Antibiotická rezistence u netyfových sérovarů Salmonella spp. v České republice

Souhrn

Cíl práce:
Zjistit antibiotickou rezistenci a frekvenci výskytu multirezistentních kmenů u netyfových sérovarů salmonel, izolovaných od lidí.

Materiál a metodiky:
Konsekutivní izoláty salmonel, izolované v průběhu studie od pacientů ve 48 mikrobiologických laboratořích v průběhu měsíce května roku 2012, byly analyzovány v příslušných referenčních laboratořích SZÚ. Kmeny byly reidentifikovány a byly zjištěny jejich sérovary. K zjištění citlivosti byla použita mikrodiluční metoda stanovení minimálních inhibičních koncentrací 11 antibiotik.

Výsledky:
Mezi celkem 25 sérovary, zjištěnými v souboru 637 kmenů Salmonella enterica, byl nejpočetněji zastoupen sérovar Enteritidis (87,0 %), následoval sérovar Typhimurium (4,9 %), monofázická varianta Typhimurium 4,[5],12:i:- (2,0 %) a Mbandaka (0,6 %), kmeny ostatních sérovarů se vyskytovaly ojediněle. Celkem 558 kmenů (87,6 %) bylo citlivých ke všem vyšetřovaným antibiotikům, ostatní kmeny (n = 79) byly rezistentní k jednomu nebo k více antibiotikům.

Prevalence rezistence v celém souboru 637 kmenů k jednotlivým antibiotikům byla následující:
ampicilin 8,5 %, tetracyklin 5,7 %, sulfamethoxazol 5,2 %, ciprofloxacin 3,8 %, chloramfenikol 2,5 %, kmeny rezistentní ke gentamicinu, trimethoprimu a cefalosporinům 3. a 4. generace se vyskytly jen ojediněle (≤ 0,5 %), k meropenemu nebyl rezistentní žádný kmen. Tři producenti širokospektré betalaktamázy byli multirezistentní, a u dvou z nich izolovaných od dvojčat byl zjištěn odlišný vzor rezistence.

Mezi rezistentními kmeny byl nejčastěji zastoupen sérovar Enteritidis (49,4 %), následovaly sérovary Typhimurium (26,6 %) a monofázická varianta Typhimurium (15,2 %). Zatímco podíl rezistentních kmenů mezi všemi kmeny sérovaru Enteritidis v souboru byl pouze 7% (39 z 554 kmenů), u sérovarů Typhimurium a jeho monofázické varianty 4,[5],12:i:- činil podíl rezistentních kmenů 66,7 %, respektive 92,3 %. Rezistentní byly dále všechny kmeny sérovarů Virchow (n = 3), Kentucky (n = 1), Newport (n = 1), dva ze tří kmenů sérovaru Infantis, a jeden ze dvou kmenů sérovaru Stanley. Všech pět izolátů z krve patřilo k sérovaru Enteritidis, jeden z nich byl rezistentní k ciprofloxacinu. Mezi 79 rezistentními kmeny bylo 26,6 % samostatně rezistentních k ampicilinu a 24,1 % k ciprofloxacinu, multirezistence (rezistence ke třem a více antibiotikům) byla potvrzena u 43,0 % kmenů.

Závěry:
Přes relativně nízkou prevalenci rezistence k vyšetřovaným antibiotikům v souboru 637 kmenů byly shledány tyto znepokojivé nálezy: výskyt kmenů Salmonella enterica rezistentních k lékům volby salmonelových infekcí ciprofloxacinu nebo k cefalosporinům vyšších generací, a prevalence multirezistence u dvou třetin kmenů sérovaru Typhimurium a s výjimkou jednoho u všech kmenů jeho monofázické varianty 4,[5],12:i:-.

Klíčová slova:
netyfové salmonely – sérovary – antibiotická rezistence

ÚVOD

Netyfové kmeny salmonel jsou v současné době druhou nejčastější příčinou bakteriálních gastroenteritid v zemích Evropské unie [1]. Nekomplikovaná onemocnění způsobená salmonelami jsou obvykle samoúzdravná a jejich léčba vyžaduje nejvýše podpůrná opatření sestávající z náhrady tekutin a odpočinku. Podání antibiotik v těchto případech naopak vylučování salmonel prodlužuje [2]. Sérovary netyfových salmonel jsou geneticky blízce příbuzné, některé z nich jsou však častěji spojeny se vznikem invazivních infekcí [3]. Léčba účinnými antibiotiky je nezbytná u pacientů se salmonelovou bakteriémií, meningitidou, infekcí kloubů, nebo i u gastroenteritid osob se základním oslabujícím onemocněním, dětí mladších dvou měsíců věku, v těhotenství a u starších pacientů [2].

Zdrojem infekcí jsou téměř výlučně nedostatečně tepelně upravené potraviny živočišného původu, kontaminované salmonelami při výrobě, zpracování, skladování nebo distribuci. Používání antibiotik v chovech zvířat primárně selektuje kmeny salmonel s antibiotickou rezistencí, jejichž frekvence výskytu je mnohonásobně vyšší než u lidí [1]. Jak ukázal první nález salmonel rezistentních ke kolistinu u 21 % prasat, jimž byl kolistin podáván v potravě [4], může být tento proces zisku rezistence velmi rychlý v důsledku vysoké mutační rychlosti, která je u kolistinu mnohonásobně vyšší než u jiných antibiotik [5]. Fluorochinolony jsou dokonce schopny selektovat salmonely s mnohočetnou antibiotickou rezistencí [6]. U kmenů salmonel, izolovaných od potravinových zvířat, byly prokázány geny rezistence ke všem antibiotikům používaným v humánní medicíně včetně plazmidy šířené rezistence k fluoro­chinolonům [7, 8, 9], cefalosporinům vyšších generací [9] a karbapenemům [10].

Z těchto důvodů je zapotřebí sledovat stav a trendy antibiotické rezistence k antibiotikům doporučovaným k léčbě salmonelových infekcí, zejména k cefalosporinům vyšších generací a fluorochinolonům [2], a také k dalším antibiotikům, významným z hlediska epidemiologie rezistence.

Naše předchozí studie, provedená v roce 2000, ukázala poměrně nízkou prevalenci antibiotické rezistence salmonel izolovaných od lidí [11]. Vzhledem k tomu, že rezistence salmonel se v čase může měnit, rozhodli jsme se zjistit:

1. celkovou prevalenci antibiotické rezistence salmonel izolovaných od lidí během jednoho měsíce roku 2012,
2. výskyt rezistence u jednotlivých sérovarů,
3. frekvenci výskytu multirezistentních kmenů.

MATERIÁL A METODY

Organizace studie. V první polovině roku 2012 byly vyzvány mikrobiologické laboratoře, sdružené v Pracovní skupině pro monitorování rezistence při Národní referenční laboratoři (NRL) pro antibiotika SZÚ Praha, aby se zúčastnily sběru kmenů salmonel, izolovaných v průběhu měsíce června.

Laboratoře. Sběru se zúčastnilo 48 mikrobiologických laboratoří. Do souboru byly zařazeny konsekutivní kmeny salmonel, izolované při rutinním mikrobio­logickém vyšetřování klinických vzorků pacientů. Opakované izoláty od jednoho pacienta byly vyřazeny. Laboratoře zasílaly kmeny a základní údaje o pacientech do SZÚ, kde v NRL pro salmonely byly kmeny podrobně identifikovány a v NRL pro antibiotika byla vyšetřena jejich citlivost.

Kmeny. Izoláty na transportních půdách byly okamžitě po doručení do NRL pro salmonely zpracovávány metodami běžně používanými v rámci klasifikace čeledi Enterobacteriaceae, včetně systému MALDI TOF – Biotyper. Z celkem 674 kmenů, zaslaných v rámci této studie zúčastněnými laboratořemi, bylo v NRL pro salmonely vyřazeno 37 kmenů (dva kmeny nevyrostly, 7 kmenů byly jiné druhy čeledi Enterobacteriaceae, a 28 kmenů byly opakované izoláty od jednoho pacienta). U konfirmovaných kmenů byl specifikován sérotyp. Sérologická diagnostika byla prováděna metodou sklíčkové aglutinace s komerčními hyperimunními králičími séry několika výrobců (SIFIN, BioRad, Denka Seiken a Reagensia). Zařazení k jednotlivým sérovarům bylo provedeno na základě antigenní formule podle Whitteova-Kauffmannova--Le Minoreova schématu [12]. Kmeny identifikované jako monofázická varianta Typhimurium (sérotyp S.4,[5],12:i:-) byly dotypovány rovněž pomocí PCR průkazu genů fliB-fliA a fljB, které jsou specifické pro sérovar Typhimurium nebo kódují protein druhé bičíkové fáze.

Kmeny byly uchovávány na kryokonzervách a před vyšetřením antibiotické citlivosti vyočkovány na živný agar.

Vyšetření citlivosti. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) antibiotik byly vyšetřeny mikrodiluční metodou pro gramnegativní střevní tyčky [13]. Pro studii byly připraveny mikrotitrační destičky s 11 antibiotiky v Muellerově-Hintonové bujonu. Zdrojem většiny antibiotik byly tablety Mast, jen substance sulfamethoxazolu byla od firmy Merck. Rozmezí osmi koncentrací antibiotik ředěných dvojnásobně geometrickou řadou bylo následující: 8–0,063 mg/l pro cefotaxim, ceftazidim, cefepim, meropenem, gentamicin, trimethoprim, 32 – 0,25 mg/l pro ampicilin a tetracyklin, 64 – 0,5 mg/l pro chloramfenikol a 512 – 8 mg/l pro sulfamethoxazol. K přípravě testovacích destiček bylo použito rozplňovací zařízení Dynex pro přípravu mikrotitračních destiček s antibiotiky v 96 jamkách. Destičky s antibiotiky byly uchovány při -80 °C. K hodnocení a interpretaci výsledků podle klinických breakpointů antibiotik byla použita příslušná kritéria [14, 15]. Produkce širokospektré betalaktamázy byla vyšetřena podle doporučené diskové metody [16].

VÝSLEDKY

Soubor kmenů. V souboru 637 kmenů převažovaly kmeny ze stolice (98,9 %), 5 kmenů (0,8 %) pocházelo z krve, dalších 6 kmenů mimostřevního původu tvořily izoláty z moči, hnisu a výtěr z pochvy, u 13 kmenů nebyl původ udán. Všechny kmeny patřily k druhu Salmonella enterica a zahrnovaly celkem 25 sérovarů. Nejčastěji byl izolován sérovar Enteritidis, který tvořil 89,6 % kmenů souboru, následovaly sérovary Typhimurium (4,7 %), jeho monofázická varianta 4,[5],12:i (2,0 %) a Mbandaka (0,6 %), ostatní sérovary se vyskytovaly v méně než v 0,6 %. Všech pět izolátů z krve patřilo k sérovaru Enteritidis. Přehled sérovarů a počet kmenů jednotlivých sérovarů v souboru uvádí tabulka 1.

Rezistence k antibiotikům. Rozmezí MIC antibiotik a koncentrace inhibující 50 % a 90 % kmenů jsou uvedeny v tabulce 2. Hodnoty MIC50 a MIC90 jsou u osmi z jedenácti antibiotik identické, u ampicilinu, gentamicinu a trimethoprimu jsou hodnoty MIC90 vyšší než MIC50 jen o jeden stupeň ředění dvojnásobně geometrickou řadou. V tabulce 2 jsou dále uvedeny breakpointy antibiotik pro kategorizaci citlivosti EUCAST [14], které platí jako standard v zemích Evropské unie, a pro tetracyklin a sulfamethoxazol, které EUCAST neuvádí, jsou použita kritéria Clinical and Laboratory Institute, USA [15]. Kmeny, inhibované vyšší koncentrací antibiotika než je koncentrace udaná jako breakpoint pro citlivost, jsou rezistentní (a zahrnují i kmeny s intermediární rezistencí). Celkem 558 kmenů (87,6 %) bylo citlivých ke všem vyšetřovaným antibiotikům. K ampicilinu bylo rezistentních nejvíce kmenů (8,5 %), k tetracyklinu 5,7 % kmenů, k sulfamethoxazolu (a tudíž ke skupině sulfonamidů) 5,2 %, k ciprofloxacinu (a k ostatním fluorochinolonům) 3,8 % a k chloramfenikolu 2,5 % kmenů. Žádný kmen nebyl rezistentní k meropenemu, počet kmenů rezistentních ke gentamicinu, k trimethoprimu, cefalosporinům 3. generace cefotaximu a ceftazidimu a cefalosporinu 4. generace cefepimu nepřesáhl 0,5 %. Čtyři z pěti kmenů izolovaných z krve byly citlivé ke všem vyšetřovaným antibiotikům, jeden kmen byl rezistentní k ciprofloxacinu (MIC 0,25 mg/l).

Rezistentní sérovary. Mezi 637 kmeny salmonel bylo 79 kmenů (12,4 %) rezistentních k jednomu nebo více z 11 vyšetřovaných antibiotik. Rezistentní kmeny patřily k osmi z celkového počtu 25 sérovarů. Názvy všech sérovarů zastoupených v souboru a distribuce rezistentních kmenů u osmi sérovarů jsou v tabulce 1. Počet rezistentních kmenů v celkovém počtu kmenů jednotlivých sérovarů byl následující: 39 z 554 kmenů sérovaru Enteritidis (7 %), 20 z 30 kmenů (66,7 %) sérovaru Typhimurium a 12 ze 13 kmenů (92,3 %) monofázické varianty Typhimurium, dva ze tří kmenů sérovaru Infantis, jeden ze dvou kmenů sérovaru Stanley, jediný kmen sérovarů Kentucky a Newport a všechny tři kmeny sérovaru Virchow (viz tab. 2). Polovina rezistentních kmenů byla monorezistentní jen k ampicilinu (26,6 %), respektive jen k ciprofloxacinu (24,1 %), téměř všechny zbývající kmeny byly multirezistentní (43,0 %), to znamená rezistentní ke třem a více skupinám antibiotik (tab. 3). Tři kmeny, u nichž byla potvrzena produkce širokospektré betalaktamázy (ESBL), patřily k sérovaru Typhimurium a pocházely od dětí z jedné lokality. Producenti ESBL od ročního dítěte a jednoho z pětiletých dvojčat měli stejný vzor rezistence ke třem skupinám antibiotik, zatímco izolát od druhého z dvojčat byl rezistentní k pěti skupinám antibiotik (viz tab. 3). Tyto kmeny jsou dále analyzovány a výsledky budou zveřejněny v samostatné publikaci.

DISKUSE

Pro hodnocení výsledků je soubor 637 kmenů salmonel dostatečně reprezentativní, neboť představuje 67 % případů salmonelóz uvedených v databázi EPIDAT v měsíci červnu 2012 [17]. Počet izolátů z krve byl v našem souboru konsekutivních izolátů nízký (0,8 %), v podobných souborech kmenů se uvádí prevalence izolátů salmonel z krve zhruba 5 % [3], respektive 5,9 % [18].

Nejpočetnější v Evropě [1] i v USA [18] jsou sérovary Enteritidis a Typhimurium. Také v našich souborech kmenů z let 2000 [11] a 2012 byly tyto dva sérovary zastoupeny nečastěji. Sérovar Choleraesuis, který patří mezi nejvirulentnějšího původce invazivních infekcí [3], nebyl v našem souboru přítomen, všechny kmeny z krve patřily k sérovaru Enteritidis.

K vyšetření citlivosti k antibiotikům bylo použito stanovení hodnot minimálních inhibičních koncentrací (MIC). Výsledky získané touto metodou spolehlivě prokazují rezistentní fenotypy salmonel, neboť vysoce korelují s průkazem příslušných genů rezistence [19]. V našem souboru bylo 87,9 % kmenů plně citlivých ke všem vyšetřovaným antibiotikům. Podíl plně citlivých kmenů se ve světě liší, například v souboru téměř 20 000 humánních izolátů salmonel v USA bylo plně citlivých 70,3 % kmenů, a značné rozdíly jsou i v souborech humánních i veterinárních kmenů mezi jednotlivými evropskými zeměmi [1]. Rozdíly vyplývají z odlišností v množství a spektru antibiotik používaných v různých zemích pro humánní a veterinární účely. Pro stanovení pozice jednotlivých antibiotik v dané zemi je proto nezbytné používat vlastní data.

Ciprofloxacin patří mezi léky volby salmonelových infekcí. Klinický breakpoint ciprofloxacinu pro citlivé kmeny Salmonella spp. (≤ 0,063 mg/l) je téměř 8krát nižší, než pro ostatní Enterobacteriaceae (≤ 0,5 mg/l). Klinické důkazy totiž potvrzují špatnou odpověď na ciprofloxacin u celkových infekcí způsobených kmeny salmonel i s nízkým stupněm fluorochinolonové rezistence (MIC 0,063–0,25 mg/l) [14]. V roce 2000 bylo rezistentních k ciprofloxacinu 0,78 % kmenů [11], a v roce 2012 (tato studie) jejich počet několikanásobně vzrostl (3,8 % kmenů), převážně se jednalo o kmeny s monorezistencí.

Za pozornost stojí výskyt tří kmenů sérovaru Typhimurium, rezistentních v důsledku produkce širokospektré betalaktamázy (ESBL) k cefalosporinům 3. a 4. generace cefotaximu a ceftazidimu, respektive cefepimu, a multirezistentních k dalším antibiotikům. V roce 2000 byly prokázány dva kmeny sérovaru Enteritidis a Typhimurium (z celkového počtu 2441 salmonel) rezistentní k cefalosporinům 3. generace, které ESBL neprodukovaly [11]. První výskyt dvou kmenů sérovaru Enteritidis produkujících ESBL u nás byl zaznamenán v roce 2003 [20] a stejně jako u kmenů z roku 2012 byly tyto kmeny v epidemiologické souvislosti, multirezistentní, avšak s rozdílnou rezistencí k jednotlivým antibiotikům. Tyto kmeny budou podrobněji analyzovány.

Podíl kmenů nejpočetnějšího sérovaru Enteritidis, rezistentních k jednomu nebo k více antibiotikům byl jen 7%. U sérovaru Typhimurium a jeho monofázické varianty převládala multirezistence u dvou třetin, respektive u všech kmenů. Tyto sérovary se Evropou šíří pandemicky a v posledních 10 letech se jejich prevalence markantně zvyšuje u salmonel z humánních infekcí i v mase prasat, která jsou pravděpodobným zdrojem infekce [21]. Kromě charakteristické rezistence ke starším antibiotikům lze u těchto sérovarů za zvlášť závažný pokládat výskyt rezistence k cefalosporinům a karbapenemům u kmenů z potravinových zvířat [1, 9, 10], neboť tato antibiotika jsou nepostradatelnými léky invazivních salmonelových infekcí u lidí. Strategie kontroly zahrnuje zlepšení hygieny a příslušných zdravotnických opatření, přípravu a pečlivé dodržování návodů pro uvážlivé používání antibiotik a zavedení příslušných bezpečnostních opatření ke snížení vzniku a šíření salmonel rezistentních k antibiotikům [21].

Do redakce došlo dne 5. 2. 2013.

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Pavla Urbášková, CSc.

Státní zdravotní ústav

Šrobárova 48

100 42 Praha 10

e-mail: purbaskova@szu.cz