Magnetická rezonanční relaxometrie u roztroušené sklerózy – měření T2 relaxačního času v centrální šedé hmotě

Súhrn

Cíl:
Cílem práce je prokázat zvýšené ukládání železa v centrálních strukturách šedé hmoty u pacientů s roztroušenou sklerózou (RS). MR relaxometrie stanovuje železo v normálně vyhlížející šedé hmotě, tedy před MR viditelnými projevy nadměrného ukládání, kterými jsou T2 hypointenzity. Dalším cílem je korelace T2 relaxačního času (T2) a objemu T2 hyperintenzních ložisek (lesion load, LL).

Soubor a metodika:
347 pacientů s klinicky definovanou RS a 117 kontrol bylo vyšetřeno na MR, včetně sekvence Multiecho (GraSE, gradient and spin echo) k výpočtu T2. Při korelaci T2 byli pacienti spárováni s kontrolami dle věku a pohlaví. Dále byli pacienti rozděleni na dvě podskupiny dle LL; 1. LL < 2 cm³: 140 pacientů, a LL > 5 cm³: 80 pacientů; a byl korelován T2 mezi oběma skupinami spárovanými dle věku.

Výsledky:
Prokázali jsme statisticky významné zvýšené ukládání železa u pacientů s RS proti kontrolám v ncl. caudatus oboustranně (vlevo p = 0,004; vpravo p = 0,033) a v levém putamen (p = 0,006). V talamech dle našich měření dochází k prodlužování T2. Korelace LL s T2 prokázala, že ve skupině s LL< 2 cm³ je zkracování T2 statisticky významnější než u pacientů s LL > 5 cm³ v putamen oboustranně (vlevo p < 0,001; vpravo p = 0,006).

Závěry:
Zjistili jsme, že u pacientů s RS dochází v bazálních gangliích k většímu ukládání železa než u zdravých kontrol. Dále jsme zjistili, že v podskupině tzv. nízkoobjemových RS (dle LL) je ukládání železa v bazálních gangliích větší než v podskupině vysokoobjemových RS. Změny obsahu železa v mozku podporují hypotézy o neurodegenerativní složce nemoci.

Klíčová slova:
roztroušená skleróza – železo – magnetická rezonance – T2 relaxometrie

Úvod

Z tradičního pohledu je roztroušená skleróza (RS) autoimunitně vázaný chronický zánět centrálního nervového systému (CNS) vedoucí k demyelinizaci bílé hmoty. Novější poznatky ukazují, že již od počátku dochází také k axonálním ztrátám, které se projeví později, až se vyčerpají rezervy CNS, a jsou příčnou ireverzibilních neurologických změn [1]. RS je dnes považována za globální onemocnění CNS, které zahrnuje změny zánětlivé, demyelinizační a degenerativní včetně mozkové atrofie [2].

MR se stala nejvýznamnějším paraklinickým nástrojem pro diagnostiku RS. Široké užití MR ale postupně ukázalo, že na konvenční MR viditelná T2, event. FLAIR (fluid‑attenuated inversion recovery) hyperintenzní ložiska často nekorelují s klinickým stavem a průběhem onemocnění. Tato skutečnost se označuje jako klinickoradiologický paradox. Za neurologickými projevy pacientů s RS často stojí změny skrývající se v normálně vyhlížející bílé i šedé hmotě. S cílem postihnout tyto změny se do diagnostiky RS zavádějí nové MR techniky. Tyto metody zahrnují volumometrické zpracování konvenčně získaných MR obrazů: kvantifikace T2 hyperintenzních lézí (LL, lesion load), měření mozkového objemu k detekci atrofie (BPF, brain parechymal fraction) a sledování přítomnosti T2 hypointenzních lézí v šedé hmotě, které bývají malé a při běžném hodnocení často unikají pozornosti. Nové MR techniky dále zahrnují tzv. nekonvenční metody: magnetizační transfer, MR spektroskopii, difuzně vážené obrazy, perfuzně vážené obrazy a funkční MR [3,4].

V poslední době je v literatuře týkající se RS věnována značná pozornost postižení šedé hmoty a T2 hypointenzním ložiskům. Nedávné studie prokazují, že tato ložiska klinicky výrazně korelují s délkou nemoci, klinickým průběhem, stupněm neurologického deficitu a s mozkovou atrofií a jsou mnohem významnějším prediktorem neurologického postižení a klinického vývoje RS než konvenční MR vyšetření [5–7]. Předpokládá se, že podkladem T2 hypointenzit jsou patologická depozita železa [8,9]. Zásobní železo je v mozku ukládáno především ve formě feritinu, to je tzv. bezpečné železo, protože je obklopeno protektivními molekulami proteinu. Toxicita železa se projevuje tehdy, dojde‑li k poškození protektivních molekul či se zvýší podíl volného železa v důsledku nedostatku feritinu v buňkách [10,11]. Volné, nevázané dvojmocné železo je toxické. Neurotoxicita volného železa spočívá v bio­chemické reakci zahrnující tvorbu reaktivních oxidačních produktů cestou železem indukované oxidace hydroxylů. Výsledkem je volný hydroxylový radikál, který je extrémně reaktivní a vede k degradaci bio­molekul a oxi-dační destrukci lipidů důležitých ve struktuře buňky, což může být příčinou apoptózy. Je prokázáno, že k ukládání železa dochází během fyziologického stárnutí mozku [12]. Nadměrné ukládání železa ve strukturách mozku je popisováno u neu­rode­ge­nerativních chorob [13]. Postupně roste zájem na odkrytí úlohy železa a jeho významu u RS. Existují dvě teorie, jak může železo souviset s patofyziologií RS. Za prvé, depozita železa jsou jen jakýmsi vedlejším fenoménem, který doprovází neurodegenerativní změny v šedé hmotě [14,15]. Za druhé, železo je mediátorem neurotoxicity a přímo se účastní patogeneze RS, když podporuje vznik volných radikálů a oxidačního stresu [10].

Jedinou neinvazivní metodou a nástrojem pro detekci zvýšeného ukládaní železa je T2 relaxometrie (T2). Je metodou volby pro stanovení železa v mozku in vivo a umožňuje výpočet koncentrace železa, přestože jen na základě empirické rovnice. T2 relaxometrie se v diagnostice RS řadí k nekonvenčním kvantitativním metodám, které umožňují detekovat změny v normálně vyhlížející mozkové tkáni, jež unikají konvenčním technikám MR [16].

Cílem naší práce je cestou T2 relaxometrie ověřit hypotézu, že u pacientů s RS se v centrální šedé hmotě hromadí železo více než u zdravých kontrol. Za předpokladu, že zvýšená depozita železa jsou podkladem T2 hypointenzit v šedé hmotě popisovaných u RS, zkracování T2 relaxačního času může detekovat ukládání železa ještě před těmito MR viditelnými projevy.

Dalším cílem je stanovit, jak souvisí hodnoty T2 v měřených strukturách s dalším kvantitativně stanovovaným parametrem u RS, s celkovým objemem ložisek v bílé hmotě (LL, lesion load). Zatímco zkracování T2 reprezentuje neurodegenerativní složku RS, LL je odrazem zánětlivé složky RS.

Soubor a metodika

Celkem bylo vyšetřeno 347 nemocných:122 mužů (průměrný věk 37,3 ± 11,8 roků; medián 35,3) a 225 žen (průměrný věk 37,1 ± 11,9 roků; medián 34,3) z klinické databáze pacientů s RS v centru pro RS Neurologické kliniky VFN v Praze (tab. 1). Všichni pacienti měli klinicky definitivní RS, relaps remitentní formu. Dále byl analyzován podsoubor 287 pacientů s RS, u kterých byly naměřeny hodnoty LL (z toho: 138 s hodnotami LL < 2 cm³; 79 s hodnotami LL > 5 cm³, a zbývajících 70 v rozmezí 2 cm³ ≤ LL ≤ 5 cm³). Vedle pacientů s RS byla vyšetřena skupina 117 kontrol: 42 mužů (průměrný věk 38,4 ± 14,6 roků; medián 35,2) a 75 žen (průměrný věk 37,5 ± 12,9 roků; medián 34,3), kteří byli vyšetřeni ve stejném protokolu. Byli z řad zdravých dobrovolníků doplněných o pacienty s jinou diagnózou než RS, u nichž nebylo podezření na možné změny v metabolizmu železa (většinou byli vyšetřováni pro migrénu).

Vyšetření byla provedena na magnetické rezonanci Gyroscan NT 1,5T firmy Philips, použita byla standardní kvadratická hlavová cívka. Vyšetřovací protokol vždy zahrnoval: T1 vážené obrazy (T1WI), sekvenci FLAIR a difuzně vážené obrazy (DWI) v transverzálních řezech. Dále sekvenci Multiecho GraSE k výpočtu relaxačního času s těmito parametry: TR 2 633 ms, TE 20 ms, flip angle (FA) 90st., FOV 230 × 183, tloušťka vrstvy (THK)3,00/0mm. Během každého vyšetření byly tedy hodnoceny následující parametry: 1. Objem hyperintenzních lézí (LL) 2. Stanovení relaxačního času ve vybraných strukturách centrální šedé hmoty.

Objem plak RS (LL) byl v MR stanoven automaticky s pomocí softwaru speciálně vytvořeného k tomuto účelu na našem pracovišti [17,18]. Pro měření objemu plak byla použita sekvence FLAIR s následujícími parametry: TR 11 000 ms, TE 140 ms, TI 2 600 ms, FA 90 st., FOV 256 × 256, THK 1,5/0mm.

K relaxometrii jsou potřeba minimálně dvě echa, ze kterých se vypočítá T2 relaxační čas z rovnice Int = A × exp (–TE / t₂), kdy Int je intenzita signálu. Tato formule je výsledkem řešení tzv. Blochových rovnic, kde A je konstanta úměrná koncentraci protonů v daném místě, TE je time to echo nastavovaný pro použitou sekvenci a t₂ je žádaný relaxační čas. Parametry: použili jsme 5 ech s TE odstupňovaným po 20 ms (20, 40, 60, 80, 100 s). Schéma sekvence je tedy následující: po 90° RF pulzu následuje v našem případě pět 180° pulzů. Po každém tomto pulzu se vytvoří echo, které je dále rozbito třemi gradientními pulzy na tři podecha. Z toho vyplývá, že na jeden 90° pulz bylo sebráno 25 řádků k prostoru. Při použití této sekvence je klesání signálu prakticky exponenciální, a je tedy vhodná k výpočtu T2 relaxačního času.

Řada studií in vitro [19,20] a in vivo [21–23] prokázala silnou korelaci mezi T2 relaxačním časem a koncentrací železa především v šedé hmotě, což bylo podpořeno histologickými studiemi mozku. Dle publikovaných údajů je T2 relaxační čas lineárně závislý na koncentraci železa ve tkáni [24,25]. Empirická rovnice byla odvozena z výpočtů závislosti koncentrace železa v bazálních gangliích na věku a závislosti T2 relaxačního času (T2) na věku. Koncentrace železa (Fe) v (mg Fe/100g tkáně) je dána rovnicí: (Fe) = 3,7/T2 – 35,8.

T2 jsme měřili ve vybraných strukturách centrální šedé hmoty oboustranně, a to v bazálních gangliích (caput nuclei caudati, putamen) a v talamu. Do centra těchto struktur jsme pro účely měření manuálně umístili měřící objem (ROI, region of interest). V tomto objemu potom program automaticky vypočítával T2. Důvodem, proč jsme zvolili právě tyto struktury, byla jejich dostatečná velikost, dobře definované hranice a potenciální důležitost jak pro kognitivní, tak motorické funkce mozku [26].

Statistická analýza

Prostřednictvím korelačních matic (Pearson, Spearman) byla provedena analýza struktury závislostí mezi T2 relaxačními časy a věkem ve skupinách pacientů s RS a ve skupině kontrolní (pacienti i kontrolní skupina byli rozděleni dle pohlaví) a dále v podskupinách pacientů s RS rozdělených dle LL. Byly testovány rozdíly mezi jednotlivými skupinami (t‑testy, Kruskal‑Wallisův a párový Friedmannův test), porovnávány rozdíly směrnic přímek závislosti T2 na věku mezi jednotlivými skupinami a vypočítávány příslušné p‑hodnoty. Byl použit výpočet přes ANOVU. Ve všech použitých testech byla hodnota p < 0,05 považována za statisticky významnou. Výpočty byly provedeny prostřednictvím statistického programu SPSS verze 16.0, grafická zobrazení v SW Statistica 8.0.

Výsledky

1. Ověřili jsme, že v bazálních gangliích se T2 relaxační čas zkracuje s věkem během normálního stárnutí. To se potvrdilo na hladině statistické významnosti u putamen bez ohledu na pohlaví a mozkovou hemisféru (pro muže vlevo p = 0,010; R = –0,395; vpravo p = 0,034, R = –0,328; pro ženy vlevo p = 0,008; R = –0,305; vpravo p = 0,032; R = –0,248) a u ncl.caudatus pro zdravé ženy oboustranně (vlevo p = 0,023; R = –0,262; vpravo p = 0,010; R = –0,297); pro zdravé muže byly výsledky statisticky nevýznamné, pravděpodobně z důvodu nižšího výběrového rozsahu podsouboru mužů. Pro oblast talamu se T2 relaxační časy s věkem naopak prodlužovaly.
2. Dále jsme zjistili, že rozdíly v T2 relaxačním čase mezi pohlavím jsou ve skupinách pacientů s RS i zdravých jednotlivců statisticky nevýznamné. Obdobně nevýznamné jsme shledali i rozdíly mezi RS a kontrolami na úrovni jednotlivých pohlaví. (Jedinou výjimku tvoří rozdíl mezi RS a kontrolami pro levé ncl. caudatus u žen [F(1,298) = 5,160; p = 0,024], což může být ale rovněž důsledkem významnějšího zastoupení žen v celém souboru.)
3. Prokázali jsme, že se u pacientů s RS ukládá železo v centrální šedé hmotě (v bazálních gangliích) více než u kontrol. Z důvodu závislosti T2 relaxačního času na věku během normálního stárnutí jsme při srovnávání pacientů s RS a kontrol museli zaručit stejné věkové rozložení. Předpoklad zvýšeného ukládání železa proti kontrolní skupině se na hladině statistické významnosti potvrdil v levém ncl. caudatus (p = 0,004; R² = 0,17), v pravém ncl. caudatus (p = 0,033; R² = 0,11), v levém putamen (p = 0,006; R² = 0,22). U talamů se T2 relaxační časy v závislosti na věku u RS pacientů stejně jako u zdravých kontrol naopak prodlužovaly (tab. 2).
4. Dalším úkolem bylo zjistit vztah meziT2 relaxačním časem a LL, další kvantita-tivně měřenou hodnotou u skupiny 287 pa-cientů s RS (podskupina s nízkým LL < 2 cm³ a podskupina s velkým LL > 5 cm³), ostatní (LL: 2 cm³ ≤ LL ≤ 5 cm³) byli ze srovnávání vyloučeni. Porovnávali jsme rozdíly směrnic přímek závislosti T2 na věku ve vybraných strukturách v obou definovaných podskupinách, pacienti byli věkově spárováni. Zjistili jsme statisticky významnou rozdílnost hodnot u putamen oboustranně, vlevo (p < 0,001; R² = 0,30) (graf 1), vpravo (p = 0,006; R² = 0,17), hraniční statistická významnost byla u ncl. caudatus vpravo (p = 0,054; R² = 0,15); (tab. 3).
5. Na úrovni bilaterálních dvojic měřených struktur byla testována stranová asymetrie. Statisticky významné rozdíly, které svědčily pro predilekční zkracování T2 relaxačního času vlevo, byly zjištěny mezi dvojicí ncl. caudatus u kontrol [pro muže T(41) = 3,071; p = 0,001; pro ženy T(74) = 4,994; p < 0,001] a u pacientů s RS u žen [pro muže T(121) = 0,958; p = 0,340; pro dvě ženy T(224) = 3,071; p < 0,002]. Dále pro ncl. caudatus ve skupině LL < 2 cm³ [T(139) = 2,954; p = 0,004] a u dvojice putamen (vlevo vs vpravo) ve skupině LL > 5 cm³ [T(79) = –2,879; p = 0,005]). Tyto výsledky byly ověřeny ještě neparametrickými testy (Friedmann, Wilcoxon), protože hodnoty veličiny T2 pro talamus nebyly shledány jako normálně rozdělené.

Ověření přesnosti metody

Chyba stanovení T2 relaxačního času jezatím poměrně vysoká. Na souboru 33 pa-cientů, kteří měli tři vyšetření krátce po sobě během jednoho roku, a 120 pacientů, u kterých proběhla dvě měření během jednoho roku, jsme ověřili, že chyba měření je okolo 3%. Měření T2 je třeba dále propracovat; tuto chybu by bylo potřeba snížit alespoň na 0,5%, aby se dalo vyjadřovat k jednotlivým pacientům.

Diskuze

V poslední době výrazně vzrostl zájem o odkrytí úlohy a významu železa v patofyziologii RS. Podíl železa v mozku se zvyšuje s věkem v souvislosti s fyziologickým stárnutím mozku [27], což potvrdily i naše výsledky. Zvýšená depozita železa v mozku byla popsána u mnoha neurodegenerativních chorob: u Alzheimerovy choroby [28–31], u Parkinsonovy choroby [32–35] a dalších, jako Huntingtonova chorea [36,37], Hallervorden‑Spatzova nemoc [38]. Důkazy o přítomnosti železa u těchto chorob vedly k úvahám o možném podílu železa i u jiných onemocnění, která by mohla zahrnovat oxidační stres, např. epilepsie [39]. Ně­kte­ré práce v poslední době poukazují na zvýšenou akumulaci železa také u RS [40,41], což pravděpodobně souvisí s neurodegenerativní komponentou nemoci, která v tradičním pojetí byla především autoimunitně zánětlivá. Předpokládá se, že u pacientů s RS jsou korelátem depozit železa T2 hypointenzity v šedé hmotě. Četné studie prokázaly spojení mezi T2 hypointenzitami, poškozením šedé hmoty a klinickým stavem pacientů. T2 hypointenzity byly v mnohem těsnějším vztahu s tíží klinických projevů než konvenčně měřené léze [6,16,42–44].

Za předpokladu, že za zkracování T2 relaxačního času jsou zodpovědná depozita železa, prověřila naše měření metodou MR relaxometrie hypotézu a podala kvantitativní důkaz, že u pacientů s RS dochází v bazálních gangliích (ncl. caudatus, putamen) k většímu ukládání železa než u zdravých kontrol. Železo jsme detekovali v normálně vyhlížející tkáni, tedy ještě před vznikem na MR viditelných T2 hypointenzit. Ukládání železa se nepotvrdilo v případě obou talamů, zde se T2 relaxační časy s věkem naopak prodlužovaly, a to u zdravých kontrol i u pacientů s RS. Talamus se svým složením liší od bazálních ganglií [45], obsahuje více myelinu či může obsahovat drobné kapičky vody (likvoru). Dle našich pozorování se u pacientů s RS v talamu, na rozdíl od bazálních ganglií, poměrně často vyskytují T2 hyperintenzní ložiska, jejichž podkladem může být edém, demyelinizace či zánět, které výrazně ovlivňují hodnotu T2 relaxačního času.

Dále je zajímavá levostranná predilekce pro ukládání železa. Statisticky významné rozdíly, které svědčily pro predilekční zkracování T2 relaxačního času vlevo, byly zjištěny mezi dvojicí ncl. caudatus u kontrol pro muže (p = 0,001), pro ženy (p < 0,001) a u pacientů s RS u žen (p < 0,002). Předpokládáme, že by to mohlo souviset s dominancí levé hemisféry, která je funkčně více zatížena, což dokládají i naše zkušenosti s výsledky funkční MR, a tedy i její potřeba oxygenace je větší.

Korelace LL s měřenými T2 relaxačnímičasy prokázala, že u tzv. nízkoobjemových(low LL) RS, u nichž je objem na MR viditelných T2, resp. FLAIR hyperintenzních ložisek malý (LL < 2 cm³), je klesánírelaxačního času významnější než u vysokoobjemových (high LL) RS, kde objem na MR viditelných ložisek je velký (LL > 5 cm³). Statisticky významná rozdílnost hodnot T2 relaxačních časů mezi oběma podskupinami byla na úrovni putamen oboustranně, vlevo (p < 0,001), vpravo (p = 0,006), hraniční statistická významnost byla u ncl. caudatus vpravo (p = 0,054). Pokud vycházíme z předpokladu, že nadměrné ukládání železa v ncl. caudatus a putamen reprezentuje neurodegenerativní složku onemocnění RS [6,16,41–44], vyplývá z našich výsledků, že nedá‑li se klinický stav, to znamená stejná manifestace choroby, vysvětlit MR viditelnými zánětlivými plaky, snad by se dala vysvětlit právě neurodegenerativními změnami, jejímž měřitelným výsledkem je mimo rozvoj atrofie i zkracování T2. Tento výsledek podporuje naši práci o stratifikaci pacientů dle MR kritérií – LL a brain parenchymal fraction (BPF), na ty s převážně zánětlivou složkou a na ty převážně degenerativní [46], a navazuje na ni. Je dalším důkazem, že RS je multifaktoriální a komplexní patologický proces a že neurodegenerativní změny mohou hrát u ně­kte­rých pacientů v etiologii onemocnění významnou roli. Vztah T2 a míry atrofie a vztah T2 a klinického stavu bude předmětem dalšího zkoumání.

Je možné, že do skupiny převážně neurodegenerativní budou patřit ti pacienti, kteří dostatečně neodpovídají na konvenční, především protizánětlivě zaměřenou terapii. Všechna tato snažení postihnout neurodegenerativní složku RS by nakonec mohla vést ke stanovení léčebné strategie u převážně neurodegenerativních pacientů, u kterých by se prokázala zvýšená akumulace železa. Pokud předpokládáme abnormální depozita železa jako podklad zkrácení T2 relaxačního času a T2 hypointenzit v šedé hmotě a pokud připustíme teorii, že železo podporuje vznik volných radikálů, je mediátorem neurotoxicity a přímo se podílí na patofyziologii RS, pak by se otevřela zcela nová možnost terapeutického ovlivnění RS. V současně době je u neurodegenerativních chorob sledována terapie cheláty, které vážou volné železo či antioxidanty, což se již zkoušelo ve studiích na zvířatech [39,47,48]. Je teoreticky možné, že by se v budoucnu tato terapie mohla aplikovat u části nemocných s RS.

Poděkování: Tato studie byla podpořena granty ministerstva zdravotnictví MZO/VFN2005 a MSMTO21620849. Dále děkujeme statistikovi RNDr. Jaromíru Běláčkovi, Ph.D., za technickou podporu.

Přijato k recenzi: 11. 6. 2009

Přijato do tisku: 29. 9. 2009

MUDr. Andrea Burgetová

Radiodiagnostická klinika 1. LF UK a VFN v Praze

Kateřinská 30

128 08 Praha 2

e-mail: andrea.burgetova@vfn.cz