Klinické využití protilátek u roztroušené sklerózy

Súhrn

V poslední době přibývá dokladů o úloze B-lymfocytů a protilátkové imunity v patogenezi roztroušené sklerózy (RS). Klinicky se využívá přítomnosti oligoklonálních pásů IgG v mozkomíšním moku bez sérového korelátu jako významné podpory pro diagnózu RS, protože se vyskytuje až u 95 % pacientů s RS. Hledání protilátkové specifity bylo neúspěšné. Přesto se v séru nebo mozkomíšním moku pacientů zkouší nalézt protilátka nebo kombinace protilátek, které by zlepšily diagnostiku nebo klasifikaci klinických forem nebo které by předpovídaly další průběh onemocnění. V současnosti jsou předmětem zájmu antimyelinové protilátky proti myelinovému oligodendrocytárnímu glykoproteinu a myelinovému bazickému proteinu. Jejich prognostická hodnota se posledními poznatky nepotvrzuje. Průkaz axonálního postižení se také odrazil v zájmu o antiaxonální protilátky u pacientů s RS, avšak výsledky nejsou zatím konzistentní. Nové metodické postupy a analýzy dalších faktorů protilátkové imunity jsou nadějí pro použití protilátek jako biologických ukazatelů RS.

Klíčová slova:
roztroušená skleróza, mozkomíšní mok, protilátky, intratekální sytnéza, oligoklonální pásy, imunoglobuliny

Úvod

Autoimunitní charakter roztroušené sklerózy (RS) je podmíněn nejen buněčnými mechanizmy, ale také změnami v humorální imunitě. B-buňky, plazmatické buňky, složky komplementu a různé protilátky byly nalezeny v mozkových lézích, v séru nebo mozkomíšním moku pacientů s RS (obr. 1) [1-4]. Protilátky u RS mohou být ukazatelem choroby jako její sekundární epifenomén, mohou být primárně patogenní nebo naopak protektivní [5]. Jedním z možných patogenetických mechanizmů RS je protilátkově vázaná demyelinizace [6]. S tím může souviset příznivý efekt intravenózních imunoglobulinů a plazmaferézy při léčbě RS [7,8]. Nově se zkouší léčba RS pomocí monoklonální protilátky proti CD20 (rituximab) vedoucí ke snížení B-lymfocytů a T-lymfocytů [9].

Protilátky u RS mohou být součástí obecné „nonsense“ protilátkové odpovědi, autoimunitní reakcí na nějaký antigen nebo se může při jejich tvorbě uplatňovat fenomén zvaný molekulární mimikry (viz dále). U pacientů s RS jsou protilátky namířené proti různým antigenům:

1. cizorodé antigeny – např. viry (viry spalniček, zarděnek, varicella-zoster a herpes simplex) [10-12], lidský herpesvirus typ 6 [13] a jiná infekční agens – Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp [14,15], Chlamydophila pneumoniae [16]
2. vlastní autoantigeny neuronů nebo oligodendrocytů [1,2,4,17]:
   
   • proteiny a komplexní molekuly myelinu – myelinový bazický protein (MBP), myelinový oligodendrocytární glykoprotein (MOG), glykoprotein asociovaný s myelinem (MAG), proteolipidový protein (PLP), sulfatidy, gangliosidy, Nogo-A a jeho receptor, galaktocerebrosid [18-25]
   • axonální proteiny – tubulin, neurofilamenta [14,26-30]
3. vlastní ostatní autoantigeny [17] – např. antikardiolipinové protilátky, protilátky proti nukleárním a tyreoidálním mikrosomálním antigenům, protilátky proti bílkovinám tepelného šoku tzv. heat shock proteins, protilátky proti proteazomu, jadernému ribonukleoproteinu, dvojšroubovici DNA, synapsinu [23,31-36]
4. antigeny „nonsense“ specifity

Není jasné, zda B-buněčná odpověď je výsledkem určité charakteristické reakce v rámci RS vyvolávané přítomností antigenu nebo zda se jedná o nespecifickou polyklonální B-buněčnou aktivaci bez vazby na RS. Zdá se, že alespoň část imunitní reakce je vyvolávána antigenem [37]. Na hledání specificity sérových nebo mozkomíšních imunoglobulinů bylo vynaloženo velké úsilí, ale antigenní cíl převažující části intratekálních protilátek není dosud jasný [17,38]. Z četných studií vyplývá velká heterogenita protilátek, pravděpodobně jako součást polyspecifické humorální odpovědi u RS. Jedním z vysvětlení je fenomén tzv. rozšiřování epitopů. Po úvodní zánětlivé příhodě se uvolněním nových antigenů může aktivovat autoreaktivní buněčná a humorální imunitní odpověď, která zahrnuje další myelinové a nemyelinové antigeny nebo epitopy [39]. Protilátky mohou vznikat jako autoimunitní duální reakce na různé antigeny se strukturální podobností fenoménem tzv. molekulárních mimikry. Exogenní struktury (např. peptidy odvozených od virových partikulí nebo bakterií) mohou vytvářet protilátky, které zkříženě reagují s neuronálními antigeny [40-42].

Cílem klinického využití protilátek je zpřesnění diagnózy, identifikace rizikovějších pacientů, prognózování dalšího osudu nemocného a vhodná volba léčebné strategie. Lze přitom sledovat dva hlavní směry využívající jednak celkové a jednak specifické protilátky.

Klinické využití celkových protilátek u roztroušené sklerózy

Konstantním rysem pacientů s RS je intratekální syntéza imunoglobulinů IgG v mozkomíšním moku (MMM). Proto nález autochtonní produkce IgG významně podporuje diagnózu RS. Intratekální syntéza se prokazuje kvalitativně přítomností oligoklonálních IgG pásů v mozkomíšním moku nebo kvantitativně zvýšenou produkcí IgG v CNS [43-45].

Dva nebo více oligoklonálních pásů IgG v MMM bez odpovídajících sérových pásů odráží lokální reakci B-buněk v CNS. IgG pásy znamenají izoelektrickou fokusací rozdělené IgG vyskytující se v MMM nebo séru. Každý pás je tvořen homogenní skupinou imunoglobulinů – protilátek, které jsou produkovány jednou populací identických B-lymfocytů (tzv. klonem). Imunoglobuliny mohou do MMM přestoupit také z krve. Několik klonů B lymfocytů (tzv. oligo) produkuje lokálně protilátky, které se při vyšetření projeví jako oligoklonální pásy IgG. Autoimunitní produkce protilátek v  CNS se potvrdí tím, že některé oligoklonální pásy se detekují výhradně v MMM a nikoli v séru od téže osoby (obr. 2). Při použití standardizované metodiky (nejlépe separace bílkovin izoelektrickou fokusací následované imunoblotingem) má asi 95 % pacientů s RS detekovatelné mozkomíšní pásy IgG, aniž by byly podobné pásy zjistitelné v séru [46]. Specifita bývá kolem 85-90 % [44]. Pro detekci oligoklonálních pásů IgG byl nedávno vyvinut nový test, který je více senzitivní (až 96 %), specifický (až 99,5 %) a snadnější k interpretaci než dříve popsané metodiky [47]. Jakmile jsou oligoklonální pásy v mozkomíšním moku vytvořeny, přetrvávají u jednotlivého pacienta bez ohledu na průběh RS nebo léčbu [46].

K určení množství IgG produkovaných lokálně v CNS existují různé výpočty. Mezi nejznámnější a nejpoužívanější patří Linkův IgG index a Reiberova formule a diagram [48]. Výhodou tohoto přístupu je kvantitativní zhodnocení a rychlejší a snadnější provedení než analýza oligoklonálních pásů. IgG index (bezrozměrné číslo) je roven poměru koncentrací IgG v MMM/séru (tzv. IgG kvocient) vztažený k poměru koncetrací albuminu v MMM/séru (tzv. albuminový kvocient). IgG index je zvýšen asi u 70 % pacientů s RS a vzácně u pacientů s chybějícími oligoklonálními pásy v MMM [46]. Výpočet podle Reiberovy formule zohledňuje hyperbolický vztah mezi albuminovým a IgG kvocientem a zavádí limitní IgG kvocient na základě měření obrovského množství vzorků pacientů. Výsledek v mg/l nebo % lze vypočítat podle složitého vzorce nebo najít v tzv. Reiberově diagramu vyjadřující vztah mezi IgG a albuminovým kvocientem (obr. 3) [48]. Intratekální syntéza celkových IgG je podle této formule zvýšena u 72 % pacientů s roztroušenou sklerózou [49]. Oba typy výpočtů se považují za stejně citlivé u RS jako většinou u stavu bez poruchy hematolikvorové bariéry, tj. s normálním albuminovým kvocientem [50]. Vzhledem k nižší senzitivitě nemohou být ani IgG index ani Reiberova formule doporučeny jako náhrada oligoklonálních pásů IgG v diagnostice RS [46]. Zlatým standardem je tedy v současnosti stanovení oligoklonálních pásů IgG v MMM metodou izoelektrické fokusace [43-45].

V poslední době se pozornost upíná na předpovědní hodnotu celkové protilátkové reakce. Pacienti s RS se zvýšeným IgG indexem (zvýšenou intratekální syntézou celkových IgG protilátek) mohou mít vyšší riziko progrese choroby [51]. Pacienti s intratekální syntézou protilátek ve třídě IgM mají větší pravděpodobnost konverze do roztroušené sklerózy, častější ataky a horší průběh s větší invalidizací než pacienti bez intratekální IgM syntézy [52,53]. Pacienti po klinicky izolovaném syndromu s prokázanou intratekální syntézou oligoklonálními IgG mají větší riziko zvratu do RS. Přítomnost oligoklonálních pásů IgG v MMM je vysoce specifická (94 %) a senzitivní (91 %) pro konverzi pacientů s první atakou RS do klinicky jisté RS určené druhou atakou. To je užitečná informace na počátku onemocnění, zvl. s normálním nálezem na magnetické rezonanci (MR) mozku [54,55]. Naopak pacienti s chyběním oligoklonálních IgG pásů v MMM mají delší fázi relaps-remitujícího období a pozdější nástup progrese invalidizace [16].

Klinické využití protilátek proti specifickým strukturám u roztroušené sklerózy

Současný výskyt protilátek proti virům spalniček, zarděnek a varicella-zoster (MRZ) u jedné osoby s jiným onemocněním než RS je nepravděpodobný, což se může uplatňovat v diferenciální diagnostice autoimunitních onemocnění. Tato tzv. MRZ reakce doplňuje výsledek oligoklonálních pásů o větší specificitu pro onemocnění RS [10-12]. Novinkou zasluhující ověření jsou protilátky proti galaktocerebrosidu, které jsou specifické pro RS a nebyly nalezeny u zdravých osob na rozdíl od antimyelinových protilátek [24]. Novou nadějnou protilátkou, která by mohla být použita k diagnostice a monitoraci RS za pomoci jednoduchého krevního testu, je protilátka proti jednomu typu z glykanů, které se vyskytují na povrchu buněk. Hladiny IgM protilátek proti Gα4Gα byly významně vyšší v séru pacientů s RS bez ohledu na stadium či léčbu oproti pacientům s jinými neurologickými nemocemi nebo dalšími autoimunitními chorobami (senzitivita 57 %, specificita 85 %) [56].

Sérová autoprotilátka IgG specifická pro neuromyelitis optica (anti-NMO) se váže selektivně k akvaporinu 4. Akvaporin 4 je membránový proteinový kanál pro průchod vody [57]. Optická neuromyelitida je zánětlivé demyelinizační onemocnění, které selektivně postihuje zrakové nervy a míchu. Často bývá zaměňována za RS nebo bývá považovaná za těžkou variantu RS. Doposud nebyl k dispozici rozlišující ukazatel. Anti-NMO IgG protilátka je novým druhem imunoglobulinu u autoimunitně podmíněných poruch membránových kanálů podporující diagnózu optické neuromyelitidy [58].

Jiným typem imunoglobulinů jsou protilátky proti neuronálním autoantigenům – antimyelinové a antiaxonální protilátky.

Antimyelinové protilátky u roztroušené sklerózy

Možnými terči pro protilátky u RS jsou myelinové nebo oligodendrocytární proteiny, které jsou na povrchu dobře přístupné imunitnímu systému. Mezi takové potenciální kandidáty patří: myelinový bazický protein, proteolipidový protein, glykoprotein sdružený s myelinem, 2´,3´-cyklická nukleotid 3´- fosfodiesteráza a myelinový oligodendrocytární glykoprotein (obr. 4) [59].

Myelinový bazický protein (MBP) tvoří největší, asi 30% podíl mezi myelinovými proteiny a je tradičně považován za hlavní cíl imunitní odpovědi u RS. Výsledky detekce sérových a mozkomíšních protilátek proti MBP u pacientů s RS jsou rozporuplné, i když se převážně nalezly ve zvýšené míře u pacientů s RS než u zdravých jedinců. Je to dáno jednak různými imunochemickými metodikami detekce protilátek a zřejmě i různými populacemi pacientů s RS. Četnost anti-MBP protilátek vzrůstá u pacientů s RS po první atace (12 %) do období relaps-remitujícího (32 %) a dále v chronické progresi (40 %). Jsou považovány za ukazatel neurologického poškození spíše než za primární příčinu [60-62].

Myelinový oligodendrocytární glykoprotein (MOG) může být důležitým imunitním terčem u RS, přestože zaujímá pouze malou část myelinových proteinů (nejvíce 0,05 %). MOG je specifickým proteinem CNS, je lokalizován výlučně na zevní části oligodendrogliální membrány a myelinu a je silně imunogenní [17].

U pacientů s RS byla zjištěna zvýšená frekvence buněk produkujících protilátky proti MBP nebo PLP [63]. U řady pacientů s RS se nalezly protilátky proti extracelulární části MOG s převahou IgM třídy. Protilátky proti MOG se vyskytují v séru a mozkomíšním moku u třetiny pacientů již v době první ataky RS. Protilátky jsou přítomny ve stabilním titru a ve stejné četnosti u všech stadií RS. Reakce proti MOG se objevuje i u meningitid. U nich však protilátky časem vymizí, zatímco u RS přetrvávají [61]. Imunomodulační léčba interferonem beta nebo glatiramer acetatem nemá větší vliv na anti-MOG imunoreaktivitu po jednom roce léčby [64].

Jedním z významných pokusů předpovídat další osud pacientů po první atace roztroušené sklerózy bylo ověření vztahů mezi přítomností sérových antimyelinových protilátek a klinickým vývojem onemocnění. Pacienti se sérovými anti-MOG a anti-MBP protilátkami měli relapsy častěji a dříve než pacienti bez těchto protilátek. Séropozitivní pacienti pro obě protilátky vyvinuli druhou atakou klinicky jistou RS častěji (95 % vs 23 %) a dříve (7 měsíců vs 45 měsíců) oproti séronegativním pacientům [20]. V jiné studii pacienti s oběma typy protilátek proti MOG a MBP měli druhou ataku významně dříve než seronegativní pacienti (5 měsíců vs 25 měsíců) [65].

Následné průřezové studie zabývající se porovnáním pacientů s RS a kontrol z hlediska anti-MOG protilátek přinesly rozporuplné výsledky. Protilátky proti MOG jsou v mozkomíšním moku pacientů s RS zvýšeny (30 %) ve srovnání s kontrolními jedinci (8 %) [22]. Sérové protilátky proti nativnímu glykosylovanému MOG byly měřeny ELISA metodou u pacientů s RS a kontrolních jedinců. Anti-MOG protilátky byly zvýšené u pacientů s první atakou RS. Vyšší anti-MOG IgG protilátky byly nalezeny u pacientů s atakou a u sekundárně progresivních pacientů s RS při srovnání s pacienty v remisi nebo zdravými kontrolami [66]. Hladina protilátek IgG, ale ne IgM, proti nativnímu proteinu MOG měřená vysoce senzitivním testem byla u pacientů s RS (a zejména s primárně progresivní formou) zvýšená oproti různým kontrolním skupinám [67]. Naproti tomu sérové anti-MOG protilátky měřené radioimunotestem (RIA) metodou v kapalné fázi ve třídě IgM i IgG byly nalezeny se stejnou četností u pacientů s RS a zdravých jedinců [68]. V dalších studiích se ukazuje, že přítomnost anti-MOG protilátek u pacientů s RS je podobná jako u pacientů s různými neurologickými diagnózami [25,69,70]. Tyto diskrepance lze vysvětlit rozdílnými populacemi pacientů, použitím různých antigenů – rekombinantních [21,25,68,69] nebo nativních [66,67,70] proteinů MOG a stanovování různými technikami – westernblot [20,25], ELISA [66,69,70] a RIA v kapalné fázi [68]. Rekombinantní proteiny neobsahují posttranslační modifikace (jako např. fosforylace či glykosylace), které mohou měnit významně terciární strukturu bílkoviny nezbytnou pro vazbu protilátek. Proto použití nativního a rekombinantního proteinu může dávat různé výsledky. Dalším vysvětlením je, že anti-MOG protilátky nejsou zřejmě specifické pro RS a vyskytují se i u kontrolních jedinců [25,69,70].

Změněná struktura proteinu MOG v ELISA uspořádání překonává nová metodika. Ta je založena na vazbě IgG k lidskému proteinu MOG s jeho přirozenou konformací vyskytující se v membráně savčích buněk. Při srovnání se zdravými jedinci byly protilátky IgG proti MOG nalezeny ve zvýšené míře u pacientů s první atakou RS a pacientů v relabující-remitující fázi, hraničně u sekundárně progresivních forem RS, a vůbec ne u primární progrese RS. Z toho plyne, že epitopy na přirozeném glykosylovaném proteinu MOG in vivo jsou časným cílem patogenních protilátek a nemusí být detekovány klasickou ELISA metodou [71].

Poslední pozorování vyvrátila naděje vkládané do antimyelinových protilátek k prognózování pacientů s první atakou RS. Velká studie s více než 400 pacienty neprokázala předpovědní hodnotu sérových protilátek proti MOG a MBP pro progresi do klinicky jisté roztroušené sklerózy [72]. Nedávno bylo zveřejněno několik studií, ve kterých se nepotvrdila souvislost mezi přítomností antimyelinových protilátek a časnějším přechodem nebo vyšším rizikem konverze do klinicky jisté RS [65,72-75].

Antiaxonální protilátky u roztroušené sklerózy

V posledních letech došlo s novými poznatky k přehodnocení některých názorů na roztroušenou sklerózu (RS). Původně se tradovalo, že se jedná o autoimunitní demyelinizační onemocnění postihující roztroušeně bílou hmotu centrálního nervového systému (CNS). Vlnu velkého zájmu o axonální problematiku spustily doklady o přerušení axonů jak imunohistochemickými metodikami, tak na MR mozku a míchy. Ukázalo se, že k axonálnímu poškození dochází u RS nejen v zánětlivých ložiscích, ale i ve zdánlivě normální tkáni bílé i šedé hmoty CNS od časných stadií RS [76-78].

Dnes se choroba považuje za vytrvale probíhající autoimunitní a neurodegenerativní proces bílé i šedé hmoty CNS zahrnující demyelinizační i axonální poškození již od časných fází. Axonální poškození u roztroušené sklerózy může být zodpovědné za trvalý nebo narůstající neurologický deficit a být cílem neuroprotektivní léčby. Proto má význam hledat ukazatele tohoto pochodu také v mozkomíšním moku nebo séru.

V rámci autoimunitní povahy onemocnění se mohou vytvářet protilátky proti strukturám specifických pro axon. Typickou cytoskeletální bílkovinou pro neuron jsou neurofilamenta, která se skládají ze tří podjednotek: lehké (light - NFL), střední (medium – NFM) a těžké (heavy – NFH). Protilátky proti neurofilamentům se mohou podílet na poranění axonu, což zatím experimentálně nebylo prokázáno. Axonální přerušení a následná Wallerova degenerace distální části vede k uvolnění neurofilament. Autoimunitní odpověď namířená proti těmto jinak skrytým antigenům může být provázena tvorbou protilátek jako sekundární epifenoménem autodestrukčních procesů (obr. 1). Anti-neurofilamentové (anti-NF) protilátky v séru a mozkomíšním moku u pacientů s RS, bez ohledu na jejich primární nebo sekundární roli, tak obecně mohou odrážet axonální patologii. Přestože axonální proteiny jsou skryté uvnitř nervového vlákna, tvorbu protilátek proti cytoskeletu to nevylučuje. Po poškození nervové tkáně se mohou cytoskeletální proteiny dostat do interakce s dysregulovaným imunitním systémem (fenomén tzv. rozšiřování epitopů). Jsou také známy paraneoplastické syndromy, při kterých se protilátky mohou vázat na cytoplazmatické nebo jaderné struktury neuronů [79,80]. Navíc se může uplatňovat fenomén molekulárních mimikry [40]. Literatura na detekci antiaxonálních protilátek u roztroušené sklerózy je nepoměrně chudší než problematika antimyelinových protilátek.

Protilátky ve třídě IgA, IgM a IgG proti směsi lehkých, středních a těžkých neurofilament byly zvýšené u pacientů s RS oproti pacientům s ikty nebo zdravým osobám [14]. Intratekální produkce anti-NFL protilátek byla významně zvýšená u pacientů s RS s primárně nebo sekundárně progresivním průběhem. Hladina protilátek proti NFH byla u pacientů s RS podobná jako u kontrolních jedinců. Protilátky proti NFL a NFH souvisely s trváním choroby a mírou invalidity [26]. Intratekální produkce protilátek proti NFL pacientů s RS korelovala s atrofickými změnami na MR mozku [27]. Sérové IgG protilátky proti NFL byly významně zvýšené u pacientů s primárně progresivním průběhem RS [28]. Intratekální produkce protilátek IgM a IgG proti střední podjednotce NFM u pacientů s RS byla vyšší než u kontrolních osob [30]. Hladina intratekálních protilátek IgG proti lehké podjednotce NFL nebyla jednoznačně zvýšená u pacientů s RS a v případě IgM typu protilátek byla stejná jako u věkově vázaných kontrolních osob [29]. Nepodařilo se najít nějakou podskupinu pacientů se společnými rysy RS, u kterých byla intratekální syntéza antineurofilamentových protilátek zvýšená. Na rozdíl od intratekálních protilátek se absolutní hladiny protilátek proti NFL či NFM v séru nebo mozkomíšním moku zásadně neodlišovaly mezi pacienty RS a kontrolními jedinci [29,30].

Závěr

Průkaz oligoklonálních IgG pásů v mozkomíšním moku má již své stabilní místo podporující diagnózu RS. Zatím se nepodařilo najít spolehlivou protilátku pro prognózu nebo progresi onemocnění nebo monitorování nemoci či léčby. Doposud nebyla prokázána protilátková reakce specifická pro RS a namířená proti určitému cílovému antigenu CNS. Většina protilátek detekovaných u RS je také nalezena u pacientů s jinými chorobami a v menší míře i u zdravých osob. Neúspěch lze vysvětlit několika faktory. Ještě se nepodařilo určit patogenní protilátky u RS. Protilátky u RS mohou mít různý charakter: patogenní, regulační, sekundární jako epifenomén či dokonce reparativní. Rozporuplné nálezy autoprotilátek u RS mohou být výsledkem technických otázek týkajících se testů s odlišnými detekčními systémy nebo různých forem antigenů použitých pro imunochemické stanovení. Ačkoli protilátky nejsou biologickým ukazatelem specifickým pro RS, mohou být v budoucnu použity k určování a odlišování různých imunopatologických podtypů RS. Pokud se potvrdí užitečnost anti-NMO protilátek pro diagnózu a prognózu optické neuromyelitidy v jiných laboratořích, anti-NMO-IgG protilátky by mohly být prvním biologickým ukazatelem rozlišující pacienty s NMO od pacientů s klasickou RS. Je pravděpodobné, že teprve kombinací několika protilátek u jednotlivých pacientů bude možné lépe klasifikovat pacienty k optimální léčbě.

Přijato k recenzi: 20. 4. 2007

Přijato do tisku: 6. 8. 2007

Adresa ke korespondenci

MUDr. Aleš BARTOŠ, PhD.

Neurologická klinika 3. LF UK, FNKV

Šrobárova 50

100 34 Praha 10

e-mail: abartos@fnkv.cz

Přehledný referát vznikl jako výsledek soustavného zájmu a výzkumu podpořeného výzkumným záměrem MŠMT ČR 0021620816.