Korelace exprese markerů Ki-67, MCM2, MCM5 a p53 ve tkáních a cytoblocích u pacientůs uroteliálním karcinomem močového měchýře

Souhrn

Hlavní stanovisko práce: Studie se zabývá využitím imunocytochemie jako doplňkového vy‑šetření k močové cytologii. Předkládáme výsledky korelace exprese vybraných imunohistochemických markerů ve tkáni a cytobloku u pacientů s uroteliálním karcinomem močového měchýře.

Cíl: Cílem studie je ověřit, zda koreluje exprese vybraných imunochemických markerů v bioptic‑kém a cytologickém materiálu u pacientů s urote‑liálním karcinomem močového měchýře.

Materiál a metodika: U 77 pacientů (25 s dia‑gnózou low­‑grade uroteliálního karcinomu, 52 s dia‑gnózou high­‑grade uroteliálního karcinomu) jsme provedli imunochemické vyšetření vybraných proti‑látek Ki-67, MCM2, MCM5 a p53 ve tkáňových řezech z resekátu nádoru a v řezech z cytobloků z moči odebrané před chirurgickým výkonem. Porovná‑vali jsme míru exprese uvedených markerů ve tkáni a cytobloku každého pacienta.

Výsledky: Zjistili jsme signifikantní rozdíly v expresi všech zkoumaných markerů mezi low­ ‑grade a high‑­grade uroteliálními karcinomy, a to jak v tkáňových řezech, tak v řezech z cytobloků. U všech markerů jsme prokázali korelaci exprese ve tkáňovém řezu s expresí v cytobloku.

Závěr: Imunocytochemické vyšetření materiálu z adekvátně buněčného cytobloku má obdobnou výpovědní hodnotu jako imunohistochemické vy‑šetření nádorové tkáně.

Klíčová slova:

Imunocytochemie – močová cytologie – uroteliální karcinom.

ÚVOD

Cytologické vyšetření moči je dostupnou, relativně levnou a neinvazivní metodou, která je široce používána v diagnostice karcinomů močo‑vého měchýře a při sledování pacientů po léčbě. Močová cytologie má vysokou senzitivitu i specifi‑citu v detekci high‑­grade uroteliálního karcinomu (HGUC), zatímco senzitivita v detekci low‑­grade uroteliálních nádorů (LGUN) je nízká (1, 2, 3). Dal‑ším úskalím této metody je také interpersonální variabilita při hodnocení a interpretaci nálezů, stej‑ně jako existence různých klasifikačních systémů. V posledních letech vyústila snaha o sjednocení hodnocení, které by bylo postavené na jasně da‑ných kritériích, ve vznik Pařížské klasifikace pro hodnocení močových cytologií (4).

Dvěma základními metodami zpracování vzorků moči je tzv. konvenční cytologie a liquid­based cytologie (LBC). Konvenční cytologie zahrnuje zpracování vzorku moči cytocentrifugací. Touto metodou je mož‑né zhotovit jak cytospinové preparáty, tak cytobloky, ve kterých je materiál dlouhodobě uchován a může být využit pro další, např. imunocytochemická, vy‑šetření. Nevýhodou této metody je především nízká buněčnost vzorků. LBC přináší díky fixaci materiálu možnost lepšího zachování buněk a delší skladování vzorku pro případná dodatečná vyšetření. V porovná‑ní s konvenční cytologií mají preparáty lepší kvalitu (vyšší buněčnost, přehlednější tenká vrstva buněk bez překrývání). Nevýhodou je cena vyšetření, do které se promítají náklady na přístrojové vybavení. Porovnání těchto dvou metod nepřináší jednoznačné závěry ve prospěch jedné z nich, především co se týče senzitivity záchytu nádoru (1, 5, 6, 7).

Snahy o zvýšení senzitivity cytologického vyšetření moči vedly k zavádění pomocných vyšet‑ření využívajících metody molekulární genetiky (UroVysion® detekující chromozomální aberace pomocí fluorescenční in situ hybridizace) či imu‑nocytochemie (Immunocyt/uCyt+® založený na imunofluorescenční detekci proteinů). Jde však o metody nákladné a vzhledem k nutnosti speciálního vybavení i hůře dostupné. Kombinace klasické imunocytochemie s močovou cytologií se jeví jako dostupnější metoda, která má potenciál zvýšit diagnostickou sílu cytologického vyšetření, podobně jako tomu je v histopatologii (8). Dosud však hraje v cytologické diagnostice uroteliálních nádorů jen okrajovou roli.

V naší studii chceme ověřit možnosti použití imunocytochemického vyšetření vybraných markerů v materiálu získaném cytocentrifugací a zpracovaném metodou cytobloků. S vědomím limitů konvenční cytologie a cytobloku (tj. především nízké buněčnosti) (9) jsme se v první fázi rozhodli korelovat výsledky imunocytochemického vyšetření cytobloků a imunohistochemického vyšetření tkáňových vzorků resekovaného nádoru u stejných pacientů.

Na základě rešerše literatury jsme pro studii použili markery Ki-67, MCM2, MCM5 a p53. Ki-67 je jaderný protein, marker buněčné proliferace. U karcinomu močového měchýře jeho zvýšená exprese koreluje s horším přežitím a vyšší mírou rekurence (10). MCM2 a MCM5 jsou jaderné proteiny, které se účastní buněčné proliferace. Exprese těchto markerů může zlepšit detekci uroteliálního karcinomu močovou cytologií (11, 12, 13). P53 je tumor supresorový gen, jehož mutaci lze nepřímo imunohistochemicky detekovat v nádorové tkáni (10, 14).

MATERIÁL A METODIKA

Studijní soubor

Do studie bylo zařazeno 77 pacientů, u kterých bylo dostupné cytologické vyšetření vzorku moči odebrané před chirurgickým výkonem s optimálně celulárním cytoblokem (9) a histologické vyšetření resekovaného tumoru (25 pacientů s histologickou diagnózou low‑­grade (LG) uroteliálního karcinomu a 52 pacientů s histologickou diagnózou high­‑grade (HG) uroteliálního karcinomu).

Histologické vyšetření

Tkáně byly po makroskopickém popisu a zpracování zality do parafinových bloků. Řezy z parafinových bloků byly obarveny hematoxylinem‑eosinem a další řezy byly použity pro imunohistochemické vyšetření. U každého vzorku byl stanoven typ nádoru, grade a stadium. Použita byla WHO klasifikace 2016 (15). 

Příprava cytospinových preparátů a cytobloků

Z každého vzorku moči byly cytocentrifugací (10 min., 1 000 ot./min.) připraveny dva preparáty, které byly po zaschnutí obarveny technikou May­‑Grünwald‑Giemsa‑Romanowsky.

Cytobloky byly připraveny plazma‑­trombinovou metodou. Po centrifugaci vzorku moči (10 min., 1 000 ot./min.) a slití supernatantu byla k sedimentu přidána krevní plazma s trombinem, aby se vytvořila kohezivní peleta, která byla dále zpracována ve tkáňovém procesoru. Z cytobloku byl připraven řez barvený hematoxylinem­‑eosinem a další řezy pro následnou imunocytochemickou analýzu. Cytologický nález v cytospinech a cytobloku byl klasifikován podle PAP klasifikace a Pařížského systému 2016.

Imunocytochemické a imunohistochemické vyšetření

Imunochemické vyšetření bylo provedeno na řezech z cytobloku a tkáňového bloku. Řezy byly po deparafinizaci, blokování endogenní peroxidázy 3% roztokem H₂O₂ a demaskování antigenů inkubovány s primárními protilátkami (Tab. 1). K detekci byl použit kit Mouse/Rabbit PolyDetector HRP with DAB (BioSB, Santa Barbara, CA, USA).

Hodnotili jsme pozitivní reakci protilátek v jádrech epitelových buněk (síla pozitivity 2+ a 3+ na škále 0 až 3+); ve tkáňových vzorcích jsme určili procentuální zastoupení pozitivních buněk, v cytoblocích jsme zjišťovali počet pozitivních buněk v deseti sousedících zorných polích (zvětšení 400×).

Statistická analýza

Pro testování rozdílu exprese jednotlivých marke‑rů mezi low‑­grade a high‑­grade, pro cytobloky i tkáň, je použit Mann‑­Whitneyův test. Pro určení korelace mezi expresemi v cytobloku a ve tkáni je použit Spearmanův korelační koeficient (rank correlation)­. Jako signifikantní je považována hodnota p < 0,05.

Statistická analýza byla provedena programem MedCalc Statistical Software verze 17. 9. 6 (Med Cals Software bvba, Ostend, Belgie).

VÝSLEDKY

Pacienti byli rozděleni do skupiny low­‑grade (n = 25) či high­‑grade (n = 52) nádorů na základě histologické diagnózy.

Imunocytochemické vyšetření všech markerů v řezech z cytobloků vykazovalo signifikantní rozdíly mezi low­‑grade a high­‑grade nádory. Podobně imunohistochemické vyšetření všech zkoumaných markerů ve tkáňových řezech vykazovalo rozdíly mezi low­‑grade a high­‑grade nádory. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Míra exprese všech markerů v cytoblocích korelovala s jejich expresí ve tkáních, pokud jsme posuzovali celou skupinu (tedy LG i HG nádory) dohromady. V případě rozdělení na LG a HG nádory nebyl výsledek signifikantní u markerů MCM2 a p53 ve skupině LG nádorů (Tab. 3). Ve skupině HG nádorů byly signifikantní korelace mezi cytobloky a tkáněmi u všech protilátek kromě MCM2. Na mikrofotogra­fiích jsou příklady exprese vybraných markerů vždy ve tkáni a cytobloku u LG nádoru, kde je exprese nízká (Obr. 1) a HG nádoru, kde je exprese vysoká (Obr. 2).

DISKUZE

Zlatým standardem v diagnostice a dispenzarizaci pacientů s uroteliálním karcinomem je cystoskopické vyšetření močového měchýře doplněné cytologickým vyšetřením moči. Močová cytologie je jednoduchým, široce dostupným, neinvazivním a levným vyšetřením, které má vysokou specificitu (83–99 %). Její senzitivita závisí na stupni diferenciace nádoru, u LG karcinomů klesá až na 26 % (16).

Imunohistochemie má již desítky let široké uplatnění v histopatologické diagnostice, přispívá nejen k diagnostice, ale i k hodnocení prognostických a prediktivních ukazatelů. Imunochemické metody se užívají čím dál více i v oblasti cytologic‑ké diagnostiky. Rozšíření cytologického vyšetření moči o imunocytochemii by tak mohlo přispět ke zvýšení senzitivity tohoto vyšetření.

Možnost použití této metody však závisí na adekvátní buněčnosti cytologického vzorku. V tomto ohledu se jeví výhodněji zpracování vzorku moči metodou LBC, která zajistí dostatečnou buněčnost, a která je používána ve většině publikovaných studiích týkajících se imunocytochemického vyšetření moči.

Metoda cytobloku je na rozdíl od LBC levná a dostupná ve většině cytologických laboratoří. Nevyžaduje speciální přístrojové vybavení. Největším úskalím této metody je však dosažení dostatečné buněčnosti vzorku (9, 17, 18).

V této studii jsme prokázali významné rozdíly v expresích vybraných protilátek mezi LG a HG nádory, ať už se jednalo o cytobloky nebo tkáně nádoru. Za předpokladu adekvátní buněčnosti cytobloku má tedy imunocytochemické vyšetření stejnou výpovědní hodnotu jako imunohistohemické vyšetření tkáně. Navíc přináší výhodu prakticky neomezeného skladování cytologické‑ho materiálu pro vyšetření v budoucnosti.

Ze zkoumaných protilátek jsou neslibnější zejména protilátky Ki-67 a MCM5, u nichž korelovaly exprese mezi tkáněmi a cytobloky v případě LG i HG nádorů.

Limitujícím faktorem je ve skupině LG nádorů především nízká buněčnost cytobloků. Z toho důvodu mohlo být v této fázi zařazeno do studie pouze 25 pacientů s diagnózou LG nádoru. Nízká proliferační aktivita LG nádorů se projeví nižší reaktivitou buněk při imunocytochemickém průkazu proliferačních markerů, což snižuje výtěžnost imunocytochemie v porovnání s HG nádory.

ZÁVĚRY

Reaktivita všech zkoumaných protilátek vykazuje signifikantní rozdíly mezi low­‑grade a high­‑grade nádory, a to jak v tkáňových řezech (v imunohistochemickém vyšetření), tak v řezech z cytobloků (v imunocytochemickém vyšetření).

U všech zkoumaných protilátek jsme prokázali korelaci exprese ve tkáňovém řezu s expresí v řezu z cytobloku. Imunocytochemické vyšetření materiálu z cytobloku s adekvátní buněčností má stejnou výpovědní hodnotu jako imunohistochemické vyšetření nádorové tkáně. Tím rozšiřuje možnosti neinvazivního vyšetření pacientů s uroteliálními nádory.

Došlo: 30. 10. 2018

Přijato: 7. 1. 2019

Kontaktní adresa:

MUDr. Jaromír Háček

Ústav patologie a molekulární medicíny 2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84, 150 06 Praha 5

e-mail: jaromir.hacek@fnmotol.cz

Střet zájmů: Žádný.

Prohlášení o podpoře: Práce byla podpořena grantem 15-33266AZV, Česká republika.