Histologická diagnostika Ph-negativních myeloproliferativních neoplázií

Souhrn

Podle klasifikace WHO je histologický obraz v trepanobiopsii kostní dřeně odebrané před započetím cytoreduktivní léčby důležitou součástí diagnostiky Ph-negativních myeloproliferativních onemocnění. Polycythaemia vera je histologicky definována jako hypercelulární myeloproliferace všech tří řad. Pro primární myelofibrózu je typická hypercelulární krvetvorba s proliferací megakaryocytární a granulocytární řady. U esenciální trombocytémie je krvetvorba normocelulární s izolovanou proliferací megakaryocytů. Nejdůležitější v diferenciální diagnóze je vzhled a distribuce megakaryocytů a přítomnost fibrotizace. Při primární myelofibróze jsou přítomny „dysplastické“ megakaryocyty tvořící kompaktní shluky a různý stupeň fibrotizace, zatímco u esenciální trombocytémie jsou megakaryocyty zralé, tvoří volné shluky a není přítomna žádná fibrotizace. Pro reaktivní trombocytózu a polyglobulii jsou typické megakaryocyty přiměřeného vzhledu, které nejsou zmnožené a neshlukují se. Diskutují se prodromální (latentní) fáze jednotlivých myeloproliferací, které nemohou být diagnostikovány podle současných kritérií WHO, a diferenciální diagnóza myeloproliferací spojených s výraznou trombocytózou.

Klíčová slova:
myeloproliferativní neoplázie – polycythaemia vera – primární myelofibróza – esenciální trombocytémie – prodromální (latentní) fáze – trepanobiopsie kostní dřeně – klasifikace WHO

Úvod

Myeloproliferativní neoplázie (MPN) jsou skupinou chorob charakterizovaných klonální abnormalitou genů pro cytoplazmatické fosfotyrozinkinázy nebo jejich receptory na úrovni dřeňové multipotentní kmenové buňky vedoucí k proliferaci jedné nebo více dřeňových linií. Na rozdíl od myelodysplázií je hematopoéza efektivní a vede k vyplavování zralých buněk do periferie. V pokročilejších fázích onemocnění je běžný rozvoj dřeňové myelofibrózy a organomegalie při extramedulární hematopoéze (myeloidní metaplázii). Průběh onemocnění vede ke dřeňovému selhání, nebo se s různou pravděpodobností postupně zmnožují blasty (fáze akcelerace) a proces se transformuje do sekundární akutní leukémie.

Myeloproliferace se podle přítomnosti Ph chromozomu jako výsledku t(9;22) s fúzí genů BCR/ABL1 dělí na Ph-pozitivní, která z definice odpovídá chronické myeloidní leukémii (CML), a všechny ostatní, Ph-negativní procesy. Z praktického hlediska se pod pojmem „Ph-negativní myeloproliferace“ (Ph- MPN) rozumí tři nejčastější jednotky – polycythaemia vera (PV), primární myelofibróza (PMF) a esenciální trombocytémie (ET). Ostatní myeloproliferace (chronická neutrofilní leukémie, procesy spojené s hypereozinofilií a mastocytózy) jsou vzácnější nebo se liší klinicky i doporučenými diagnostickými postupy.

Diagnóza Ph-negativních myeloproliferací se původně opírala o klinický obraz a zejména o hematologické nálezy. Hlavním a nejrozšířenějším reprezentantem tohoto přístupu je klasifikace podle Polycythaemia Vera Study Group (PVSG) (1,2). Dlouhá tradice provádění trepanobiopsií kostní dřeně v Německu, zejména práce skupiny z Hannoveru (3) a posléze v Kolíně nad Rýnem, vedla k rozpoznání specifických rysů v histologickém obrazu myeloproliferací. Snaha inkorporovat trepanobiopsii do základního diagnostického algoritmu vyústila v moderní klasifikaci myeloproliferací podle WHO, nejnověji ve vydání z roku 2008 (4).

Diagnóza CML je principiálně jednoduchá a opírá se o průkaz definující genetické změny. Zjednodušeně řečeno, pokud se u pacienta s projevy chronické myeloproliferace prokáže Ph chromozom, jedná se o CML. Naproti tomu diagnostika Ph-negativních myeloproliferací je složitější a od dob Damesheka, který v polovině minulého století vytvořil společný koncept myeloproliferativních onemocnění (5), je zdrojem trvalé a stále nerozhodnuté diskuze (6,7). Všechny myeloproliferace se mohou klinicky prezentovat obdobně. Častým úvodním symptomem je trombocytóza, buďto současně nebo později se objevuje leukocytóza anebo polyglobulie, postupně se rozvíjí organomegalie, zejména splenomegalie. V průběhu onemocnění může docházet k přechodům mezi jednotlivými klinickými obrazy. Navíc Ph-negativní myeloproliferace postrádají definující molekulární změny jako je fúze BCR/ABL1 u CML. Ideálním adeptem pro diagnózu polycythaemia vera se zprvu jevil gen JAK2 (Janusova kináza) lokalizovaný na chromozomu 9p24, u kterého je bodová mutace v exonu 14 v pozici V617F prokazatelná u více než 95 % případů PV (přičemž u negativních případů je často přítomna alternativní mutace v exonu 12) (8-10). Mutace JAK2 však byla zastižena také u zhruba poloviny případů primární myelofibrózy a esenciální trombocytémie, takže její diferenciálně diagnostický přínos je nízký a sama o sobě prakticky prokazuje pouze fakt, že se jedná o klonální myeloproliferaci (9,10). Obdobně je tomu u dalších genů, např. PRV1, MPL a TET2.

Přestože role histologického vyšetření je nezastupitelná, bylo by iluzorní se domnívat, že trepanobiopsie sama o sobě postačuje k diagnóze Ph- MPN. Nezbytná je spolupráce hematologa s patologem, který by měl mít v době hodnocení trepanobiopsie k dispozici hodnoty krevního obrazu, morfologické posouzení aspirátu kostní dřeně a výsledky základního laboratorního vyšetření.

Předpokladem k diagnóze je vyloučení přítomnosti Ph chromozomu. Jak již bylo řečeno, tato změna je definující pro chronickou myeloidní leukémii. Existenci tzv. Ph-pozitivní esenciální trombocytémie většina současné literatury včetně klasifikace WHO (4) zavrhuje a považuje ji za CML, nejčastěji subtyp bohatý na megakaryocyty.

V neposlední řadě je nezbytné zdůraznit, že klasifikace myeloproliferací pomocí histologického obrazu je možná jen z odběru získaného před nasazením jakékoli cytoreduktivní terapie – diferenciální diagnóza se opírá zejména o vzhled megakaryocytů, který je již v úvodních fázích terapie výrazně modifikován a např. odlišení ET od PMF je nemožné (11,12).

Další text se bude věnovat zejména histologickým rysům jednotlivých myeloproliferací a jejich diferenciální diagnostice. Jejich znalost je obzvláště důležitá pro rozpoznání tzv. prodromálních stádií jednotlivých myeloproliferací (zejména „prepolycytemické“ polycythaemia vera a „prefibrotické“ primární myelofibrózy), která nemusí kompletně splňovat všechna diagnostická kritéria WHO, ale již ohrožují zdraví a život pacienta závažnými komplikacemi (13).

HISTOLOGICKÁ DIAGNOSTIKA MYELOPROLIFERACÍ OBECNĚ

Reprezentativnost vzorku

Prvním úkolem patologa při hodnocení trepanobiopsie kostní dřeně z lopaty kosti kyčelní je posouzení reprezentativnosti vzorku. Pro diagnózu Ph- MPN se obvykle doporučuje jako ideálně reprezentativní vzorek hodnotit plochu řezu alespoň 30 mm², to znamená např. 15 mm dlouhý váleček kosti o průměru 2 mm. Diagnostické změny (zejména shluky megakaryocytů – viz dále) jsou běžně přítomny jen fokálně a aby mohla být jejich přítomnost spolehlivě potvrzena či vyloučena, měla by být doporučená velikost vzorku dodržena u každého případu. Odlišná situace je např. u trepanobiopsií indikovaných při vyšetření lymfomů v rámci stagingu a restagingu, kdy může být sebemenší vzorek považován za diagnostický, pokud je v něm zastižen nádorový infiltrát.

Buněčnost

Vlastní hodnocení trepanobiopsie začíná posouzením celkové buněčnosti v korelaci s věkem pacienta. Buněčnost je vyjádřena jako procento plochy intertrabekulárních prostor zavzaté krvetvorbou. Velmi orientačně lze stanovit očekávanou buněčnost podle vzorce „100 – věk pacienta“. Obvyklé hodnoty buněčnosti dřeně v závislosti na věku se uvádí v rozmezí 60 – 70 % ve 2. a 3. deceniu, 40 – 50 % ve 4. – 6. deceniu a 30 – 40 % ve věku nad 70 let (14). U myeloproliferací je krvetvorba běžně hypercelulární, ale např. u ET je pravidlem normocelulární dřeň a v pozdějších fázích MPN nebo vlivem terapie může být obraz dosti hypocelulární.

Rámcově je nutno odhadnout poměr zastoupení myeloidních a erytroidních buněk, který by měl být lehce posunut ve prospěch řady myeloidní.

Granulopoéza

Granulocytární řada za normálních okolností vyzrává směrem od kostních trámců do intertrabekulárního prostoru do těsné blízkosti sinusoid, kudy postupně zralé elementy opouštějí dřeň. Obrazu dominují vyzrávající buňky od velkých promyelocytů až po polymorfonukleáry, všechny silně pozitivní při histochemickém průkazu chloroacetátesterázy (CAE). Malé množství CAE-negativních blastů je fyziologicky přítomno těsně peritrabekulárně. Při posunu doleva se zmnožují zejména promyelocyty a myelocyty, naopak ubývá zralých segmentovaných forem. Možný je i mírný nárůst počtu blastů, ale v chronické fázi onemocnění jejich podíl na celkové buněčnosti z definice nepřesahuje 10 % (4). Proliferace granulopoézy se přesouvá od kostních trámců i do perivaskulárních úseků.

K průkazu a kvantifikaci zmnožených myeloblastů lze v indikovaných případech (např. při klinické suspekci na akceleraci či transformaci onemocnění) využít i imunohistologického průkazu CD34 a CD117 (obr. 3D). Akcelerace je histologicky definována jako zmnožení blastů nad 10 % a u akutní leukémie je více než 20 % blastů. Pro diagnózu iniciální transformace do akutní leukémie stačí pouze fokální zmnožení blastů nad uvedenou hranici.

Erytropoéza

Erytroidní řada tvoří skupiny erytroblastů, erytrony, distribuované rovnoměrně v intertrabekulárním prostoru. Při proliferaci červené řady se tvoří nepravidelné, často objemnější shluky, stoupá podíl větších a méně zralých buněk, proerytroblastů – posun doleva. Část erytroblastů může mít větší a nepravidelná jádra, buňky se mohou přesouvat do blízkosti kostních trámců. Tyto rysy se v různé míře vyskytují zejména u pokročilejších stádií PV a odlišení průvodních dysplastických rysů v erytropoéze od rozvíjející se sekundární myelodysplázie je obtížné.

Megakaryopoéza

Nejdůležitější v histologické diagnostice Ph-negativních myeloproliferací je megakaryocytopoéza. Megakaryocyty jsou v normální dřeni distribuovány disperzně intertrabekulárně, v blízkosti sinusoid. V normocelulární dřeni se v zorném poli při velkém zvětšení zastihnou průměrně dva až tři megakaryocyty, větší množství obvykle již znamená jejich zmnožení. Zralé megakaryocyty mají jádro mírně členěné, s jemným chromatinem, cytoplazma je slabě eozinofilní (obr. 2D).

U myeloproliferací je megakaryocytární řada pravidelně zmnožená, může se přesouvat do blízkosti kostních trámců a tvoří shluky. Shluk je definován jako tři a více megakaryocytů v těsné blízkosti. Shluky jsou buďto volné (“loose”), nebo kompaktní (“tight”), denzní. U volných shluků se mezi jednotlivými megakaryocyty mohou zastihnout jiné hematopoetické buňky (obr. 4B). V kompaktních shlucích megakaryocyty tvoří formace vzdáleně upomínající kohezivní solidně alveolární struktury karcinomu, bez vmezeřených buněk (obr. 3C).

Megakaryocyty nabývají různé velikosti a vzhledu. Mohou být přiměřeně velké, větší až gigantické, nebo naopak bývají malé. Malé zralé megakaryocyty s méně členěnými jádry („dwarf megakaryocytes, trpasličí megakaryocyty“) jsou typické pro CML (obr. 4D). Mikromegakaryocyty (které lze spolehlivě prokázat pouze imunohistologicky, např. průkazem cytoplazmatické exprese CD61) popisované u myelodysplastického syndromu, se však obvykle nezastihnou. Jádra megakaryocytů bývají přiměřeně členěná až hyperlobovaná, s jemným chromatinem. Nápadně členěná jádra se v literatuře přirovnávají k parohům („staghorn-like nuclei“) (obr. 4A). Jindy jsou jádra méně členěná až zcela nečleněná a mohou být výrazně hyperchromní. Minimálně členěná jádra s intenzivně zbarveným, hyperchromním chromatinem se přirovnávají k oblakům („cloud-like nuclei“) (obr. 1C). Cytoplazma je přiměřeného vzhledu a stupněm vyzrávání odpovídá jádrům, nebo dochází k nukleocytoplazmatické asynchronii. Někdy je cytoplazma velmi chudá, což vede na úrovni optické mikroskopie k obrazu tzv. nahých jader („naked nuclei“) (obr. 3A).

Fibrotizace

Nezbytné je posouzení přítomnosti fibrotizace. Bez kvalitně provedeného průkazu přítomnosti retikulinových vláken anebo depozice kolagenního vaziva nelze stanovit definitivní diagnózu Ph-MPN. Existuje řada přístupů, jak stanovit stupeň fibrotizace, podrobnější diskuze a shrnutí všech přístupů viz např. práce Marcinka a Planka (15). V anglosaských zdrojích je nejčastěji používána škála podle Bauermeistera (16) modifikovaná podle Manoharana et al. (17). Nověji se doporučuje relativně dobře reprodukovatelný přístup podle tzv. Evropského konsenzu skupiny expertních hematopatologů – EUMNET grading (14) (tab. 1). Za normálních okolností je v kostní dřeni minimum retikulinových vláken, které se obvykle dají zastihnout pouze perivaskulárně (zde je jejich přítomnost naopak vítána, neboť slouží jako pozitivní vnitřní kontrola správnosti provedení stříbření) (obr. 1A). Pokud jsou jemná retikulinová vlákna přítomna v celém rozsahu buněčných úseků (obr. 1B), hodnotí se fibróza jako stupeň 1 (MF-1). Za druhý stupeň (MF-2) se považuje přítomnost četných zhrubělých, „zpečených“ vláken retikulinu (obr. 1C), připouští se minimální fokální depozice kolagenních vláken. Nejvyšší, třetí stupeň fibrotizace (MF-3) je charakterizován rozsáhlou kolagenní fibrotizací, prokazatelnou např. trichromovým barvením (obr. 1D).

S pokročilejší fibrotizací dřeně se mohou objevit i změny kostních trámců, které se rozšiřují, zmnožují a nepravidelně anastomozují, intertrabekulární prostory jsou často významně komprimovány. Výsledkem je osteomyeloskleróza (OMS), kombinace fibrotizace a osteoplázie (obr. 1D). Histologický obraz terminální fáze myeloproliferace s OMS již obvykle neumožňuje rozlišení mezi jednotlivými typy MPN. Nezbytné je pátrat po zmnožení blastů signalizujícím případnou nastupující akceleraci či transformaci onemocnění.

V silněji fibrotizované dřeni lze zastihnout nápadnou dilataci sinusoid, ve kterých se může zastihnout intravaskulární hematopoéza (obr. 3B).

Kromě dalších stromálních změn (hemosideróza, perivaskulární plazmocytóza a buněčné debris, makrofágy případně pseudo-Gaucherova vzhledu aj.) je nutno pátrat po ložiskových změnách (lymfoidní shluky, granulomy, nekrotizace, infiltrace jiným nádorem) v rámci diferenciální diagnózy MPN.

POLYCYTHAEMIA VERA

Polycythaemia vera je Ph-negativní myeloproliferace charakterizovaná zvýšenou produkcí erytrocytů nezávislou na normální regulaci erytropoézy.

Diagnostická kritéria polycythaemia vera podle WHO

Klasifikace WHO (4) dělí diagnostická kritéria na hlavní a vedlejší. Hlavním kritériem je zvýšení hladiny hemoglobinu (nad 185 g/L u mužů a nad 165 g/L u žen) a průkaz mutace genu JAK2 V617F (anebo jiná funkčně obdobná mutace). K vedlejším kritériím patří typický histologický obraz v trepanobiopsii kostní dřeně, nízká hladina sérového erytropoetinu a spontánní tvorba endogenních erytroidních kolonií in vitro. K diagnóze PV je nezbytná přítomnost dvou hlavních a jednoho vedlejšího anebo jednoho hlavního a dvou vedlejších kritérií (tab. 2). V typickém případu PV, který splňuje obě hlavní kritéria, není trepanobiopsie kostní dřeně nezbytná a diagnóza je stanovena na podkladě výsledků laboratorních vyšetření.

Prodromální stádium polycythaemia vera

Až v 50 % případů PV začíná pod obrazem trombocytózy s pouze mírným zvýšením hodnot hemoglobinu nedosahujícím arbitrárně stanovené hranice a podle kritérií PVSG by mělo být onemocnění klasifikováno jako esenciální trombocytémie. Pokud je provedena trepanobiopsie, pozoruje se typický obraz PV odlišný od nálezu u ET (18). Na retrospektivní sestavě 68 pacientů s trombocytózou, hraničními hodnotami hemoglobinu a histologickým obrazem PV, popisují Kvasnicka a Thiele (13) v průběhu 6 – 24 měsíců ve všech případech transformaci do klinického obrazu PV, čímž potvrzují koncept prodromální fáze resp. “prepolycytemické PV”. Tento stav nemůže být diagnostikován ani při striktním dodržení požadavků klasifikace WHO.

Histologický obraz polycythaemia vera

V prepolycytemické a polycytemické fázi onemocnění je kostní dřeň hypercelulární. Přítomna je proliferace všech tří řad – „panmyelóza“ (obr. 2A, 2B).

Granulocytární řada proliferuje bez zmnožení blastů, ale může se pozorovat posun doleva.

Proliferující červená řada je zmnožená, tvoří různě velké, často dosti objemné shluky. Může být přítomen tzv. posun doleva s většími elementy odpovídajícími proerytroblastům. Dysplastické rysy v době diagnózy nebývají nápadné, ale v průběhu onemocnění se mohou objevit. Jistý mírný stupeň dysplázie v červené řadě je u déle trvající PV možný a obvykle neznamená, že je současně přítomen myelodysplastický syndrom.

Podobně jako u ostatních Ph- MPN jsou v histologickém obrazu nejnápadnější a diagnosticky nejdůležitější změny megakaryopoézy. Megakaryocyty jsou zmnožené, někdy velmi nápadně. Běžně jeví tendenci ke shlukování, shluky jsou obvykle volné. Stupeň „dysplastických“ rysů megakaryocytů je nízký, buňky jsou zralé, bez nukleo-cytoplazmatické asynchronie.

Průkaz trojmocného železa berlínskou modří je u PV obvykle zcela negativní narozdíl od reaktivních, sekundárních polyglobulií, kde jsou pozitivní siderofágy běžné (18).

V době diagnózy bývá fibrotizace nízká (MF-0 nebo MF-1). V průběhu onemocnění se postupně rozvíjí pokročilá fibróza (MF-2 nebo MF-3). V terminální, postpolycytemické fázi (tzv. spent phase) je ve dřeni pravidlem obraz osteomyelosklerózy s nízkou buněčností (18) (obr. 2C). Shlukující se megakaryocyty mohou vykazovat výraznější “dysplastické” rysy. Postupně se zvyšuje podíl proliferující granulocytární řady s posunem doleva a dochází k úbytku erytropoézy. Histologické odlišení od pozdních fází PMF je běžně nemožné. Transformace onemocnění není častá, bývá předcházena fází akcelerace a přichází zhruba u 10 % případů.

Scottová et al. (19) popisuje 10 pacientů s mutací genu JAK2 v exonu 12, klinicky odpovídajících šestkrát PV a čtyřikrát označených jako idiopatická erytrocytóza (IE). V pěti případech, u kterých byla k dispozici trepanobiopsie (z nich dva s IE), pozorovali autoři mírnou hypercelularitu s výlučnou proliferací červené řady a s minimálními změnami v megakaryocytární linii. Na rozdíl od výsledků této práce u naší dosud nepublikované pacientky, která má PV s mutací JAK2 v exonu 12 diagnostikovanou ve 13 letech, jsme v trepanobiopsii odebrané až v průběhu léčby interferonem pozorovali obraz trilineární myeloproliferace se změnami prakticky neodlišitelnými od jiných PV.

PRIMÁRNÍ MYELOFIBRÓZA

Primární myelofibróza je klonální Ph-negativní myeloproliferace s proliferací megakaryocytární a granulocytární řady (odtud starší název „chronická granulocytární a megakaryocytární myelóza, CMGM“). Onemocnění je spojeno s postupnou reaktivní fibrotizací dřeně a rozvojem extramedulární hematopoézy zejména ve slezině (proto historické označení „agnogenní myeloidní metaplázie, AMM“ a „myelofibróza/skleróza s myeloidní metaplázií, MMM“). Aby byl nomenklaturní zmatek dokonalý, nezbývá než uvést ještě název uváděný v klasifikaci WHO z roku 2001 (20), což byla „chronická idiopatická myelofibróza, CIMF“. S ohledem na patogenezu onemocnění a sekundární charakter fibrotizace vyvolané působením růstových faktorů produkovaných zejména megakaryocyty (fibroblasty nejsou součástí nádorového klonu) (15) není ani název „primární myelofibróza“ ideální, proto můžeme s napětím čekat, co nám přinesou příští revize klasifikace WHO.

Diagnostická kritéria primární myelofibrózy podle WHO

Současná klasifikace WHO (4) se v definici PMF opírá o typický histologický obraz, vyloučení ostatních myeloproliferací a hematologických onemocnění a průkaz klonality onemocnění. Pokud není klonalita prokázána, je nezbytné vyloučit jiné příčiny fibrotizace dřeně. Jako malá kritéria se uvádí leukoerytroblastický krevní obraz, zvýšení LDH, anemie a splenomegalie. Ke třem hlavním kritériím se vyžaduje průkaz alespoň dvou vedlejších (tab. 3).

Prodromální stádium primární myelofibrózy

Požadavek klasifikace WHO na splnění dvou vedlejších kritérií znamená, že pro diagnózu PMF musí být potvrzen alespoň jeden z klinických znaků (leukoerytroblastický krevní obraz, anémie či splenomegalie), které jsou typické až pro pokročilé fáze onemocnění. Striktní aplikace klasifikace WHO tak prakticky vylučuje možnost diagnózy prefibrotické PMF (21). Řada zdrojů (pro přehled viz (13) odhaduje, že PMF se klinicky prezentuje v prodromální, prefibrotické fázi zhruba ve 40 – 50 %, nejčastěji pod klinickým obrazem esenciální trombocytémie. Kvasnicka a Thiele (13) popisují na retrospektivní sestavě 196 pacientů s histologicky diagnostikovanou prefibrotickou PMF při desetiletém sledování relativní riziko rozvoje významné fibrózy ve dřeni v 97 % a klinické progrese do obrazu MMM v 63 %. Modifikace diagnostického přístupu se ukazuje jako nezbytnost a v současnosti již na toto téma probíhá diskuze na mezinárodní (22) i české úrovni (23).

Histologický obraz primární myelofibrózy

V prefibrotické (MF-0) a časně fibrotické (MF-1) fázi onemocnění je kostní dřeň hypercelulární. Nejnápadnější je proliferace megakaryocytární řady (obr. 3A). Megakaryocyty jsou výrazně zmnoženy a běžně tvoří shluky, často v blízkosti kostních trámců. Přinejmenším část shluků je typicky kompaktní. Vzhled megakaryocytů je nápadně „dysplastický“. Buňky nabývají různé velikosti od velkých až po malé, u PMF se lze setkat s největšími megakaryocyty vůbec. Jádra mají hyperlobovaná až parohovitá, s jemným chromatinem, nebo častěji naopak výrazně hypolobovaná a hyperchromní až “obláčkovitá” včetně tzv. nahých jader. Barvitelnost cytoplazmy v základním barvení odrážející stupeň maturace se často liší i mezi buňkami sousedícími v tomtéž shluku.

Granulocytární řada je zmnožená, s posunem doleva, v chronické fázi onemocnění bez výraznějšího zmnožení blastů. Erytropoéza je často utlumená, nebo zhruba přiměřeně zastoupená. Výraznější zastoupení červené krvetvorby není pro PMF typické a zejména u prefibrotického stádia nutí pomýšlet na prepolycytemickou fázi PV.

V rozvinuté (MF-2) a pozdní (MF-3) fázi PMF je přítomna výrazná fibrotizace a postupně se přidávají i kostní změny až k obrazu OMS (obr. 1D). Zpočátku vysoká buněčnost může postupně klesat až k hypocelulárnímu obrazu. I zcela terminálně lze však zastihnout kompaktní shluky silně atypických megakaryocytů (obr. 3C). U OMS není fibrotizace a buněčnost distribuována ve dřeni rovnoměrně. Běžně se zastihnou intertrabekulární prostory, které jsou prostoupeny pouze tukovou tkání zcela bez hematopoetických buněk a fibrotizace.

Ve fibrotizované dřeni se zmnožují cévy, nápadná bývá intravaskulární hematopoéza v široce zejících sinusoidách. Poměrně časté jsou reaktivní malobuněčné lymfoidní infiltráty. Jak již bylo opakovaně zmíněno, je nutné cíleně pátrat po zmnožení blastů značícím akceleraci nebo transformaci onemocnění.

PMF s mutacemi genu MPL W515L/K podle Husseina et al. (24) nevykazují na histologické úrovni diagnosticky významné odlišnosti od obrazu popisovaného u ostatních případů PMF buď s mutací JAK2 V617F, nebo bez molekulárního markeru. Naopak Vannucchi et al. (29) připouští, že se tyto případy mohou lišit nižším zastoupením erytropoézy a některými klinickými rysy.

ESENCIÁLNÍ TROMBOCYTÉMIE

Esenciální trombocytémie je Ph-negativní myeloproliferace s izolovanou proliferací megakaryocytů vedoucí k často extrémnímu zmnožení trombocytů v periferní krvi, s typickým histologickým obrazem v kostní dřeni.

Klinický záchyt trombocytózy je běžný (viz dále) a v diferenciální diagnóze je nutno odlišit zejména reaktivní stavy různé etiologie – nejčastěji při depleci Fe, vzácněji i při jiných zhoubných hematologických a nehematologických nádorech. Jak už bylo naznačeno, myeloproliferace prezentující se zvýšením počtu destiček a které podle kritérií PVSG odpovídají esenciální trombocytémii, ve skutečnosti mohou být (a často jsou) iniciální fází primární myelofibrózy, polycythaemia vera, nebo dokonce chronické myeloidní leukémie. V širší diferenciální diagnóze jsou i myelodysplázie, např. 5q- syndrom, či myelodysplastická a myeloproliferativní onemocnění typu refrakterní anémie s prstenčitými sideroblasty a výraznou trombocytózou (RARS-T). Ph-negativní myeloproliferace s trombocytózou (MPN-T) jsou sice morfologicky heterogenní skupina s odlišnou prognózou v delší perspektivě, ale v době záchytu je spojuje klinický obraz, nebezpečí rozvoje závažných komplikací (trombotické příhody, krvácení) a terapeutický přístup zaměřený na snížení počtu trombocytů.

Esenciální trombocytémie diagnostikovaná striktně s využitím kritérií WHO jeví minimální tendenci k výraznější fibrotizaci dřeně a k transformaci do sekundární akutní leukémie (25). Takové případy se z části připisují primárně chybné diagnóze, kdy nebyla rozpoznána běžnější prefibrotická fáze PMF, nebo podávání cytotoxické terapie, jejíž fibrogenní a transformační potenciál se v literatuře diskutuje (26).

Diagnostická kritéria esenciální trombocytémie podle WHO

Klasifikace WHO (4) vyžaduje přítomnost trvalého zvýšení počtu trombocytů nad 450x10⁹/L. Histologický obraz v trepanobiopsii kostní dřeně musí odpovídat definici ET, čímž se současně vylučují jiné myeloproliferace a ostatní myeloidní neoplázie (viz výše) i reaktivní trombocytóza. Posledním nezbytným kritériem je průkaz přítomnosti mutace genu JAK2 nebo jiný znak klonálního procesu, při jeho absenci musí být klinicky vyloučena druhotná povaha zmnožení trombocytů (např. deficit železa, stav po splenektomii, chirurgický zákrok, infekce, zánětlivé onemocnění, systémová onemocnění, generalizace zhoubného nádoru a lymfoproliferace) (tab. 4).

Prodromální stádium esenciální trombocytémie

V analogii s prepolycytemickou polycytemií a prefibrotickou primární myelofibrózou se nabízí otázka, zda existuje také “pretrombocytemická trombocytémie”. Z pohledu obecné biologie je pravděpodobné, že ve zcela iniciálních fázích onemocnění koexistuje ve dřeni nádorový klon s původní krvetvorbou a počet vyplavovaných trombocytů ještě nedosahuje arbitrárně stanovených hodnot pro diagnózu. Nicméně jedná se o patologické trombocyty a je tudíž možné, že mohou být zdrojem klinických komplikací, někdy i závažných. V literatuře jsou vzácně popsány případy, které tuto hypotézu potvrzují. Příkladem je práce francouzské skupiny (27), která u 45 pacientů se splanchnickou trombózou při normálním nebo nízkém hematokritu a bez signifikantního zvýšení počtu trombocytů v 17 případech prokázala latentní myeloproliferaci nejčastěji charakteru ET buď laboratorně (mutace JAK2, hladina erytropoetinu, tvorba endogenních erytroidních nebo megakaryocytárních kolonií in vitro), histologicky v kostní dřeni anebo v 9 případech oběma způsoby. Popsány jsou i ojedinělé případy “pretrombocytemické” ET s mutací genu MPL W515K (28).

Histologický obraz esenciální trombocytémie

V typickém případu ET je v kostní dřeni normocelulární trilineární hematopoéza bez výraznějších změn granulopoézy či erytropoézy. Zmnožené jsou pouze megakaryocyty (obr. 4A, B), které tvoří shluky a v menší části případů se mohou přesunovat do peritrabekulární oblasti. Shluky jsou volné. Kromě tvorby shluků (definovaných jako skupina tří a více elementů) se někdy k sobě těsně přibližují jen dvě buňky („líbající se megakaryocyty“). Megakaryocyty jsou často větší, jádra mají přiměřeně členěná nebo hyperlobovaná, „parohovitá“, s jemným chromatinem, bez nukleocytoplazmatické asynchronie.

Fibrotizace je z definice zcela nepřítomna, nebo je pouze jemná a fokální (MF-0 podle EUMNET, stupeň 0 a 1 podle Bauermeistera).

Případy ET s prokázanou mutací genu MPL W515L/K se na histologické úrovni významně neliší od pacientů s mutací JAK2 nebo bez jakékoli prokázané mutace (29).

DIFERENCIÁLNÍ DIAGNÓZA Ph-NEGATIVNÍCH MYELOPROLIFERACÍ S TROMBOCYTÓZOU

Izolované nebo dominující zvýšení počtu trombocytů je tak běžným úvodním projevem myeloproliferací, že si praxe vynutila vymezení skupiny Ph-negativních myeloproliferativních neoplázií s trombocytózou. Jejich diferenciální diagnóza je běžným klinickým i histologickým úkolem a zahrnuje celé spektrum MPN i četných jiných myeloidních nádorů.

Esenciální trombocytémie

Klasifikace podle kritérií PVSG většinu MPN-T řadí do rámce ET. Kritéria WHO opírající se o histologický obraz ve dřeni však vyžadují typický histologický obraz normocelulární hematopoézy bez výraznější fibrotizace a izolovanou proliferaci megakaryocytů bez nápadnější cytologické nepravidelnosti a bez tvorby kompaktních shluků. S využitím těchto kritérií tvoří ET zhruba 20 % všech MPN-T a stává se tak nejméně častým typem Ph- MPN vůbec (30).

Primární myelofibróza

Hypercelulární hematopoéza, přítomnost alespoň části silně atypických „dysplastických“ megakaryocytů, záchyt nejméně jednoho kompaktního shluku megakaryocytů a eventuální fibrotizace jsou rysy, které prakticky vylučují diagnózu ET a klasifikují proces jako PMF (25). V době diagnózy převládají případy bez fibrotizace (MF-0) a případy s jemnou fibrotizací (MF-1) zastoupené zhruba stejným dílem. Úplnou výjimkou však není v době záchytu onemocnění ani pokročilá retikulinová fibrotizace (MF-2) (30).

Polycythaemia vera

Hypercelulární dřeň s proliferací všech tří řad včetně červené při minimálních “dysplastických” změnách megakaryocytů nutí vyloučit možnost prepolycytemické fáze PV. Prokazuje se mutace JAK2, hodnoty hemoglobinu anebo hematokritu bývají při horní hranici normy. Odlišení od JAK2+ esenciální trombocytémie může být obtížné. V ojedinělých případech byla popsána polycytemická transformace JAK2+ ET (24) spojená se zvýšením počtu mutantních alel JAK2 a se změnou histologického obrazu. V případě diskrepance mezi typickým histologickým obrazem PV s jen mírným zvýšením hodnot červeného krevního obrazu nepřesahujícím hodnoty „cut-off“ a při nepřítomnosti mutace JAK2 lze případ provizorně uzavřít jako “Ph- MPN, blíže neurčená, s rysy prepolycytemické PV” (31).

Ph-negativní myeloproliferativní neoplázie, blíže neurčená

U méně než 10 % případů se nemusí zdařit přesná typizace onemocnění a diagnóza je uzavřena jako Ph- MPN, blíže neurčená. Je vhodné v závěru uvést diferenciální diagnózu a diskutovat důvody pro nejednoznačnost nálezu. Část rozpaků lze vyřešit korelací s klinickým obrazem a laboratorními nálezy, které v době odečítání trepanobiopsie ještě nemusí být k dispozici. V některých případech přinese rozlišení průběh onemocnění a případně další trepanobiopsie provedená s časovým odstupem.

Při diskrepanci mezi klinickým a histologickým obrazem je nezbytné pacienta sledovat a vyloučit reaktivní proces.

Reaktivní trombocytóza

U reaktivní trombocytózy je buněčnost dřeně, zastoupení granulocytární a erytroidní řady či přítomnost fibrotizace velmi variabilní v závislosti na příčině, běžná je též přítomnost siderofágů. Zásadním rozdílem proti ET a myeloproliferacím obecně v histologickém obrazu je vzhled megakaryopoézy. Megakaryocyty obvykle nebývají výrazněji zmnožené, nikdy netvoří shluky a jsou přiměřeného vzhledu (obr. 4C).

Refrakterní anémie s prstenčitými sideroblasty a s výraznou trombocytózou

Refrakterní anémie s prstenčitými sideroblasty a s výraznou trombocytózou je provizorně definovaná jednotka ze skupiny myelodysplastických/myeloproliferativních neoplázií, která nese ve velkém procentu případů mutaci genu JAK2. Dřeň u RARS-T je obvykle hypercelulární, vzhled megakaryocytů připomíná ET, ale hojná erytropoéza vykazuje dysplastické rysy s výraznou variabilitou kalibru jader, tvorbou nepravidelných, často objemných shluků anebo rozptýlením erytropoetických elementů i do peritrabekulární oblasti. Průkaz prstenčitých sideroblastů s cytoplazmatickou perinukleární depozicí železitého pigmentu je doménou cytochemického vyšetření, histologicky v trepanobiopsii nemohou být rozpoznány.

Myelodysplastický syndrom

U myelodysplastického syndromu s izolovanou delecí 5q (5q- syndrom, del(5q) syndrom) se pozoruje variabilně buněčná hematopoéza s dysplastickými rysy, patrnými zejména v červené a megakaryocytární řadě. Megakaryocyty jsou zmnožené, s mírnou tendencí ke shlukování, obvykle jsou menší, typicky s hypolobovaným, oválným až kulatým jádrem nikoli hyperchromním. Obdobné změny se pozorují i u jiných typů MDS, které mohou být vzácně spojené se zmnožením trombocytů.

ZÁVĚR

Trepanobiopsie kostní dřeně odebraná před započetím cytoreduktivní terapie je podle současné klasifikace WHO při diagnostice Ph-negativních myeloproliferací, a zejména u myeloproliferací s trombocytózou, nezbytné, nikoli však jediné postačující vyšetření k přesnému zařazení onemocnění. Podobně jako v jiných oborech medicíny je i diagnostika Ph- MPN práce týmová a dobrá spolupráce klinika s patologem významně urychlí a zpřesní diagnózu, což je zcela jistě v zájmu toho nejdůležitějšího v celém procesu – a to je nepochybně pacient.

PODĚKOVÁNÍ

Děkuji MUDr. J. Schwarzovi, CSc. za cenné připomínky k textu.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Vít Campr
Ústav patologie a molekulární medicíny
2. lékařská fakulta UK a Fakultní nemocnice v Motole, Praha
V Úvalu 84, Praha 5, 150 06
tel.: 224435619, fax: 224435620
email: vcampr@yahoo.com