Výskyt mutácií v géne Leucine rich repeat kinase 2 u pacientov s Parkinsonovou chorobou na Slovensku

The Incidence of Mutation on the Leucine-rich Repeat Kinase 2 Gene in Patients with Parkinson’s Disease in Slovakia

Introduction:
The objective of this study was to determine the prevalence of LRRK2gene mutations in Slovak PD patients. Patients and methods: 126 PD patients (78 men, 48 women) were included in the study. The average age of this population was 57 years. Twenty-four patients (19.1%) reported a positive family history of parkinsonism; Hoehn-Yahr stage was between 1 and 5 (mean 2.6). There were 19 patients with early-onset parkinsonism (beginning before the age of 45) in the group. All subjects were screened for selected exons in the LRRK2 gene by means of dHPLC analysis. Exons 31, 35, 41 and 48 we examined. Results: From a total of 126 samples, one exonic and four intronic polymorphisms in the exon 48 and one intronic polymorphism in exon 35 of the LRRK2 gene were detected. No common pathogenic mutations were found. Conclusion: The study indicates that the most common mutations in the LRRK2 gene do not play an important role in the aetiology of Parkinson’s disease in central Europe. This has also been shown by previous studies. It must be emphasized that the overall sample size is relatively small, particularly for the familial PD cases.

Key words:
Parkinson´s disease – genetics – LRRK2 – mutation – polymorphism

Autoři: K. Kračunová ¹; M. Kovačovicová ²; M. Baldovič ²; P. Valkovič ^3,4; Ľ. Kádaši ²; J. Benetin ¹
Působiště autorů: Neurologická klinika SZU a UN Bratislava ¹; Katedra molekulárnej biológie PriF UK v Bratislave ²; II. Neurologická klinika LF UK a UN Bratislava ³; Ústav normálnej a patologickej fyziológie SAV, Bratislava ⁴
Vyšlo v časopise: Cesk Slov Neurol N 2011; 74/107(4): 443-445
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Cieľ:
Cieľom našej štúdie bolo zistiť prevalenciu mutácií v génoch LRRK2 a u pacientov s Parkinsonovou chorobou. Súbor a metódy: Do štúdie bolo zaradených 126 pacientov s diagnózou idiopatickej Parkinsonovej choroby (78 mužov, 48 žien). Priemerný vek v súbore v čase začiatku ochorenia bol 57 rokov. Pozitívnu rodinnú anamnézu parkinsonizmu udávalo 24 pacientov (19,1 %). Hoehn-Yahr štádium našich pacientov bolo 1–5 (priemer 2,6). V skupine sa nachádzalo 19 pacientov s young onset parkinsonizmom (začiatok ochorenia pred 45. rokom života). Na detekciu najčastejších mutácií v génoch LRRK2 sme využili skríningovú metódu dHPLC. Analyzovali exóny 31, 35, 41 a 48. Výsledky: Detegovali sme jeden exónický a štyri intrónické polymorfizmy v exóne 48 a jeden intrónický polymorfizmus v exóne 35 LRRK2 génu. Z najčastejších patogenetických mutácií nebola u našich pacientov identifikovaná žiadna. Záver: Naša štúdia naznačuje, že najčastejšie popisované mutácie v géne LRRK2 nepredstavujú závažný faktor v etiológii Parkinsonovej choroby v strednej Európe, čo bolo preukázané aj výskumom v okolitých krajinách.

Klíčová slova:
Parkinsonova choroba – genetika – LRRK2 – mutácia – polymorfizmus

Úvod

V etiológii Parkinsonovej choroby (PCH) sa uplatňuje vplyv environmentálnych faktorov v kombinácii s určitou genetickou predispozíciou. V súčasnosti je známych 16 lokusov, v ktorých boli identifikované mutácie zodpovedné za monogénne podmienenú PCH [1]. V roku 2002 bola ako príčina autozomálne dominantnej (AD) formy PCH identifikovaná mutácia v géne leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2). Gén sa nachádza v oblasti centroméry 12. chromozómu. Jedná sa o veľký gén s 51 exónmi kódujúcich 2 527 aminokyselín. Kódovaný proteín je nazývaný aj dardarín (názov odvodený z baskitského „dardara“ – tras) [2,3].

Parkinsonova choroba asociovaná s LRRK2 mutáciou je zaujímavá z viacerých hľadísk. Jedná sa o mutáciu, ktorá je frekventná a zároveň prítomná u pacientov s príznakmi typickej Parkinsonovej choroby (vrátane veku začiatku ochorenia) a bola detegovaná ako u pacientov s familiárnou, tak aj so sporadickou formou ochorenia [2,4]. Podľa dostupných štúdií, LRRK2 mutácie zodpovedajú približne za 10 % AD formy PCH, čím reprezentujú doteraz najčastejšiu známu genetickú príčinu ochorenia [5]. Penetrancia mutácií u nositeľov je inkompletná a vekovo dependentná, varíruje od 17–85 %, čím sa môže vysvetliť jej výskyt u pacientov so sporadickou PCh a zriedkavo aj v kontrolných skupinách [5,6]. Cieľom našej štúdie bolo zistiť prevalenciu mutácií v géne LRRK2 u pacientov s idiopatickou Parkinsonovou chorobou s familiárnou aj sporadickou formou ochorenia v našej populácii.

Súbor a metódy

Do štúdie bolo zaradených 126 pacientov s dg. idiopatickej Parkinsonovej choroby. Pacienti pochádzali z dispenzára ambulancie pre extrapyramídové ochorenia CNS II. Neurologickej kliniky Univerzitnej nemocnice Bratislava. Diagnóza bola stanovená na základe UK Parkinson’s disease Brain Bank kritérií. Za pozitívnu rodinnú anamnézu bol považovaný anamnestický údaj o diagnostikovanom/liečenom príbuznom s Parkinsonovou chorobou, nejasné a nejednoznačnú údaje, resp. zmienky o „trase“ u príbuzného neboli brané do úvahy. Všetci pacienti pred zaradením do štúdie podpísali informovaný súhlas.

Na detekciu najčastejších mutácií alebo polymorfizmov v géne LRRK2 sme využili skríningovú metódu dHPLC (denaturating high performance liquid chromatography). Na analýzu sme vybrali štyri exóny tohto génu; exón 31, 35, 41 a 48. Predchádzajúcimi štúdiami boli v týchto exónoch identifikované patogenické mutácie, zodpovedné za vznik ochorenia. V exóne 31 sú to dve patogenické mutácie, R1441C a R1441G, v exóne 35 Y1699C mutácia a v exóne 41 G2019S a I2020T mutácie. Ďalšia patogenická mutácia v tomto exóne I2020T bola doteraz identifikovaná len v niekoľkých rodinách. Exón 48 sme vybrali na základe častého výskytu mutácií 7155A>G a G2385R. Exóny LRRK2 génu boli amplifikované PCR reakciami s použitím vopred navrhnutých primerov. Primery boli navrhnuté pomocou Primer3 softvéru (http://frodo.wi.mit.edu) tak, aby ohraničovali celé exónové sekvencie a časť intrónovej sekvencie. Genomická DNA bola izolovaná z leukocytov periférnej krvi použitím Gentra Puregene Blood Kit (QIAGEN Sciences, USA). Všetky PCR reakcie prebiehali v GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, USA) a XP Cycler (Bioer Technology, China). Analýza dHPLC bola prevedená na prístroji Transgenomic WAVE 3500 System vybavenom DNASep column (Transgenomic, UK). dHPLC chromatogramy sme analyzovali pomocou Navigator software. Vzorky poukazujúce na prítomnosť heteroduplexov sme následne overovali sekvenovaním. Sekvenačné reakcie sme uskutočňovali pomocou BigDye Terminator v1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, USA), s využitím štandardného protokolu doporučeného výrobcom. Sekvenačné dáta boli spracované pomocou Sequencing Analysis Software v5.2 (Applied Biosystems, USA). Za účelom charakterizácie nukleotidových zmien sme získané elektroforetogramy porovnávali s referenčnou sekvenciou použitím Chromas software (Technelysium, Australia).

Výsledky

V súbore sa nachádzalo 78 mužov a 48 žien. Priemerný vek pacientov v súbore v čase začiatku ochorenia bol 57,6 roka (± 11,12 SD). Priemerné Hoehn--Yahr štádium bolo 2,6 (1–5). Pozitívna rodinná anamnéza parkinsonizmu bola prítomná u 24 pacientov, čo predstavuje 19,05 %. V skupine sa nachádzalo 19 pacientov (15,08 %) s young onset PCH (vek začiatku ochorenia pred 45. rokom života).

Fenotypovo bol najčastejšie prítomný ekvivalentný typ parkinsonizmu – 67 pacientov, u 46 sme zaznamenali akineticko-rigidný fenotyp ochorenia. Najmenej zastúpeným bol tremor-dominantný fenotyp – 13 pacientov. Všetci pacienti vykazujú dobrú levodopa responzivitu, pričom u 53 pacientov (42,06 %) sú v súčasnosti prítomné neskoré motorické komplikácie liečby.

V exóne 31 a 41 LRRK2 génu sme nezaznamenali žiadne mutácie ani polymorfizmy. Analýzou exónu 35 sme nenašli patogenickú mutáciu Y1699C, ani sme neobjavili nové varianty v kódujúcej oblasti. Naproti tomu sme identifikovali prítomnosť intrónického polymorfizmu IVS35+23T>A. Heterozygotný variant bol prítomný u 52 vzoriek (41,27 %) a homozygotná forma sa nachádzala v 17 vzorkách (13,49 %). Vo fenotype ochorenia u pacientov s homozygotným a heterozygotným variantov sme nenašli žiadne rozdiely. Vykazujú v priemere rovnaký vek začiatku ochorenia (57 rokov), klinicky je prítomný typický parkinsonizmus. V exóne 48 LRRK2 génu sme detegovali jeden exónický (c.7155A>G, p.G2385G) a štyri intrónické varianty (IVS47-91insGCCAT, IVS47-91insGCAT, IVS47-41A>G, IVS47--9delT). Varianty v exóne 48 LRRK2 génu boli celkovo identifikované v 106 vzorkách (84,13 %).

Diskusia

V exóne 31 LRRK2 génu boli doteraz zaznamenané tri mutácie: R1441C, R1441G a R1441H. My sme však analýzou dHPLC nenašli žiadne variantné vzorky. Mutácia R1441G bola doteraz zaznamenaná iba v baskickej populácii zo severného Španielska, avšak jej podiel predstavuje až 8 % u pacientov s PCH [7]. Mutácia R1441C bola zaznamenaná aj v talianskej populácii u dvoch pacientov (3,4 %) [8]. Tretia R1441H mutácia sa vyskytuje sporadicky u pacientov z rôznych etnických skupín [9]. V exóne 41 LRRK2 génu sme nenašli žiadnu patogenickú mutáciu alebo polymorfizmus. Mutácia G2019S, ktorá je najčastejšou príčinou či už sporadických alebo familiárnych prípadov PCH s AD spôsobom dedičnosti, nebola v našom analyzovanom súbore detegovaná. Táto mutácia bola iniciálne asociovaná so 6–7 % familiárnych foriem PCH európskeho pôvodu [10,11] a s dvoma percentami sporadických foriem [12]. Odvtedy množstvo štúdií preukázalo, že frekvencia mutácie G2019S výrazne závisí od geografického pôvodu a etnika študovaných populácií. Vysoká frekvencia mutácie bola dokázaná v severoafrickej arabskej populácii, kde u familiárnej formy dosahuje až 37 % [13], u Židov rodu Aškenazi sa vyskytuje v 30 % u familiárnej formy a v 13 % u sporadickej [14]. V európskych populáciách je relatívne frekventná v Španielsku, Portugalsku a Taliansku (6–7 %), nižší výskyt mutácií bol dokázaný v severnej Európe a v severnej Amerike (0,5–5 %) [12,15,16] a najnižší v Ázii (< 0,1 %) [5]. Z okolitých krajín sa výskyt tejto mutácie nepotvrdil v rakúskej štúdii so 162 pacientmi [17], poľská štúdia so 174 pacientmi mala rovnaký výsledok [18]. V českej štúdii so 45 pacientmi s young onset PCH bola identifikovaná mutácia G2019S u jedného pacienta [19]. Analýzou exónu 35 LRRK2 génu sme nenašli patogenickú mutáciu Y1699C, ani sme neobjavili nové varianty v kódujúcej oblasti. Y1699C mutácia bola doteraz zaznamenaná iba v niekoľkých rodinách [20,21]. Naproti tomu sme identifikovali prítomnosť intrónického polymorfizmu IVS35+23T>A. Heterozygotný variant bol prítomný u 52 vzoriek, čo predstavuje 41,27 % a homozygotná forma sa nachádzala v 17 vzorkách (13,49 %). V exóne 48 LRRK2 génu sme detekovali jeden exónický (G2385G) a štyri intrónické varianty (IVS47-91insGCCAT, IVS47-91insGCAT, IVS47-41A>G, IVS47--9delT). Z týchto variantov boli doteraz popísané intrónické polymorfizmy IVS47--41A>G a IVS47-9delT. IVS47-41A>G bol nájdený vo frekvencii 0,8 % [11]. Vzťah IVS47-9delT k ochoreniu je nejasný. 7155A>G substitúcia v exóne predstavuje tichú mutáciu, ktorá zachováva pôvodnú aminokyselinu, G2385G. Bola zaznamenaná u pacientov s PCH s frekvenciou 10,8 %, no vyskytovala sa aj v kontrolných vzorkách [11]. IVS47-91insGCCAT a IVS47-91insGCAT predstavujú nové polymorfizmy v intróne pred 48. exónom, ich asociácia s PCH však musí byť potvrdená ďalšími štúdiami. Pacienti s identifikovanými polymorfizmami v exónoch 35 a 48 LRRK 2 génu v našej skupine sa klinicky neodlišujú od bežnej populácie pacientov s Parkinsonovou chorobou. Vykazujú priemerne typický vek začiatku ochorenia, rovnako aj typický fenotyp ochorenia, dobrú responzivitu na liečbu levodopou či motorické komplikácie liečby.

Naša štúdia naznačuje, že najčastejšie popisované mutácie v géne LRRK2 nepredstavujú závažný faktor v etiológii Parkinsonovej choroby v strednej Európe, čo bolo preukázané aj výskumom v okolitých krajinách. V súčasnosti pokračujeme v štúdii na väčšom počte pacientov.

Záver

Fakt, že sme nenašli žiadnu doteraz identifikovanú patogenickú mutáciu, môže vysvetľovať viacero dôvodov. Okrem LRRK2 génu sú za vznik ochorenia zodpovedné aj iné doteraz identifikované gény. Aj keď mutácie v týchto génoch sú v porovnaní s mutáciami v LRRK2 géne zriedkavejšie, nemožno vylúčiť ich výskyt v slovenskej populácii. Okrem toho existuje veľa ďalších lokusov, ktoré sú pravdepodobne asociované s PCH. Navyše etiológia Parkinsonovej choroby je zrejme multifaktoriálna a väčšinu činiteľov podieľajúcich sa na jej vzniku v súčasnosti nedokážeme určiť.

Štúdia bola realizovaná na základe grantu Slovenskej neurologickej spoločnosti, ktorý podporila spoločnosť NOVARTIS Slovensko a grantu agentúry VEGA 2/0055/09

doc. MUDr. Ján Benetin, CSc.
Neurologická klinika SZU a UN Bratislava
Ružinovská 26
826 06 Bratislava
e-mail: benetin@stonline.sk

Prijaté k recenzii: 22. 7. 2010
Prijaté do tlače: 17. 2. 2011

Zdroje

1. Lohmann K, Klein C. Genetics of Parkinson’s disease. Continuum: lifelong learning in neurology. Neurogenetics 2008; 14(2): 90–113.

2. Gasser T. Update on the genetics of Parkinson’s disease. Mov Disord 2007; 22 (Suppl 17): S343–S350.

3. Fiala O, Růžička E. Genetika Parkinsonovy nemoci. Cesk Slov Neurol N 2009; 72/105(5): 419–428.

4. Wider C, Wszolek ZK. Clinical genetics of Parkinson’s disease and related disorders. Parkinsonism Relat Disord 2007; 13 (Suppl 3): S229–S232.

5. Bonifati V. Genetics of Parkinsonism. Parkinsonism Relat Disord 2007; 13 (Suppl 3): S233–S241.

6. Farrer MJ. Genetics of Parkinson’s disease, paradigm shifts and future prospects. Nat Rev Genet 2006; 7(4): 306–318.

7. Paisan-Ruíz C, Jain S, Evans EW, Gilks WP, Simón J,van der Brug M et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK 8-linked Parkinson’s disease. Neuron 2004; 44(4): 601–607.

8. Di Fonzo A, Wu-Chou YH, Lu CS, van Doeselaar M, Simons EJ, Rohé CF et al. A common missense variant in the LRRK 2 gene, Gly2385Arg, associated with Parkinson’s disease in Taiwan. Neurogenetics 2006; 7(3): 133–138.

9. Ross OA, Wu YR, Lee MC, Funayama M, Chen ML, Soto AI et al. Analysis of LRRK2 R1628P as a risk factor for Parkinson‘s disease. Ann Neurol 2008; 64(1): 88–92.

10. Nichols WC, Pankratz N, Hernandez D, Paisan-Ruiz C, Jain S, Halter CA et al. Genetic screening for a single common LRRK 2 mutation in familial Parkinson’s disease. Lancet 2005; 365(9457): 410–412.

11. Di Fonzo A, Rohé CF, Ferreira J, Chien HF, Vacca L, Stocci F et al. A frequent LRRK 2 gene mutation associated with autosomal dominant Parkinson’s disease. Lancet 2005; 365(9457): 412–415.

12. Gilks WP, Abou Sleiman PM, Gandhi S, Jain S, Singleton A, Lees AJ, Shaw K et al. A common LRRK 2 mutation in idiopathic Parkinson’s disease. Lancet 2005; 365(9457): 415–416.

13. Lasage S, Dürr A, Brice A. LRRK 2 – gène majeur de la maladie de Parkinson dans les pays du Magreb. Med Sci (Paris) 2006; 22(5): 470–471.

14. Ozelius LJ, Senthil G, Saunders Pulman R, Ohmann E, Deligtisch A, Tagliati M et al. LRRK 2 G2019S as a cause of Parkinson’s disease in Ashkenasi Jews. New Engl J Med 2006; 354(4): 424–425.

15. Ferreira JJ, Guedes LC, Rosa MM, Coelho M, van Doeselaar M, Schweiger D. High prevalence of LRRK 2 mutations in familial and sporadic Parkinson’s disease in Portugal. Mov Disord 2007; 22(8): 1194–1201.

16. Kachergus J, Mata IF, Hulihan M, Taylor JP, Lincoln S, Aasly J et al. Identification of a novel LRRK 2 mutation linked to autosomal dominant parkinsonism: evidence of a common founder across European populations. Am J Hum Genet 2005; 76(4): 672–680.

17. Haubenberger D, Bonelli S, Hotzy C, Leitner P, Lichtner P, Samal D et al. A novel LRRK 2 mutation in an Austrian cohort of patients with Parkinson’s disease. Mov Disord 2007; 22(11): 1640–1643.

18. Bialecka M, Hui S, Klodowska-Duda G, Opala G, Tan EK, Drozdik M. Analysis of LRRK 2 G2019S and I2020T mutations in Parkinson’s disease. Neurosci Lett 2005; 390(1): 1–3.

19. Fiala O, Pospisilova L, Prochazkova J, Matejckova M, Martasek P, Novaková L et al. Parkin mutations and phenotypic features in Czech patients with early-onset Parkinson’s disease. Neuro Endocrinol Lett 2010; 31(2): 187–192.

20. Zimprich A, Biskup S, Leitner P, Lichtner P, Farrer M, Lincoln S et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron 2004; 44: 601–607.

21. Khan NL, Jain S, Lynch JM, Pavese N, bou-Sleiman P, Holton JL et al. Mutations in the gene LRRK2 encoding dardarin (PARK8) cause familial Parkinson‘s disease: clinical, pathological, olfactory and functional imaging and genetic data. Brain 2005; 128: 2786–2796.