Exprese DD3^PCA3 (Differential Display Code 3) mRNA ve tkáni prostaty u pacientů s karcinomem prostaty a benigní hyperplazií prostaty

Souhrn

Cíl:
Včasná diagnostika karcinomu prostaty (CaP) je zcela zásadní pro záchyt karcinomu omezeného jen na žlázu s možností následné kurabilní léčby. Prostatický specifický antigen (PSA) je velice dobrý prostředek pro včasnou diagnostiku, ale jeho nevýhodou je nízká pozitivní prediktivní hodnota, jejíž následkem je velké množství zbytečných biopsií. Z tohoto důvodu je potřeba vývoje nových specifičtějších detekčních testů. Jedním ze slibných testů je DD3^PCA3, což je gen kódující pro prostatickou tkáň specifickou mRNA, která je výrazně exprimována ve tkáni CaP. Cílem prezentované práce je vyhodnocení diagnostického potenciálu DD3^PCA3 v detekci CaP stanovením exprese mRNA tohoto genu ve tkáni prostaty u mužů s karcinomem prostaty a benigní hyperplazií prostaty.

Materiál a metoda:
Celkem bylo vyšetřeno 186 pacientů. Ve skupině pacientů s podezřením na karcinom prostaty jsme v rámci biopsie prostaty odebrali vždy jeden vzorek na expresi DD3^PCA3. Na základě histologického vyšetření byli pacienti rozděleni do skupiny s benigní hyperplazií prostaty, celkem 100 pacientů a 86 pacientů s prokázaným karcinomem prostaty (z tohoto počtu byla u 12 pacientů stanovena diagnóza prostatické intraepiteliální neoplazie (PIN)). Byla stanovena celková mRNA a kvantifikována celková exprese DD3^PCA3 a PSA s užitím Q RT PCR metodiky. Poměr PCA3/PSA mRNA byl stanoven u obou skupin pacientů.

Výsledky:
V rámci předložené studie bylo prokázáno, že hladiny exprese mRNA genu DD3^PCA3 (Ct) (hodnoty Ct cyklu), ve kterém dojde ke křížení s přímkou nejnižšího prahu detekce tzv. thresholdu. Čím je hodnota nižší, tím vyšší je množství kopií) ve tkáni prostaty byly signifikantně vyšší (p < 0,045) u pacientů s CaP ve srovnání s pacienty s BPH. Nebyly prokázány signifikantní rozdíly v expresi mRNA pro gen DD3^PCA3 (Ct) mezi skupinami pacientů v závislosti na pokročilosti onemocnění (lokální vs. lokálně pokročilý a metastatický CaP) a v závislosti na Gleasonově skóre (dobře až středně diferencovaný CaP vs. špatně diferencovaný karcinom).

Závěr:
Specificita detekce mRNA DD3^PCA3 ve tkáni je perspektivní metodikou pro detekci CaP a rozlišení pacientů s CaP a BPH.

Klíčová slova:
karcinom prostaty (CaP), benigní hyperplazie prostaty (BPH), DD3^PCA3, mRNA, RT PCR.

Úvod

Karcinom prostaty (CaP) je druhou nejčastější příčinou úmrtí mužů na maligní onemocnění v západních zemích (l). Incidence CaP roste úměrně tomu, jak se zvyšuje průměrný věk obyvatel. V USA je CaP dokonce na prvním místě v četnosti karcinomů (vyjma skvamózního karcinomu kůže). V roce 2006 bylo v USA diagnostikováno 234 460 nových případů CaP a 27 350 amerických mužů zemřelo v přímé souvislosti s tímto onemocněním. V Evropě v roce 2005 bylo nově objeveno 225 227 pacientů s CaP a 83 066 nemocných na CaP zemřelo (2). V České republice bylo v roce 2005 diagnostikováno 4846 nových případů a 1430 mužů na tuto diagnózu zemřelo. Incidence CaP v tomto roce dosáhla 47,8 nových případů 100 000 osob a mortalita byla 13,95 úmrtí v přímé souvislosti na CaP na 100 000 osob. V roce 2005 se stal CaP i v České republice nejčastějším zhoubným nádorem (17 %) u mužů, když předstihl dříve vedoucí nádory plic (16 %) – viz obrázek a tabulka 1 (3).

Časná detekce CaP je založena na měření hladiny PSA (tPSA), digitálním rektálním vyšetření (DRE) s eventuální následnou biopsií prostaty v případě podezření na přítomnost CaP.

Specifický laboratorní test pro detekci CaP není dodnes k dispozici. Sérová hladina prostatického specifického antigenu je v klinické praxi používána již více jak 25 let. Nevýhodou stále zůstává relativně nezanedbatelná míra falešné negativity i pozitivity. Thompson a kolektiv ve své práci (4) konstatují, že neexistuje jasná hladina rozlišující pacienty s BPH od nemocných s CaP, a tudíž je CaP možné detekovat bez ohledu na hladinu PSA včetně hodnot pod 1 ng/ml. S rostoucím PSA se pouze zvyšuje pravděpodobnost zachycení CaP. Na druhou stranu existuje stále velká skupina mužů s vyšší hladinou PSA z jiných důvodů, než je CaP. Tito muži jsou ohroženi vznikem CaP stejně jako jejich vrstevníci v dané věkové skupině, ale tyto nemocné je třeba pečlivě monitorovat pomocí aditivních metodik, jako je PSA velocita (vývoj PSA v čase) nebo stanovení poměru volného k celkovému PSA (f/t PSA), nověji i PSA doubling time. Velká většina mužů s elevovaným PSA podstupuje další rebiopsie prostaty právě z důvodu diagnostické nepřesnosti interpretace hladin PSA (5). V případě, že snížíme horní hranici PSA 2,5 ng/ml, výrazně zvýšíme senzitivitu PSA až na 90 %, ale na druhé straně snížíme specificitu v oblasti „šedé zóny“ pod 25 % (6). Výsledkem je pak poměr 4/5, resp. pouze jeden pacient z pěti bioptovaný pro elevované PSA má pozitivní výsledek histologie. Jinými slovy, 80 % podstoupí biopsii zbytečně. Použití různých forem PSA, zavedení PSA denzity a PSA velocity sice vylepšilo specificitu, ale ne tak ideálně, jak bychom si přáli (7). To je důvod, proč současná lékařská věda hledá další markery detekce CaP. Jedná se jak o klasické biochemické markery, tak nově genově založené markery. Jedná se například PSMA, PC-GEM-1, HK-1 (Human Kalikrein-1), PDEF, prostáza, NKX3.1 nebo právě genově založený DD3^PCA3 (differential displaycode 3) či stanovení exprese specifických mikro RNA.

DD3^PCA3 je zkratka pro (Prostate Cancer Antigene 3, resp. Differential Display Code 3). Jedná se o gen, který je těsně a specificky svázán se vznikem CaP. Jeho funkce není dodnes objasněna a taktéž nebyl nalezen jeho proteinový produkt. Orgánová a nádorová specifičnost jej předurčují jako specifický marker pro CaP. Poprvé byl popsán Bussemarkersem et al. v roce 1999 (8). DD3^PCA3 kóduje pro tkáň prostaty specifickou mRNA, která je zvýšeně exprimována právě v případě CaP (9). První zmínka o potenciálním využití DD3^PCA3 jako možného markeru detekce CaP pochází z roku 2002 z práce publikované de Kokem et al. (10). Další práce hodnotící test mRNA pro DD3^PCA3 gen využívají první generaci semikvantitativních esejí (9, 11, 12). První pro praxi v širším měřítku využitelná assay byla popsána Groskopfem. Tato DD3^PCA3 assay vykazuje kvantifikaci kopií mRNA, dobrou senzitivitu a relativní rychlost a jednoduchost provedení laboratorního testu (13).

Exprese mRNA pro DD3^PCA3 byla v prvních publikacích hodnocena především na tkáňové úrovni (10) a posléze v močovém sedimentu (9, 12), který se ukázal jako vhodný pro širokou klinickou praxi (13). Limitovaný je počet prací zkoumajících expresi DD3^PCA3 v cirkulujících buňkách periferní krve (14). Výsledky těchto studií jsou v protikladu s orgánovou a pro karcinom prostaty specifickou expresí tohoto genu. Není vyloučeno, že do budoucna bude tato metodika vylepšena a bude sloužit k detekci cirkulujících karcinomových buněk v těle pacienta.

RT-PCR (Reverse transcription – Polymerase Chain Reaction) je nejlepší z různých metodik určených k detekci exprese různých genů v biologickém materiálu. Základem kvalitní a výpovědní RT-PCR je dostatek materiálu pro reakci, resp. dostatek tkáně nebo buněk z močového sedimentu. Během testovacího období daných metodik byl hledán tzv. „housekeeping“ gen, který slouží k normalizaci metodiky (housekeeping gen lze vysvětlit jak gen, který kontroluje původ buněk určených pro zpracování v rámci RT-PCR). Pro detekci exprese mRNA pro DD3^PCA3 se používá jako „housekeeping“ genu gen pro PSA (15). Jednou z dalších možných metod kontroly je arteficiální přidání interní exogenní kontroly vzorku se pozornou a postupnou kontrolou RNA extrakce (12).

Přestože dodnes nebyl identifikován žádný gen jako iniciátor časné progrese, v současnosti pro detekci časných stadií nádorů prostaty se zdá být nejvhodnější gen DD3^PCA3.

Materiál a metoda

Charakteristika souboru pacientů a způsob odběru tkáně

Celkem bylo vyšetřeno na Urologické klinice FN v Plzni a na Urologické klinice VFN v Praze 186 pacientů. Náběr biologického materiálu byl proveden v období květen 2006 až září 2008. Materiál byl odebírán u mužů podstupujících biopsii prostaty. Důvodem biopsie byla buď elevovaná hladina PSA, či patologický nález při DRE nebo obojí. Pacienti podstoupili transrektální biopsii prostaty s odběrem minimálně šesti vzorků.

Studie byla schválena lokální etickou komisí FN Plzeň a všichni pacienti podepsali informovaný souhlas. Pacienti po transuretrálních manipulacích, radioterapii prostaty, hormonálně léčení pacienti či pacienti s infekcí močových cest a zavedeným permanentním katétrem nebyli zařazeni do studie. Biopsie prostaty v minulosti nebyla vylučujícím faktorem. Průměrný věk pacientů byl 69,5 let (44 až 88 let). Hodnota tPSA se pohybovala od 4,1 do 580 ng/ml. Celkem 34 ze 186 pacientů mělo suspektní nález při DRE, 125 ze 186 pacientů podstoupilo svoji první biopsii.

Rozložení do skupin bylo následující: 86 pacientů s karcinomem prostaty, resp. průkazem prekancerózy (PIN) a 100 pacientů s histologicky prokázanou benigní hyperplazií prostaty. V rámci skupiny CaP bylo vyděleno 74 pacientů s prokázaným CaP a 12 pacientů s PIN. Ve skupině pacientů CaP mělo 44 nemocných tumor lokalizovaný jen na prostatickou žlázu a zbylých 30 pacientů vykazovalo známky lokálně pokročilého či metastatického postižení.

Ve skupině pacientů CaP mělo 44 nemocných tumor lokalizovaný jen na prostatickou žlázu a zbylých 30 pacientů vykazovalo známky lokálně pokročilého či metastatického postižení. Ve skupině pacientů CaP mělo 45 pacientů dobře až středně diferencovaný karcinom prostaty (Gleasonovo skóre do 6) a 29 pacientů bylo nositeli špatně diferencovaného agresivního CaP (Gleasonovo skóre 7–10).

Metodika zpracování

Metodika stanovení exprese genů DD3^PCA3 a PSA v bioptických vzorcích tkáně prostaty

Pro získání informací o chování exprese genu DD3^PCA3 při vývoji onemocnění karcinomem prostaty jsme se rozhodli stanovit hladiny exprese genů DD3^PCA3 a PSA ve tkáňových vzorcích biopsie prostaty (jeden vzorek od každého pacienta) a následně porovnat hladiny exprese s klinickým stavem pacientů. Pro co nejpřesnější stanovení hladiny mRNA bylo důležité co nejrychlejší zamrazení vzorku po jeho odebrání. Vzorek tkáně pro stanovení exprese mRNA DD3^PCA3 byl po odběru zmražen (bez jakékoliv chemické fixace) pokud možno v co nejkratším časovém intervalu minimálně na teplotu -20 °C, a to do doby transportu na místo definitivního zpracování (pracoviště Plzeň), kde byly vzorky uchovány při teplotě -70 °C. Transport vzorků z pražského pracoviště probíhal při teplotě -70 °C na suchém ledu. U většiny vzorků stanovení hladiny mRNA DD3^PCA3 a PSA bylo možné.

Izolace RNA z bioptických vzorků tkáně prostaty

Izolace celkové RNA z bioptických vzorků probíhala tak, aby se zabránilo případné kontaminaci vzorků.

„Step by step metodika“:

1. Ke vzoru tkáně cca. 5 mg bylo přidáno 0,5 ml RNA proTM Solution, MP Biomedicals, promíchali jsme po dobu 15 s.
2. Dále bylo přidáno 0,1 ml chloroformu, promíchali jsme 15 s.
3. Centrifugace 15 minut 14 000 otáček při teplotě 4 °C.
4. Přenesli jsme vodní fázi do zkumavky eppendorfky.
5. Přidali jsme 0,25 ml izopropanolu a zamíchali.
6. Nechali 10 minut stát při pokojové teplotě.
7. Následuje centrifugace 8 minut 14 000 otáček 4 °C a odebrání supernatantu.
8. Přidali jsme 0,5 ml 75% etanolu a lehce vortexovali.
9. Cenrifugovali jsme 5 minut 10 000 otáček 4 °C, slili a 10 minut sušili.
10. Přidali 24 μl DPEC H2O a zamrazili na -70 °C.

Stanovení hladiny genů DD3^PCA3 a PSA metodou real time PCR m RNA v tkáni prostaty

Použili jsme 12 μl vzorku celkové RNA do reverzní transkripce (RT). Reverzní transkripci jsme provedli pomocí enzymu Superscript III Reverse Transcriptase (Life Technologies, USA) Superscript III pracuje při vyšší teplotě (55 °C) než Superscript II, který jsme používali dříve, což je lepší pro vyšší výtěžnost reakce. Jako primer pro RT jsme použili oligo d(T)21. Sekvenci primerů pro DD3^PCA3 a PSA jsme převzali z publikace Bussemakerse et al., Amplifikace pro DD3^PCA3 však neprobíhala specificky, nezískali jsme produkt požadované délky 390 bp, proto jsme primery upravili a PCR již amplifikovala správný úsek – 390 bp. Sekvence upravených primerů pro DD3^PCA3: forward primer: 5’-TGGTGGGAAGGACCTGATGATACAG- 3’ a reverse primer: 5’-TCTCCCAGGGATCTCTGTGCTTCC- 3’. Fragmenty získané PCR jsme inzertovali do vektoru pGEM (Promega Corporation, USA) a klonovali. Klonované fragmenty DD3^PCA3 a PSA jsme použili jako standardy o známém počtu molekul. 1 μl cDNA každého vzorku jsme použili pro real-time PCR na přístroji Rotorgene (Corbet Research, Australia). Stanovení na tomto přístroji však neprobíhalo optimálně. Amplifikace proběhla pouze u malého počtu vzorků. Proto jsme přešli na novější přístroj na Ústavu fyziologie LF UK v Plzni, a to i Cycler od firmy BioRad. Metodika zde již fungovala správně. Stanovení DD3^PCA3 jsme prováděli pomocí firemního mastermixu: SuperMix Biorad, stanovení PSA fungovalo lépe s mastermixem, jenž jsme připravili z jednotlivých chemikálií, s polymerázou Hot Star od firmy ABgene. Všem stanovením předcházeli optimalizace všech kroků, které máme spolu s protokoly jednotlivých stanovení uloženy.

Pro stanovení amplifikace DNA jsme použili barvu SYBR Green I. Specifitu reakce jsme ověřili pomocí teplotní křivky tání a elektroforézy. Stanovení jsme provedli jako absolutní (počet molekul cDNA) a jako standardy jsme použili klonované fragmenty cDNA.

Výsledky jsou uváděny jako:

• Hodnoty Ct – hodnoty cyklu, ve kterém dojde ke křížení s přímkou threshholdu (spodního prahu), čím je hodnota nižší, tím vyšší je množství kopií. Výsledky jsme hodnotili zvlášť pro DD3^PCA3 (Ct) a PSA (Ct).
• Normalizované hodnoty – výsledky jsou uváděny jako poměr sledovaného genu a PSA (DD3^PCA3/PSA).

Výsledky

Deskriptivní statistika souboru pacientů s karcinomem prostaty spolu s PIN a pacientů s pacientů s BPH je uvedena v tabulkách 2 a 3.

Prokázali jsme, že hladiny exprese mRNA pro DD3^PCA3 (Ct) byly signifikantně vyšší (p < 0,045) v prostatické tkáni u pacientů s karcinomem prostaty než u pacientů s BPH (tab. 4). Při hodnocení výsledků jsme se zaměřili na míru exprese DD3^PCA3 a PSA mRNA ve skupině pacientů s CaP ve vztahu k rozsahu onemocnění resp. TNM klasifikaci (na žlázu ohraničený CaP vs. pokročilý, resp. metastatický CaP). Zde jsme nenalezli statisticky významný rozdíl mezi těmito dvěma klinickými skupinami (tab. 5.) Zcela analogický závěr, tj. bez nálezu významného rozdílu, jsme učinili při porovnání dobře a středně diferencovaných karcinomů (Gleasonovo skóre do 6) vůči špatně diferencovaným (Gleasonovo skóre 7–10) (tab. 6.). Posledním hodnocením byl vztah míry exprese DD3PCA3 a PSA mRNA ve tkáni BPH a tkáni prostaty postižené PIN. Zde jsme zaznamenali statistickou signifikanci (p < 0,0141) mezi danými skupinami, ale překvapivě byla míra exprese mRNA pro DD3^PCA3 (Ct) vyšší u pacientů s BPH oproti prekanceroze – PIN (tab. 7).

Diskuse

Za účelem snížení mortality na karcinom prostaty bylo vyvinuto mnoho pomocných metodik, především z oblasti nádorových markerů. Tyto by měly vést k časné diagnostice karcinomu a jeho záchytu v kurabilních stadiích. Zhruba před dvaceti lety bylo do klinické praxe uvedeno stanovení PSA, které je doposud považováno za účinný nástroj pro detekci CaP a monitorování léčby (16). PSA je sice orgánově specifický marker, ale není specifický pro daná onemocnění. Elevace PSA může být dána jak přítomností CaP ve žláze, ale stejně také může být vyšší u pacientů s BPH či zánětem prostaty. Právě toto je limitujícím faktorem pro přesnou detekci CaP. CaP byl v roce 2006 diagnostikován zhruba u 230 000 amerických mužů (2). Většina těchto mužů byla indikována k biopsii ne pro suspektní per rectum nález či patologický sonografický obraz, ale především pro vyšší hladinu PSA. Podle závěrů Americké urologické asociace (AUA) (17) dosahuje PSA u mužů v sedmém deceniu při cut off 4,0 ng/ml 24% pozitivní prediktivní hodnotu (18). Jinými slovy, v roce 2006 podstoupilo v USA biopsii prostaty cca jeden milion mužů, ale karcinom prostaty byl diagnostikován jen u jedné čtvrtiny z nich. Dalším neopominutelným faktem je, že pacienti s negativní biopsií prostaty a přetrvávající elevací PSA mají stále 25% pravděpodobnost, že CaP nebyl v biopsii zachycen a oni zůstali nediagnostikováni a budou muset podstoupit další biopsii (19). Tento fakt se samozřejmě týká i skupiny našich pacientů. I zde ve skupině pacientů zařazených jako benigní hyperplazie prostaty se budou nacházet nemocní s nediagnostikovaným CaP. Jediný způsob jak tuto „nepřesnost“ vyloučit je stanovování exprese mRNA DD3^PCA3 ze vzorků tkáně prostaty po radikální prostatektomii. Toto však v rámci designu naší studie nebylo proveditelné.

Nové postupy a objevy v molekulárních technologiích se snaží obejít právě tato zmíněná úskalí PSA a zlepšit časnou diagnostiku CaP. Jako biologický materiál se používá jak krevní sérum, tak v poslední době i moč, která obsahuje prostatické buňky uvolněné do moči po masáži prostaty (20–21). Další možností je použití tkáňových vzorků. Namátkou dovolte jmenovat (vyjma dále zmíněného DD3^PCA3) GSTP1 hypermetylaci, která dosahuje specificity 98% a senzitivity 73%. Patologická telomerázová aktivita je vyjádřena minimálně u 90 % CaP (22–23).

Metodika stanovení DD3^PCA3, jak byla popsána v naší i ostatních publikacích, podléhá vývoji. Vzhledem k tomu, že prostatické buňky pocházející z normální žlázy či prostaty postižené BPH vykazují nízkou expresi DD3^PCA3, používáme pro prezentaci výsledků počet kopií DD3^PCA3 s přepočtem na počet kopií mRNA pro PSA. Stejně jako u prostatických buněk získaných z moči postupujeme u tkáňových vzorků, které sice již pocházejí z biopsií prostat, ale je zde prakticky anulováno riziko nedostatku buněčného materiálu, jak se setkáváme u vzorků moče.

RT-PCR (Real Time – Polymerase Chain Reaction) pro DD3^PCA3 je kvantitativní assay, vyvinuta na základě principů té samé metodiky jako pro PSA mRNA tak, jak ji popsali Ylikosky et al. (24). Výsledky přesné kvantifikace pro DD3^PCA3 transkripty v normálních vzorcích tkáně vykazují striktní orgánovou specifitu, tj., exprese DD3^PCA3 je možná jen v tkáni prostaty. Toto je v souladu s dříve publikovanými daty a přesná kvantifikace poukazuje na zvýšenou regulaci v tkáni karcinomu prostaty. Ve vzorcích prostat po radikálních prostatektomiích byla srovnávána exprese DD3^PCA3 ve tkáni tumoru a přilehlé „normální“ tkáni prostaty s nálezem 6 až 1500násobné zvýšené regulace DD3^PCA3 ve tkáni postižené tumorem. Taktéž výsledky získané Northern blotovou analýzou (8) vykazují medián 66násobné zvýšené regulace DD3^PCA3 ve tkáni postižené karcinomem. Tato data zcela korespondují s námi dosaženými výsledky. V naší skupině čítající 186 pacientů jsme prokázali statisticky vyšší míru exprese mRNA pro DD3^PCA3 ve skupině pacientů s CaP oproti skupině pacientů s BPH. Dalším pozorováním a měřením jsme zjistili statisticky vyšší míru exprese mRNA pro DD3^PCA3 ve skupině pacientů s CaP oproti skupině nemocných s prekancerózou (PIN). Paradoxní nález vyšší exprese mRNA pro DD3^PCA3 jsme zjistili u pacientů s BPH ve srovnání nemocných s PIN (viz výsledky). Jedním z vysvětlení těchto nálezů by mohla být disproporce ve velikosti skupin pacientů s BPH a PIN. Skupina pacientů s PIN se sestávala jen ze 12 pacientů. S ohledem na biologicky neobjasněnou funkci DD3 genu je těžké odhadnout, zda-li existuje vztah mezi mírou exprese mRNA pro DD3^PCA3 a rozsahem a biologickým charakterem CaP. Na základě našich závěrů nemůžeme toto potvrdit. Ve skupině našich pacientů jsme neprokázali statisticky významné rozdíly.

Velice často je v literatuře zmiňované stanovení exprese mRNA DD3 genu z prostatických buněk uvolněných do moče, byť toto nebylo náplní našeho sdělení. Na tomto místě je vhodné zmínit v literatuře publikovaná data týkající se senzitivity, specificity a prediktivní hodnoty. Meid et al. ve své práci na souboru 108 pacientů demonstruje 100% specificitu testu (25). Hessels et al. docílil 67% senzitivity při 83% specificitě (9).

Fraded et al. vyhodnotil 517 vzorků moče z pěti center v Kanadě a dospěl k 66% senzitivitě při 89% specificitě s 75% pozitivní prediktivní hodnotou (26). Žádná z dosud publikovaných prací hlouběji nehodnotí vztah exprese mRNA DD3^PCA3 vůči rozsahu tumoru a jeho biologické aktivitě. Fraded et al. (26) se ve své práci zabývá preanalytickým hodnocením vzorků a dochází k závěru, že až 86 % všech vzorků moče má ovlivněnou kvalitu díky dlouhodobému skladování a opožděnému transportu do laboratoře. Výsledky lze zlepšit nejen urychlením procesu zpracování, ale také použitím speciálních zkumavek s nesmáčivým povrchem. Tyto jsme bohužel neměli k dispozici. Opomenout nelze ani techniku masáže prostaty, kterou jsme taktéž prodloužili, což vedlo ke zlepšení výtěžnosti prostatických buněk z moče. K ovlivnění výsledku může dojít kontaminací moče erytrocyty či seminální tekutinou.

Vzhledem k těmto limitacím bylo uvažováno o „agresivnějších“ metodách získávání biologického materiálu jako detekce prostatických buněk z ejakulátu či po výplachu močové trubice (26), ale ani toto nepřineslo zlepšení v objemu detekovaných buněk a jako optimální metoda je dnes doporučen odběr prvních 20–50 ml moče po masáži prostaty. Poslední teorií byla teze, že malé tumory uvolňují menší počet buněk. Ani pro tento předpoklad nebyla nalezena opora, což ve své práci publikuje Meid et al. (25), kde srovnává T1c tumory s T3 tumory bez nálezu signifikantního rozdílu.

Závěr

V rámci publikované studie podpořené grantem IGA NR/8918-3 a výzkumným záměrem MSM 0021620819 jsme zjistili, že exprese genu DD3^PCA3 ve tkáni prostaty odebrané při biopsii je statisticky signifikantně vyšší u tkáně postižené karcinomem než u pacientů s BPH. Tento nález s ohledem na orgánovou specificitu DD3^PCA3 v kombinaci se stanovením hladiny PSA může zpřesnit indikaci, časnou diagnostiku karcinomu prostaty a v neposlední řadě pomoci v rozhodovacím algorytmu rebiopsií prostaty. V současnosti je v praxi již zavedena standardní komerční metodika detekce mRNA DD3^PCA3 z prostatických buněk uvolněných do moči (GenProbe^®). Detekce DD3^PCA3 z moče je samozřejmě méně invazivní metodika ve srovnání s tkáňovým stanovením, ale naráží na problematiku nedostatečného množství biologického materiálu k RT PCR. Jak již bylo zmíněno, korelace mezi hladinou PSA a expresí DD3^PCA3 je potenciálně využitelná k časné indikace rebiopsií u pacientů s histologicky negativním nálezem a zvýšenou expresí DD3^PCA3 ve tkáni odebraného vzorku při přetrvávající elevaci PSA a naopak.

Došlo: 4. 4. 2009.

Přijato: 20. 10. 2009.

Kontaktní adresa

MUDr. Jiří Klečka, Ph.D.

Urologická klinika FN a LF UK

E. Beneše 13,

305 99 Plzeň

e-mail: kleckaj@fnplzen.cz

Tato práce byla podpořena grantem IGA NR/8918-3 a výzkumným záměrem MSM 0021620819 náhrada a podpora funkce některých životně důležitých orgánů.