Jehlová konfokální laserová endomikroskopie v diferenciální diagnostice cystických lézí pankreatu

Súhrn

Východiska: Pankreatické cystické léze jsou poměrně častým nálezem a jejich počet neustále roste, což souvisí také s rozmachem zobrazovacích metod. Až 15 % karcinomů pankreatu vzniká z mucinózních cystických tumorů pankreatu, především z intraduktální papilární mucinózní neoplazie (IPMN). Jehlová konfokální laserová endomikroskopie (nCLE) představuje pokročilou diagnostickou metodu, která má potenciál zvýšit přesnost diagnostiky ložiskového postižení slinivky břišní. Cíl: Cílem práce je poskytnout recentní přehled postavení nCLE v diagnostice cystických lézí pankreatu a ně kte rých vlastních zkušeností. Metoda nCLE je založena na tzv. optické biopsii v reálném čase, což přináší lepší diagnostické výsledky ve srovnání s tradičními postupy, jako jsou CT, MR/MRCP a EUS, což potvrzují i vlastní data autorů. Přestože nCLE nabízí určité výhody, její širší využití v klinické praxi je omezováno vysokými náklady na vybavení, technickými obtížemi při vyšetření a nutností důkladného tréninku endoskopistů. Integrace všech diagnostických postupů (EUS, cytologie, nCLE a next-generation sekvenování) do algoritmů umělé inteligence by mohla minimalizovat nevýhody jednotlivých metod a zvýšit celkovou efektivitu diagnostiky cystických lézí pankreatu. Závěr: nCLE představuje inovativní metodu diagnostiky cystických lézí pankreatu, která v kombinaci s dalšími postupy (biopsie mikrokleštěmi, sekvenování nové generace, hodnocení nálezů nCLE a celkového rizika malignity pomocí umělé inteligence) může dále zvyšovat svou diagnostickou přesnost v této indikaci.

Klíčová slova:

jehlová konfokální laserová endomikroskopie – cystická léze pankreatu – optická biopsie – endoskopická ultrasonografie – umělá inteligence

Úvod

Incidence karcinomu pankreatu neustále stoupá a lze očekávat, že po roce 2030 bude druhou nejčastější příčinou úmrtí na zhoubný nádor [1]. Přibližně 10–15 % nádorů vzniká z mucinózních cystických tumorů pankreatu, především z intraduktální papilární mucinózní neoplazie (IPMN) [2]. Pankreatické cystické léze (PCL) jsou častým nálezem v populaci (pooled prevalence kolem 8 %) a jejich počet neustále roste, což souvisí také s rozmachem zobrazovacích metod. Prevalence stoupá s věkem (10–37 % nad 70 let), na druhou stranu pouze malé procento (0,8 %) je signifikantní velikosti (> 20 mm) [3,4]. Klinicky nejvýznamnější jsou mucinózní cystické tumory: IPMN a mucinózní cystadenomy (MCN), protože mají maligní potenciál. Současná diagnostika cystických tumorů pankreatu je založena na CT, MR/MRCP, UZ a především endoskopické ultrasonografii (EUS), která umožňuje nejdetailnější hodnocení velikosti cysty, posouzení lokalizace, morfologie a vaskularizace stěny, přítomnosti, či absence solidní porce, murálních nodulů nebo septace, dilatace pankreatického vývodu a vztahu léze k vývodu. Lineární EUS umožňuje cílenou biopsii (EUS-FNA nebo FNB) s vyšetřením aspirátu cysty (nádorové markery, cytologie, event. mikrohistologie, bio chemie), které má důležitou roli v diferenciální diagnostice PCL. Hladina CEA aspirátu > 192 ng/ml spolu s cytologií má vysokou senzitivitu (91 %) pro stanovení diagnózy mucinózního cystického tumoru [5], ačkoli ně kte ré recentnější práce prokazují senzitivitu okolo 70–80 % vzhledem k tomu, že především u IPMN mohou být hladiny CEA aspirátu nižší [6–8]. Další možností rozlišení mucinózních a nemucinózních cystických neoplazií je stanovaní glukózy v aspirátu, která je nižší u mucinózních lézí a v ně kte rých pracích má její stanovení senzitivitu 92 %, specificitu 87 % a diagnostickou přesnost 90 % [9].

Problémem výše popsané diagnostiky (v souladu se současně platnými klinickými doporučeními [10–13]) je stále nízká diagnostická přesnost (accuracy) ve stanovení diagnózy high-grade dysplazie či adenokarcinomu v terénu IPMN. Kvůli tomu v běžné klinické praxi stále pozorujeme buď „overtreatment“ – při indikaci resekčních výkonů pankreatu kvůli benigním lézím se všemi důsledky (mortalita 1–7 %, pooperační komplikace 30 %, diabetes) [4,14] a na druhé straně „undertreatment“ – při pozdní diagnóze malignity se špatnou prognózou (obdobnou nebo jen mírně příznivější než u duktálního adenokarcinomu vznikajícího ze solidních prekurzorů). Recentní metaanalýza ukazuje až 10 % „zbytečných“ operací u pacientů, kteří absolvovali diagnostiku dle současně platných guidelines [15].

Jehlová konfokální laserová endomikroskopie (nCLE) není novou diagnostickou modalitou, u cystických lézí pankreatu se používá více než 10 let [16,17], přesto metoda stále ještě nenašla širší uplatnění. Spolu s dalšími technikami, kdy je diagnostické akcesorium zaváděno cestou bio ptické endosonografické jehly do lumen cysty pankreatu (klešťová biopsie, kartáčková cytologie), umožňuje nCLE teoreticky zvýšení diagnostické přesnosti a senzitivity kombinovaného diagnostického přístupu provedením optické biopsie v reálném čase. Otázkou je, zda je tento předpoklad možné naplnit v běžné klinické praxi.

Konfokální laserová endomikroskopie

Konfokální mikroskopie je metoda mikroskopického zobrazení silnějších tkání (tloušťka vyšší než zanedbatelná) s vysokým rozlišením a kontrastem, které jsou umožněny potlačováním signálů z rovin umístěných nad i pod rovinou zaostření přístroje. Snímání v jednotlivých vrstvách následně umožňuje 3D rekonstrukci preparátu. Vzhledem k těmto vlastnostem je metoda využitelná také při snímání a zobrazování tkání in vivo – provedení tzv. optické biopsie v reálném čase [18].

Ve vývoji konfokální mikroskopie existuje významná česká stopa, původní ideu Marvina Minského patentovanou již v roce 1957 rozvíjeli v 60. letech Mojmír Petráň a Milan Hadravský [19] působící na LF UK v Plzni. Teprve v 80. a 90. letech minulého století byl zahájen výzkum využití metody k in vivo zobrazování (nejprve snadno dostupných tkání zvířat a lidí – oko, kůže a dutina ústní). Zásadním pokrokem bylo využití optického vlákna umožňující oddělení detekční části zařízení od zdroje světla a detektoru. Miniaturizace optiky a mechaniky na distálním konci optického vodiče umožnila následně konstrukci prvních konfokálních endomikroskopů [18].

Využití konfokální laserové endomikroskopie (CLE) bylo poprvé publikováno v české literatuře již v roce 2007 [20]. Zpočátku byly konstruovány endoskopy s přímo zabudovaným CLE (eCLE – endoscope-based CLE). Zásadní nevýhodu konstrukce – omezení vyšetření na trávicí trubici – odstranil další koncept tzv. probe-based CLE (pCLE). Ta umožnuje zobrazování dalších tkání a orgánů po zavedení sondy pracovním kanálem endoskopu nebo jehlou určenou k aspirační biopsii (nCLE – jehlová CLE). Metoda umožňuje in vivo optickou biopsii sliznic trávicí trubice v reálném čase (zobrazení sliznice a podslizničních struktur), bez nutnosti odběru materiálu, s až 1 000násobným zvětšením. Zdrojem světla je laser, který osvětluje pozorovanou tkáň přes konfokální clonu, kterou prochází také od tkáně odražené emitované fluorescenční záření. Výsledný obraz je následně počítačově zpracován. Parenterálně aplikovaný fluorescein zvýrazňuje po 2–3 min. po podání jádra, membrány a cytoplazmu pozorovaných buněk, tento efekt trvá až 30 min.

Klinické aplikace CLE v gastroenterologii se dosud soustředily hlavně na posuzování dysplazie v Barrettově jícnu, vyšetření neoplastických lézí žaludku, tračníku [21–23]. Kombinace CLE s cholangioskopií byla opakovaně zmiňována (i v doporučení ASGE) jako metoda s potenciálem zvýšení diagnostické přesnosti diagnostiky indeterminovaných stenóz žlučových cest [24,25].

Jehlová konfokální laserová endomikroskopie

Součástí endosonografického vyšetření cystických lézí pankreatu je EUS navigovaná CLE zaváděná jehlou (nCLE). Nemocné vyšetřujeme obvykle v analgosedaci lineárním přístrojem s 19G EUS bio ptickou jehlou, ve které je již zavedena speciální konfokální sonda. Přibližně 2–3 min. před zahájením biopsie s nCLE intravenózně pacientovi podáme 5 ml 10% fluoresceinu (fluorescein sodium). Po zavedení bio ptické jehly do pankreatické cysty zasuneme pod EUS kontrolou endomikroskopickou sondu ke stěně cystické léze a provádíme vlastní endomikroskopické vyšetření, které současně zaznamenáváme na videozáznam k následnému hodnocení. Délka vyšetření by neměla přesáhnout 5–10 minut kvůli zvýšenému riziku postprocedurálních komplikací. Po ukončení endomikroskopie konfokální sondu z jehly vytahujeme a provádíme aspiraci obsahu cysty k dalšímu vyšetření (cytologie, tumor markery, bio chemie). Součástí výkonu může být i klešťová biopsie stěny cysty skrz bio ptickou jehlu (TTNB – trough-the-needle-biopsy) pomocí speciálních mikrokleští. Před výkonem podáváme i.v. ATB profylaxi a po výkonu podáváme ATB 3 dny perorálně. Jako prevenci postprocedurální akutní pankreatitidy před výkonem podáváme per rectum 100 mg indometacinový čípek. Během výkonu a po něm nemocného hydratujeme krystaloidy i.v. Maximální počet výkonů stanovených výrobcem je deset vyšetření na jednu konfokální sondu, která se po vyšetření musí sterilizovat před dalším použitím.

Hodnocení záznamu nCLE probíhá již v průběhu vyšetření, ale hlavně postprocedurálně. Může být poměrně obtížné vzhledem k frekvenci obrazu (12 snímků za sekundu) a různým artefaktům vznikajícím primárně při pohybu sondy na povrchu stěny cysty (průměr obrazu je 325 µm, hloubka zobrazení 40–70 µm) a sekundárně při dechových exkurzích pacienta. Často je tedy složité dosáhnout několikasekundového hodnotitelného záznamu, optimální hodnocení záznamu umožňuje speciální software v procesoru CLE.

Jednou z hlavních limitací nCLE je cena vybavení způsobující nízkou dostupnost vyšetření, které v současnosti rozhodně není a nejspíše ani v budoucnosti nebude rutinní diagnostickou metodou. Problematický je dále omezený počet vyšetření, která lze provést jednou sondou, a zejména limitovaná vyšetřitelnost jen sondě dostupné části povrchu stěny cystické léze. Hrozí tak „sampling error“ při fokálně distribuovaných změnách epitelu, které sondou umisťovanou v podstatě náhodně nemusíme zachytit. Obtíže působí také technika vyšetření vyžadující udržování relativně stálé vzdálenosti sondy od epitelu cystického tumoru, což je při hlubokém dýchání pacienta, vlivem přenesených pulzací a peristaltiky, poměrně obtížné. Další limitací je stále neúplný konsenzus expertních endosonografistů při interpretaci záznamů nCLE, v praxi až desetina vyšetření nemá stanovenu jednoznačnou diagnózu. Jako minimální počet vyšetření k dosažení odbornosti endoskopisty je udáváno 30–35 [26,27]. Všechny tyto faktory omezují dostupnost metody na několik málo terciárních pracovišť s vysokým objemem endosonografických vyšetření, což významně snižuje množství nemocných, které je možné touto technikou vyšetřit. Přes relativně slibné výsledky mnoha studií nebyla tato metoda dosud zařazena do žádných guidelines pro diagnostiku a terapii cystických tumorů pankreatu.

Mezi nejobávanější komplikace nCLE patří postprocedurální akutní pankreatitida (riziko 2–11 % [28,29], která je často klinicky významná. Mezi rizikové faktory vzniku této komplikace patří délka vyšetření, nadměrné pohyby jehly v cystě a současně prováděná klešťová biopsie (TTNB). Dalšími potenciálními komplikacemi vyšetření jsou indukce krvácení do cysty spojené s rizikem jejího zvětšení a možným vývojem biliární obstrukce a sekundární infekce cysty. Specifickou a klinicky nevýznamnou komplikací parenterálně podaného fluoresceinu je žluté zbarvení kůže a sliznic, které vzniká několik minut po aplikaci a většinou odeznívá do 12 hod., a žlutooranžové zbarvení moči, které může přetrvávat až 36 hod. Tento fenomén je potřeba s pacientem komunikovat. Alergie na fluorescein je vzácná. Mezi mírné vedlejší účinky (do 1 %) po podání fluoresceinu mohou patřit také nauzea, zvracení, přechodná hypotenze, difuzní exantém a mírná epigastrická bolest [30]. Úmrtí v souvislosti s vyšetřením nCLE nebylo dosud hlášeno.

První klinické studie INSPECT 2013 [28], DETECT 2015 [31] a zejména práce francouzských autorů (Giovannini [16] a Napoleon [32,33]) pomohly definovat nCLE kritéria pro rozlišení serózních a mucinózních cystických tumorů. Později byly navrženy dosud akceptované typické morfologické nCLE obrazy v diferenciální diagnostice PCL:

• a) serózní cystadenom: povrchová vaskulární síť (obr. 1). Marker má senzitivitu 69 %, specificitu 100 % a diagnostickou přesnost 87 %, má také vysokou shodu mezi pozorovateli (k = 0,77) [32];
• b) IPMN: prstovité papilární struktury s bílým středem a relativně tmavším epitelovým okrajem (obr. 2, 3). Marker má senzitivitu 80 %, specificitu 92 % a diagnostickou přesnost 90 % [33];
• c) mucinózní cystadenom: epitelový okraj cysty viditelný jako tenká tmavá linie ohraničující šedý pás. Marker má senzitivitu 67 %, specificitu 96 % a diagnostickou přesnost 90 % [33];
• d) pseudocysta: malé černé, šedé nebo světlé heterogenní plovoucí partikule. Marker má senzitivitu 43 %, specificitu 100 % a diagnostickou přesnost 87 % [33];
• e) NET: tmavé buněčné agregáty ohraničené šedým vazivem a cévami (obr. 4) [33].

Analýzy shody mezi pozorovateli (interobserver agreement) v hodnocení nálezů nCLE v PCL prokazují poměrně široký rozptyl od shody nízké (k = 0,13) [34] ke shodě výborné (k = 0,86) [26,34,35]. Tyto rozdíly jsou částečně způsobeny rozdílnými soubory PCL, vyšší shoda je dosahována při identifikaci serózního cystadenomu a mucinózních lézí. Dalším významným problémem je kolísavá kvalita obrazových dat způsobená artefakty, ale také náročnost tréninku endoskopistů a strmá učící křivka metody. Popsané markery cystických lézí pankreatu prokazují senzitivitu (66–94 %), specificitu (82–100 %) a diagnostickou přesnost (77–97 %) (tab. 1). Problémem statistického hodnocení výstupů těchto prací je často malý počet zařazených pacientů, ze kterých je následně jen malá část operována, a tím je poměrně limitováno množství lézí, které lze objektivně porovnat s definitivním histopatologickým zhodnocením chirurgického resekátu. Častým „zlatým standardem“ srovnávaným s nCLE je tedy klinický konsenzus expertů v kombinaci s kontrolními zobrazovacími vyšetřeními, jejichž přesnost může být poměrně diskutabilní. Tato metodika hodnocení je nicméně vzhledem k žádoucímu omezení počtu zbytečně či předčasně indikovaných operací pochopitelná.

V posledních letech jsou v literatuře stále častěji publikovány relativně kontroverzní závěry stran role nCLE v určování histologických subtypů IPMN a především v posuzování stupně dysplazie u IPMN [2,35]. Skutečnost, že nCLE je možné provádět i ex vivo (např. v chirurgických resekátech), je využívána k definici morfologických znaků pro high- -grade dysplazii, event. karcinom, a jejich zpětnou identifikaci v nCLE záznamech. Low-grade dysplazie je charakterizovaná tvorbou papil, které jsou kryté jednou řadou cylindrických mucinózních buněk s bazálně umístěnými jádry, papily jsou štíhlé. Pro high-grade dysplazii je histologicky typická ztráta polarity jader, jejich nepravidelný tvar a zvýšený nukleo-cytoplazmatický poměr, v nCLE obraze vidíme zkreslení papil, ztrátu prstovité architektoniky, výraznou vaskularizaci, ztluštění papil, tmavší epitel a někdy velké maligní buňky. Senzitivita a diagnostická přesnost ztluštění papil (≥ 50 μm) a tmavého epitelu (intenzita pixelu ≤ 90), jako dvou nejtypičtějších markerů high-grade dysplazie, dosahovala podle ně kte rých dat 90 a 91 %, resp. 85 a 84 %. V obou ukazatelích byla dosažena také poměrně vysoká shoda mezi pozorovateli (k = 0,61 a 0,55) [35]. Problematické může být hodnocení vaskulární sítě, která se u ně kte rých IPMN svou bohatostí může blížit až obrazu, který je typický pro serózní cystadenom, což můžeme potvrdit i z vlastního pozorování.

Důležitý je dále vliv vyšetření nCLE na další diagnosticko-terapeutický algoritmus u nemocných s PCL. Ve studii Palaz za et al. došlo k významné změně doporučení po provedení nCLE u 28 % nemocných. Zásadní byl průkaz benigních serózních cystadenomů se snížením frekvence jejich sledování [36].

Současně s přiznáním určitých limitací nCLE v diagnostice PCL se ověřuje využití dalších technik s potenciálem tyto limitace odstranit. Relativně dostupné je využití odběru biopsie epitelu cyst pomocí TTNB. Recentní data vykazují srovnatelnou diagnostickou přesnost metody s nCLE a zvýšení diagnostické přesnosti při použití obou technik současně (AUC: 95 %) [37]. Nevýhodou TTNB je samozřejmě zvýšení invazivity výkonu a potenciální riziko komplikací. Dalším příkladem takové inovativní techniky je umělá inteligence (AI). AI může hrát významnou roli především v reprodukci a správné interpretaci nCLE nálezů. Problémem je samozřejmě strojové učení vzhledem k relativně nízkému počtu pacientů vyšetřených nCLE, což snižuje rozmanitost obrazových dat využitelných v této důležité fázi tréningu AI. Problematická je zároveň interpretace dat obsahujících artefakty a nutnost jejich eliminace. Ve studii Machicada et al. byly algoritmy AI trénovány na dostatečném množství dat (> 15 000 snímků nCLE) získaných ovšem pouze od 35 pacientů [38]. Ve studii byly použity dva algoritmy AI pro detekci low-grade a high-grade dysplazie v IPMN (histologicky ověřené nálezy). První algoritmus byl zaměřen na detekci a měření tloušťky a tmavosti epitelu (model 1), druhý (holistický) algoritmus automaticky definoval markery nCLE k usnadnění stratifikace rizika dysplazie (model 2). Oba algoritmy byly srovnávány s konsenzy AGA [13] a Fukuoka [12] a prokázaly vyšší senzitivitu (model 1: 83 % a model 2: 83 % vs. AGA: 56 % a Fukuoka: 56 %) a přesnost (model 1: 83 % a model 2: 86 % vs. AGA: 69 % a Fukuoka: 74 %) při srovnatelné specificitě (model 1: 82 % a model 2: 88 % vs. AGA: 82 % a Fukuoka: 94 %).

Jako nadějné se také jeví vyšetření aspirátů a biopsií stěny cyst pomocí sekvenování nové generace, ačkoli jsou výsledky studií dosud také poměrně kontroverzní. Metoda umožňuje identifikaci různých typů PCL včetně serózních cystadenomů, solidních pseudopapilárních tumorů a cystických neuroendokrinních tumorů pomocí specifických mutací genů VHL, CTNNB1 a MEN1 a mucinózních cystických tumorů (pomocí mutací v genu MAPK, GNAS a/nebo KRAS) [39–41]. Dosud testované markery progrese low-grade do high-grade dysplazie až karcinomu (mutace genů TP53, SMAD4, PIK3CA, CDKN2A, PTEN) mají bohužel velice nízkou senzitivitu (9–39 %), ale poměrně vysokou specificitu (92–98 %) [40]. Ně kte rá recentní data na druhou stranu prokazují vyšší senzitivitu (88 %) a vysokou specificitu (98 %) při identifikaci mutací v kombinaci genů MAPK/GNAS a TP53/SMAD4/CTNNB1/mTOR nebo při kombinaci sekvenování s cytologickým hodnocením (senzitivita až 93 %) [39]. Obdobně byly zkoumány také ně kte ré mikroRNA [42] a dlouhé nekódující řetězce RNA [43]. V této souvislosti se jako nadějné jeví především integrování všech diagnostických postupů (EUS, cytologie, nCLE, sekvenování nové generace a klinická data) do algoritmů AI umožňující využití všech výhod jednotlivých metod a potlačení jejich limitací.

Vlastní zkušenosti

Na našem pracovišti jsme dosud provedli celkem jedenáct vyšetření nemocných (4 muži, 7 žen, průměrný věk 59 let) s cystickými tumory pankreatu pomocí nCLE (AQ-Flex nCLE miniprobe – Cellvizio, Mauna Kea Technologies, Paris, France). Indikací byly nově diagnostikované PCL > 25 mm (6 případů), s murálním nodulem (1 případ) nebo progresivně rostoucí, dříve diagnostikované PCL (4 případy). Průměrná velikost vyšetřovaných lézí byla 39 mm. Ve všech případech bylo vyšetření konfokální endomikroskopií doplněno o cytologické vyšetření aspirátu, stanovení CEA, glukózy a u 46 % nemocných (5 z 11) jsme vyšetření doplnili také cílenou biopsií stěny cysty pomocí mikrokleští (Moray, US Endoscopy, OH, USA). Celkem bylo diagnostikováno sedm mucinózních cystických tumorů (pět branch-duct IPMN [obr. 2, 3], dva mucinózní cystadenomy), tři serózní cystadenomy (obr. 1) a jeden neuroendokrinní tumor grade 1 (obr. 4). Cytologie byla diagnostická u 55 % pacientů, klešťová biopsie v 80 % odebraných případů. nCLE poskytla hodnotitelné nálezy u všech pacientů. Správná diagnostika při zaslepeném hodnocení videozáznamu nCLE (ověřená srovnáním s histopatologickým vyšetřením chirurgického resekátu u třech nemocných a klinickým konsenzem expertů v kombinaci s kontrolními zobrazovacími vyšetřeními u osmi nemocných) byla stanovena u 91 % vyšetřovaných (deset z jedenácti). Provedení nCLE prodloužilo EUS vyšetření průměrně o 5 minut. V průběhu vyšetření jsme nepozorovali žádné komplikace. Po nCLE byl jeden pacient sledován pro asymptomatický a spontánně odeznívající obstrukční ikterus (při přechodném zvětšení cysty po krvácení) bez nutnosti terapie.

Závěr

Jehlová konfokální laserová endomikroskopie představuje pokročilou diagnostickou metodu, která vykazuje vyšší diagnostickou přesnost ve srovnání s konvenčními diagnostickými postupy při hodnocení cystických lézí pankreatu. Metoda umožňuje provedení optické biopsie v reálném čase, což zvyšuje senzitivitu a specifitu endosonografické diagnostiky. Přesto naráží nCLE na několik významných limitací, vč. vysokých nákladů na vybavení, technických obtíží spojených s vyšetřením a nutnost dostatečného tréninku endoskopistů. Předběžné výsledky ukazují slibný potenciál nCLE v kombinaci s jinými technikami, jako je klešťová biopsie, sekvenování nové generace a umělá inteligence. Integrace těchto metod může poskytnout komplexní přístup, který minimalizuje nevýhody jednotlivých technik a zvyšuje celkovou efektivitu diagnostiky.