokusná časť 

Študované látky

Vybrané kvartérne amóniové soli odvodené od heptakaínu boli zosyntetizované podľa práce Čižmárika a spol.^{2, 3)} sú uvedené v tabuľke (tab. 1). Všetky študované deriváty sú biele kryštalické látky. 

Chemikálie

Pyrén, puriss. p.a., pre fluorescenciu, ≥ 99,0 %, central CHEM; etanol UV, ~ 96 % (v/v), central CHEM; aqua purificata. 

Prístroje

Spektrofotometer Analytik Jena SPEKOL 1300 (Nemecko); teplomer VARIO THERM MAX; ultrazvukový kúpeľ Bandelin Sonorex (Nemecko).

Rozpustnosť vo vode

Látky H22, H26, H+Al a H+B boli vo vode ľahko rozpustné, bromidy H27, H29 mierne rozpustné, jodid H37 ťažko rozpustný, zatiaľ čo jodid H34 vo vode prakticky nerozpustný. Preto bola látka H34 študovaná v 3 mol/l etanolovom roztoku. V menej koncentrovaných etanolových prostrediach sa uvedený derivát vyzrážal. Pre uvedenie látky H37 do roztoku bol použitý ultrazvuk a zahrievanie do 40 °C opakovane.

Pracovný postup

Príprava pyrénového roztoku

Bol pripravený zásobný roztok pyrénu s c = 0,0012 mol/l rozpustením výpočtom zisteného množstva pyrénu v etanole UV (~ 96% (v/v)) pomocou ultrazvuku (15 min). Experimentálny 2 μmol/l pyrénový roztok sa získal zriedením zásobného roztoku nasledujúcim postupom v závislosti od objemu meraného roztoku vzorky: 5 μl pyrénového roztoku do 3 ml roztoku vzorky, 4,2 μl do 2,5 ml, resp. 3,3 μl do 2 ml meraného roztoku. Takto nízka koncentrácia etanolu vo vzorke nie je schopná ovplyvniť správanie sa surfaktantu v roztoku.

Príprava zásobných roztokov vzoriek

Zásobné roztoky študovaných látok sa pripravili rozpustením výpočtom stanoveného množstva látky vo vode. K meranému zásobnému roztoku sa pridal taký objem pyrénového zásobného roztoku, aby sa dosiahla 2 μmol/l koncentrácia pyrénu v roztoku vzorky. Postupným riedením zásobného roztoku látky boli pripravené roztoky s nižšími koncentráciami vo vhodne zvolených intervaloch a to takým spôsobom, aby sa zachovala koncentrácia pyrénu v meranom roztoku.

Absorpčné spektrum pyrénu

Pyrén preukazuje charakteristické absorpčné spektrum so silnými a slabými píkmi v UV oblasti spektra. Jeho UV spektrum v podstate vedie k určeniu cmc surfaktantu.

Absorpčné spektrum pyrénu ukazuje osem píkov silných (s) a slabých (w, angl. weak) pri 232^w, 242^s, 252^w, 260^w, 272^s, 308^w, 320^s a 336^s nm, ako je znázornené v grafu 1⁴⁾.

Výsledky a diskusia

Podľa pracovného postupu boli pripravené zásobné roztoky skúmaných derivátov vo vode i etanolový zásobný roztok pyrénu. Riedenia roztokov sa uskutočnili priamo v meranej kyvete. Pomocou spektrofotometra SPEKOL 1300 boli merané absorpčné spektrá látok v prítomnosti 2 μmol/l pyrénu v rozmedzí vlnových dĺžok 200–400 nm pri teplote 25 °C proti zodpovedajúcemu porovnávaciemu roztoku.

V absorpčných spektrách každého nariedeného roztoku študovanej látky sa sledovali nezastreté hlavné pyrénové píky pomocou komerčného programu WinASPECT a zaznamenávali sa im odpovedajúce hodnoty absorbancií pri daných vlnových dĺžkach.

Hodnoty kritických micelových koncentrácií boli stanovené zo závislostí A_tot od koncentrácie c látky v roztoku, ktorá vykazuje charakateristický sigmoidálny priebeh.

V absorpčných spektrách vybraných kvartérnych amóniových solí odvodených od heptakaínu vo vodnom prostredí v prítomnosti pyrénu boli charakteristické pyrénové píky nezastreté pri vlnových dĺžkach 336 nm a 320 nm.

Pre ilustráciu grafy 2 až 5 zobrazujú závislosti súčtu absorbancií všetkých hlavných pyrénových píkov (A_tot) od koncentrácie látky (c) v roztoku pri 25 °C a majú charakteristický sigmoidálny priebeh so stúpajúcou tendenciou. Vnútorné grafy predstavujú závislosti absorbancií (A) jednotlivých pyrénových píkov od koncentrácie látky.

Hodnoty kritických micelových koncentrácií boli determinované zo závislostí A_tot od koncentrácie c surfaktantu fitovaním sigmoidálnou Boltzmannovou funkciou podľa nasledujúcej rovnice:

kde a_i a a_f sú iniciálne a konečné (angl. final) asymptoty sigmoidy, x ako nezávislá premenná je koncentráciou surfaktantu, x₀ je stred sigmoidy a Δx nezávislé rozmedzie, kde dochádza k náhlej zmene.

Táto funkcia poskytuje dve hodnoty X₁ a X₂, jednu pri x₀ a ďalšiu pri (x₀ + 2Δx). Pomer x₀/Δx je návodom pre rozlíšenie, ktorá z nich je považovaná za cmc. Pre amfifilné systémy, ktorých (x₀/Δx) < 10, platí, že X₁ = cmc = x₀, a pre systémy, kde (x₀/Δx) > 10, zase X₂ = cmc = (x₀ + 2Δx)^4, 5).

V prípade vodných roztokov všetkých študovaných derivátov mal pomer x₀/Δx hodnotu menšiu ako 10, teda hodnota X₁ sa považuje za cmc a nadobúda hodnotu x₀. Determinované hodnoty kritických micelových koncentrácií vybraných kvartérnych amóniových solí odvodených od heptakaínu a parametre všetkých sigmoidálnych funkcií (počet fitovaných bodov z, počet atómov uhlíka n_C v hydrofóbnom reťazci, hodnoty x₀, Δx, pomer x₀/Δx, koeficient determinácie R², chi-kvadrát (χ²), hodnoty X₁, X₂) sú uvedené v súhrnnej tabuľke 2).

V porovnaní s hodnotou cmc heptakaíniumchloridu (cmc = 1,97 · 10^–2 mol/l), ktorá bola stanovená fluorimetrickou metódou s pyrénom i ¹³C NMR spektroskopiou (cmc = 2,06 · 10^–2 mol/l), boli všetky hodnoty cmc skúmaných kvartérnych amóniových solí nižšie.

Z tabuľky 2 možno vidieť, že determinovaná hodnota cmc zlúčeniny H+B (X = Cl^–) bola o trochu nižšia ako pri látke H + Al (X = Br^–) v dôsledku zvýšenej lipofility^6, 7) a prítomnosti Cl^– ako protiiónu^7–10). Z tabuľky 2 možno vidieť, že determinovaná hodnota cmc zlúčeniny H + B bola len o trochu nižšia ako pri látke H + Al.

V homologickom rade študovaných bromidov H22, H26, H27 a H29 hodnoty cmc exponenciálne závisia od počtu atómov uhlíka n_C v alkylovom reťazci¹¹⁾, resp. hodnoty ln(cmc) závisia od n_C lineárne podľa vzťahu: (ln (cmc) = –3,131–0,421n_C). Voľná Gibbsova energia prenosu jednej metylénovej skupiny alkylového reťazca z vodnej fázy do vnútra micely pri teplote 25 °C má hodnotu (–0,421 ± 0,034)RT podľa rovnice:

kde parameter B predstavuje príspevok každej metylénovej skupiny ku kritickej micelovej koncentrácii a je smernicou závislosti ln(cmc) od n_C, R je molová plynová konštanta a T je termodynamická teplota.

Z tabuľky 2 tiež vyplýva, že stanovená hodnota cmc jodidu H37 je len o málo vyššia ako jeho bromidového analógu, tak ako hovorí teória o miere viazanosti protiiónov^7, 11).

Osobitným prípadom stanovenia cmc pomocou absorpčnej spektroskopie bol derivát H34 (n_C = 4, X = I^–). Príprava jeho vodného roztoku bola neúspešná, ako bolo uvedené vyššie, preto sme postupne pripravili jeho etanolový roztok. Koncentrácia etanolu v konečnom zásobnom roztoku bola 3 mol/l. Všeobecne prítomnosť etanolu v roztoku zvyšuje hodnoty cmc iónových surfaktantov^{6, 7, 12, 13)} a rovnako prítomnosť aniónu I^– menej podporuje micelizáciu oproti protiiónom Br^– a Cl^{– 8, 9, 14)}.V konečnom dôsledku bola hodnota cmc jodidu H34 nižšia ako predpokladaná cmc = 8,1 · 10^–3 mol/l pri bromidovom deriváte s n_C = 4 v homologickom rade podľa funkcie ln(cmc) = –3,131–0,421n_C. Vplyv veľkého množstva etanolu ako aditíva na hodnotu cmc skúmaného derivátu bol výrazný. Takýto pokles v hodnotách cmc vplyvom alkoholu s krátkym reťazcom vo vyššej koncentrácii bol pozorovaný aj pri pentakaíniumchloride (graf 6) a v roku 2011 podobný priebeh zaznamenali Gališinová s kolektívom¹⁵⁾.

Metanol ako organické aditívum triedy II⁷⁾ zvyšuje hodnotu cmc roztoku surfaktantu oproti jeho vodnému roztoku^{7, 12, 13, 15–17)}. A so zvyšujúcou sa koncentráciou alkoholu v roztoku hodnota cmc ešte stúpa¹³⁾.

Pri pentakaíniumchloride v metanolových prostrediach hodnota cmc stúpala s koncentráciou metanolu len pri 0,2 mol/l a 0,3 mol/l. Pri vyššej koncentrácii tohto alkoholu (0,4 mol/l a 0,5 mol/l) hodnota cmc klesala (graf 6). Podobný priebeh bol pozorovaný v práci¹⁵⁾.

Prídavok alkoholu narúša štruktúru solvatovanej vrstvy micely (solvatovanej vody na povrchu), alebo prednostne solvatuje molekuly rozpustenej látky. Je známe, že alkohol s dlhším uhlíkovým reťazcom penetruje do palisádovej vrstvy miciel a znižuje cmc surfaktantu^{7, 18–21)}. A hoci v prípade pentakaíniumchloridu v metanolových prostrediach ide o alkohol s krátkym uhlíkovým reťazcom, predpokladáme, že pri ich vyššej koncentrácii v roztoku dochádza k penetrácii do micely, čím sa zníži cmc, a teda sa podporí schopnosť tvorby miciel. Alebo sa pravdepodobne začnú tvoriť samotné metanolové agregáty, dochádza k desolvatácii rozpustenej študovanej látky, cmc preto klesne. Pre potvrdenie tohto deja je však potrebné uskutočniť ďalšie merania s využitím iných experimentálnych techník. 

Stret záujmu: žiadny.

Došlo 8. júna 2015

Prijato 25. júna 2015

doc. Mgr. Fils Andriamainty, PhD. • J. Gališinová • J. Čižmárik • E. Salanci • A. Gálusová • L. Stopková

Farmaceutická fakulta UK

Katedra farmaceutickej chémie

Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, SR

e-mail: andriamaint1@uniba.sk

^*Part 205: Čes. slov. Farm. 2014; 63, 160–163.