Prognostický význam osteoprotegerinu a osteopontinu u maligního melanomu

Souhrn

Cíl:
Cílem naší studie je zhodnocení dynamiky biomarkerů, osteoprotegerinu a osteopontinu, v průběhu hodnocení jejich hladin v letech 2009–2012 a jejich vztahu k prognóze nemocných s maligním melanomem.

Metoda:
Byla sledována skupina nemocných s maligním melanomem (n = 77) a kontrolní skupina bez nádorového onemocnění (n = 34). U těchto skupin jsme hodnotili sérové hladiny osteoprotegerinu a osteopontinu použitím xMAP technologie.

Výsledky:
Byla zjištěna statisticky významná korelace mezi sérovou hladinou osteopontinu a postižením lymfatických uzlin (p < 0,01) a pozitivitou/negativitou sentinelové lymfatické uzliny (p < 0,03). Elevace sérové hladiny osteopontinu byla shledána u nemocných s pokročilým onemocněním ve srovnání s nemocnými s primárním melanomem (p < 0,02). Byla zjištěna elevace sérové hladiny osteoprotegerinu i u skupiny nemocných s progresí onemocnění ve srovnání se skupinou remisní (p < 0,01). Ve skupině nemocných s maligním melanomem jsme zjistili vyšší sérové hladiny osteoprotegerinu (p < 0,001) a osteopontinu (p < 0,0008) ve srovnání s kontrolní skupinou. Senzitivita vyšetření sérových hladin osteoprotegerinu byla 39,21% při 93% specificitě a ostepontinu 9,8% při 93% specificitě.

Závěr:
Na základě naší studie se osteopontin a osteoprotegerin jeví jako potenciálně využitelné biomarkery při sledování biologické aktivity maligního melanomu. Výsledky naší studie a eventuální využití těchto biomarkerů v dispenzární péči o nemocné s maligním melanomem bude ale nutné ověřit na větší skupině nemocných.

Klíčová slova:
maligní melanom – biomarkery – osteoprotegerin – osteopontin – multiplexová analýza

ÚVOD

Maligní melanom v současnosti představuje celosvětový problém, dostal se do popředí zájmu odborné ale i laické veřejnosti [5]. S jeho narůstající incidencí roste i snaha lépe porozumět chování tohoto heterogenního nádoru. Porozumění vztahu mezi prognostickými faktory a biologií melanomu je jedním z předmětů výzkumu v této oblasti [13]. Cílem práce bylo zhodnocení prognostické významnosti dvou nových biomarkerů – osteoprotegerinu (OPG) a osteopontinu (OPN), stejně tak využití nové metody stanovení biomarkerů – xMAP technologie při monitorování nádorového onemocnění.

Osteoprotegerin je protein (cytokinový receptor), který je kódován genem TNFRSF11B. Jedná se o důležitý regulátor kostního metabolismu, imunitního systému, důležitou funkci zaujímá při rozvoji cévních komplikací, jako je ateroskleróza či cévní ischemická mozková příhoda. Zajišťuje přežití endoteliálních buněk, jejich proliferaci, migraci a jejich formaci při angiogenezi [12, 18]. OPG také zajišťuje přežití buněk inhibicí apoptózy. Na základě tohoto zjištění byla vypracována řada studií podporující roli OPG v onkogenezi [11]. OPG má také významnou roli v angiogenezi – klíčového procesu při vzniku a metastazování nádoru. Produkce osteoprotegerinu je tedy součástí strategie přežití nádoru, byla zjištěna produkce OPG u celé řady nádorových buněk [14].

Osteopontin je glykoprotein extracelulární matrix produkovaný celou řadou buněk, jako jsou fibroblasty, osteoblasty, osteocyty, odontoblasty, chondrocyty, makrofágy či myoblasty. OPN je důležitým faktorem při remodelaci kosti a v imunitním systému [16]. Role osteopontinu byla popsána i při chemotaxi, buněčné migraci, adhezi, angiogenezi, apoptóze a zakládání metastáz. Zvýšená exprese OPN je spojena s agresivnějším chováním a tendencí k metastazování u celé řady nádorů [17]. Vyšší hladiny OPN v séru jsou pozorovány u pacientů s pokročilým onemocněním a jsou ukazatelem horší prognózy, kratším celkovým přežitím a kratším intervalem remise [6, 7].

PACIENTI A METODIKA

V letech 2009–2012 jsme provedli prospektivní nerandomizovanou kohortní studii s cílem posoudit prognostickou roli nových biomarkerů u maligního melanomu. Sledovali jsme pacienty s maligním melanomem podstupující radikální chirurgický výkon (n = 77) a kontrolní skupinu pacientů s benigním kožním onemocněním (n = 34). Sledování sérové hladiny biomarkerů bylo prováděno předoperačně a následně po operaci v pravidelných 3měsíčních intervalech po dobu 2 let, kontrolní skupina byla nabrána před operací a 1krát v pooperačním období. Průměrný věk v době stanovení diagnózy byl u skupiny nádorové 57,9 (11–87) let a u kontrolní skupiny 36,8 (17–84) let. U všech nemocných jsme provedli radikální chirurgický výkon s vyšetřením sentinelové uzliny v indikovaných případech podle mezinárodních doporučení. Následně byli rizikoví nemocní léčeni imunoterapií (Interferon alfa) po dobu 12 měsíců a v pravidelných intervalech dispenzarizováni v névové poradně Dermatovenerologické kliniky FN Plzeň. Primární operace byla provedena u 51 nemocných, reexcize nádoru v 18 případech a operace pokročilého onemocnění v 8 případech. Melanom in situ byl popsán u 6 nemocných, stadium I (pT1) bylo popsáno u 21 nemocných, stadium II (pT2) u 19 nemocných, stadium III (pT3) u 17 nemocných a stadium IV (pT4) u 14 nemocných. Breslow skóre 0,1–1 mm byl přítomen ve 20 případech, 1,1–2 mm ve 23 případech, 2,1–4 mm v 15 případech a > 4,1 mm v 15 případech, ve 4 případech bylo Breslow skóre neznámé. Ulcerace nádoru jako negativní prognostický faktor byla přítomna u 30 nemocných. Maligní melanom v našem souboru byl nejvíce přítomen na dolních končetinách a trupu (tab. 1 a 2). U každého pacienta jsme odebrali 20 ml periferní krve standardní metodou flebotomie (systém VACUETTE^®, Greiner Bio-One, Rakousko), s/bez EDTA. Plasma byla separována centrifugací a všechny vzorky byly okamžitě alikvotovány, zmraženy a uchovány při -70 °C. Vzorky byly shromažďovány předoperačně (v den operace), 10 dní po operačním výkonu a dále každé 3 měsíce po celou dobu sledování na základě klinických kontrol. Sérové hladiny osteopontinu a osteoprotegerinu byly stanoveny pomocí xMAP technologie (multiplexová analýza) na přístroji Luminex 100: Luminex Corporation, USA. Stanovení bylo shodné ve skupině nemocných i v kontrolní skupině. Multiplexová analýza kombinuje principiy průtokové cytometrie a imunoanalytického stanovení. Stanovení je založeno na molekulární reakci, která probíhá na barevně kódovaných sadách mikrokuliček. Je možné až 100 různých reakcí v jediném alikvotu vzorku. Další velkou výhodou je malý objem vzorku potřebný pro analýzu [3].

Pro statistické zpracování získaných hodnot jsme použili deskriptivní statistiku, Kruskalův-Wallisův test, Wilcoxonův test, Spearmanův korelační test. Pro zhodnocení vztahu senzitivita-specificita byly užity ROC (receiver operating characteristics) křivky. Optimální cut-off hodnota byla nalezena jako statisticky nejvýznamnější výsledek při nejnižší hodnotě p. Pro jednotlivý biomarker byla vypočtena AUC (area under the curve). Hodnota p <  0,05 byla považována za statisticky signifikantní.

VÝSLEDKY

Deskriptivní statistika sérových hladin osteoprotegerinu a osteopontinu ve skupině nemocných s maligním melanomem a kontrolní skupině je uvedena v tabulce 3. Byla zjištěna statisticky významná korelace mezi sérovou hladinou osteopontinu a postižením lymfatických uzlin (p < 0,01) a s pozitivitou/negativitou sentinelové lymfatické uzliny, p < 0,03. Jiné statisticky významné korelace hladin vyšetřovaných biomarkerů a TNM klasifikace nebyly zjištěny. Stejně tak nebyly zjištěny významné korelace mezi sérovou hladinou těchto markerů a hodnotou podle Breslowa, ulcerací či lokalitou onemocnění. Vyšší sérové hladiny těchto markerů vykazovali nemocní s pokročilým onemocněním ve srovnání se skupinou nemocných s primárním melanomem. Statisticky významné korelace byly zjištěny u osteopontinu (p < 0,02). Během sledování byly naměřeny vyšší sérové hladiny i u skupiny nemocných s progresí onemocnění ve srovnání se skupinou remisní. Statisticky významné korelace jsme zjistili u osteoprotegerinu (p < 0,01). Ve skupině nemocných s maligním melanomem jsme zjistili vyšší sérové hladiny vyšetřovaných biomarkerů, osteoprotegerinu a osteopontinu, ve srovnání s kontrolní skupinou (p < 0,001 a p < 0,0008) – tabulka 4. Senzitivita vyšetření sérových hladin osteoprotegerinu byla 39,21% při 93% specificitě a ostepontinu 9,8% při 93% specificitě (tab. 5).

DISKUSE

Maligní melanom je jedním z nejagresivnějších nádorů, pokud není včas diagnostikován a odstraněn. S celosvětově rostoucí incidencí rostou i snahy o lepší porozumění tomuto heterogennímu nádoru. Základním krokem je nalezení vztahů mezi prognostickými faktory a biologickou povahou nádoru [13]. Tloušťka nádoru podle Breslowa a stav sentinelové lymfatické uzliny zůstávají nadále nejdůležitějšími prognostickými faktory z hlediska rekurence choroby a přežití. Tyto faktory ovšem nepřináší přesné a včasné informace k určení biologického chování nádoru u každého jednotlivého pacienta, agresivity choroby nebo cesty diseminace. Zatím neexistuje žádný klinický, histologický, imunohistochemický či molekulární marker, který by nám umožnil upřesnit charakteristiky nádoru ve smyslu jeho dalšího chování a prognózy nemocného.

V řadě studií se diskutuje o celé řadě biomarkerů, které by pomohly lépe porozumět biologické aktivitě melanomu [8, 9, 15]. Biomarkery slouží ke zpřesnění prognostické informace, k odhadu agresivity choroby, k individualizaci léčby. Výzkum v oblasti biomarkerů představuje cestu k lepšímu porozumění biologické podstaty maligního melanomu. Zatím však neexistuje spolehlivý biomarker maligního melanomu, který by byl využitelný v praxi. Hledání vhodného biomarkeru na poli maligního melanomu pokračuje, sledují se nové faktory, které by mohly přispět ke zlepšení péče o nemocné s melanomem. K takovým faktorům by mohly patřit i osteopontin a osteoprotegerin.

Osteopontin je adhezivní glykoprotein mající roli v nádorové angiogenezi a metastazování. Na základě zjištění, že se jedná o potentní biomarker u celé řady nádorů, jsme provedli studii s cílem objasnit roli osteopontinu u maligního melanomu. Nalezli jsme statisticky významné korelace sérových hladin osteopontinu a postižení lymfatických uzlin. Sérové hladiny byly významně vyšší u pacientů s maligním melanomem ve srovnání s kontrolní skupinou. Byly také zjištěny vyšší hladiny u pacientů s pokročilým onemocněním ve srovnání s předoperačními náběry u primárního melanomu. Barak et al. A Kadkol et al. [1, 4] publikovali studii zabývající se významem osteopontinu u metastatického uveálního melanomu, kde sérové hladiny OPN byly signifikantně vyšší u metastatické skupiny ve srovnání s remisní skupinou a skupinou kontrolní. Toto zjištění je v souladu s našimi výsledky. Rangel et al. ve své studii [10] prokázal asociaci mezi vyšší expresí osteopontinu a vyšším Breslow skóre. Hodnoty OPN byly prediktivní vůči postižení spádových lymfatických uzlin podle Rangelovy studie, v souladu s naším tvrzením.

Osteoprotegerin je potentním proangiogenním faktorem s významnou rolí v onkogenezi a šíření nádoru. V naší studii byly nalezeny vyšší sérové hladiny u skupiny nádorové v porovnání s kontrolní skupinou. Jiné statisticky významné asociace nalezeny nebyly. Podle našich znalostí není prozatím publikována studie, která by potvrzovala použití osteoprotegerinu jako biomarkeru u maligního melanomu. Existují studie u jiných nádorů, ovšem s kontroverzními výsledky.

Senzitivita obou testovaných biomarkerů byla nízká. Pro srovnání je možno uvést senzitivitu nejvíce diskutovaných biomarkerů u maligního melanomu, tj. proteinu S100B a laktádehydrogenázy, jejichž senzitivita je 30–70% podle různých studií. Například Banfalvi et al. udává senzitivitu S100B 70% při 100% specificitě a LDH 48% při 83% specificitě [2].

Na základě naší studie se osteopontin a osteoprotegerin jeví jako potenciálně využitelné biomarkery při sledování biologické aktivity maligního melanomu.

ZÁVĚR

Tato studie měla za cíl ověřit využitelnost osteoprotegerinu a osteopontinu při hodnocení biologické aktivity maligního melanomu a vhodnost dalšího výzkumu v oblasti výše uvedených biomarkerů. Jsme si vědomi rozdílných věkových hladin u nádorové a kontrolní skupiny, tato souvislost není u kontrolní skupiny statisticky signifikantní, určitou roli může hrát u skupiny nádorové. Toto bude v pokračování studie zohledněno a výsledky studie a eventuální využití těchto biomarkerů v dispenzární péči o nemocné s maligním melanomem bude ověřeno na větší skupině nemocných.

Studie podpořena grantovým projektem IGA MZ ČR NT 11017-5/2010.

Do redakce došlo dne 25. 9. 2013.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Inka Třešková,

K Plzenci 23

326 00 Plzeň

e-mail: t.inka@seznam.cz