Sekvenační analýza antigenů zařazených v čtyřkomponentní vakcíně proti meningokoku B v českých izolátech Neisseria meningitidis v období 2007–2013

Súhrn

Cíl práce:
Studium antigenů zařazených do nově registrované čtyřkomponentní vakcíny proti meningokoku B (MenB vakcína), vyrobené metodou reverzní vakcinologie a posouzení vhodnosti použití této vakcíny v České republice.

Materiál a metodiky:
Na českých izolátech Neisseria meningitidis byly studovány čtyři antigeny: fHbp (factor H binding protein), NHBA (Neisseria Heparin Binding Antigen), NadA (Neisserial adhesin A), a protein zevní membrány buněčné PorA P1.4. Celkem bylo studováno 304 izolátů N. meningitidis z období 2007-2013: 262 izolátů z invazivního meningokokového onemocnění (203 N. meningitidis B, 59 N. meningitidis non-B) a 42 izolátů od zdravých nosičů.

Výsledky:
Přítomnost genu peptidového antigenu fHbp byla zjištěna u všech sledovaných izolátů získaných z invazivního meningokokového onemocnění i u izolátů od zdravých nosičů. Byly zjištěny rozdíly v zastoupení variant fHbp mezi izoláty z invazivního meningokokového onemocnění a izoláty od zdravých nosičů. U izolátů z invazivního meningokokového onemocnění (B i non-B) převažovala varianta fHbp1, zatímco u izolátů od zdravých nosičů převažovala varianta fHbp2. Přítomnost genu nhba peptidového antigenu NHBA byla zjištěna u všech sledovaných izolátů z invazivního meningokokového onemocnění i u izolátů od zdravých nosičů. U izolátů séroskupiny B z invazivního meningokokového onemocnění bylo zastoupení jednotlivých variant NHBA peptidu odlišné oproti izolátům z invazivního meningokokového ­onemocnění non-B. Rovněž u izolátů od zdravých nosičů bylo zastoupení jednotlivých variant NHBA peptidu odlišné oproti izolátům z invazivního meningokokového onemocnění. Přítomnost genu ­nadA ­peptidového antigenu NadA byla zjištěna pouze u 26,6 % sledovaných izolátů získaných z invazivního meningokokového onemocnění B a u 40,7 % invazivního meningokokového onemocnění non-B. U izolátů od zdravých nosičů byla přítomnost genu nadA zjištěna pouze u 4,8 %. Protein PorA P1.4 obsažený v nové MenB vakcíně byl zjištěn pouze u dvou izolátů N. meningitidis B z invazivního meningokokového onemocnění z celkem 262 izolátů B i non-B, u nosičských izolátů nebyl zjištěn vůbec. Izoláty z invazivního meningokokového onemocnění (B i non-B) jsou v první řadě pokryté kombinací antigenů NHBA + fHbp1, na druhém místě je samotný antigen NHBA a na třetím místě kombinace antigenů NHBA + fHbp1 + NadA-1+2/3. Izoláty od zdravých nosičů vykazují odlišné pokrytí: na prvním místě je samotný antigen NHBA a na druhém místě kombinace antigenů NHBA + fHbp1.

Závěry:
Antigeny zařazené do čtyřkomponentní MenB vakcíny byly sekvenací zjištěny u vysokého procenta českých izolátů N. meningitidis z invazivního meningokokového onemocnění i od zdravých nosičů. Tato čtyřkomponentní MenB vakcína registrovaná v Evropě v lednu 2013 je vhodná pro použití v České republice.

Klíčová slova:
MenB vakcína – GNA (Genome-derived Neisserial Antigens) – fHbp (factor H binding protein) – NHBA (Neisseria Heparin Binding Antigen) – NadA (Neisserial adhesin A) – protein zevní membrány buněčné PorA P1.4

ÚVOD

Invazivní meningokokové onemocnění (IMO) představuje i v současné době medicínského pokroku závažný problém vzhledem k vysoké smrtnosti (průměrná smrtnost 10 % i v rozvinutých zemích, u hypervirulentních komplexů může dosáhnout i více než 25 %) a nebezpečí vzniku trvalých následků (nekrózy končetin, psychické či motorické poruchy, slepota, hluchota). Ideální prevencí vzniku IMO je vakcinace a v řadě zemí byla meningokoková konjugovaná vakcína zařazena do národního imunizačního programu. Meningokoková konjugovaná vakcína byla vyvinuta navázáním (konjugováním) skupinově specifického kapsulárního polysacharidu Neisseria meningitidis na proteinový nosič jako monovakcína proti séroskupině C nebo tetravakcína proti séroskupinám A, C, Y, W135. Tato technologie však selhala při pokusech o výrobu vakcíny proti séroskupině B, vzhledem k heterogenitě a nízké imonogenicitě tohoto polysacharidu.

Od osmdesátých let 20. století začala být používána technologie výroby vakcíny proti meningokoku séroskupiny B (MenB vakcína) z nekapsulárních antigenů zevní proteinové membrány (OMP, Outer Membrane Protein), porinů. Touto metodou byly vyrobeny „porin-based“ MenB vakcíny. Nevýhodou těchto vakcín však je, že působí pouze proti meningokoku, z jehož nekapsulárních antigenů byly vyrobeny a nemají univerzální účinnost proti všem meningokokům séroskupiny B. Pro ČR se ukázaly tyto vakcíny jako nevhodné.

Teprve sekvenace celého genomu N. meningitidis [1, 2] otevřela cestu převratné technologii výroby nové vakcíny univerzálně účinné: metodě reverzní vakcinologie [3, 4, 5]. Zpočátku bylo definováno cca 350 antigenů, které byly exprimovány v Escherichia coli a po purifikaci byla na myších testována jejich imunogenicita. Výsledky těchto studií vyústily ve výběr několika kandidátních antigenů, které jsou označované Genome-derived Nesserial Antigen (GNA) a byly plánované v různých kombinacích k zařazení do této nové, geneticky připravené vakcíny. Dostupné literární údaje naznačují, že některé GNA jsou přítomny v izolátech N. meningitidis z různých zemí ve vysokém procentu, zatímco jiné se vyskytují pouze u malé části izolátů působících IMO [6, 7, 8, 9]. Studium přítomnosti GNA umožňuje predikci účinnosti nových meningokokových vakcín a jeho realizace v jednotlivých zemích byla doporučena na zasedání EMGM (European Monitoring Group on Meningococci) v roce 2009. Světová literatura rovněž ukazuje, že potenciál nové geneticky vyrobené meningokokové vakcíny přesahuje séroskupinu B-GNA byly zjištěny i v jiných séroskupinách [6, 7, 10] a že vzhledem k zjištěné přítomnosti GNA i u nosičských meningokoků [11] lze očekávat i postvakcinační redukci nosičství N. meningitidis a tím snížení nemocnosti i v neočkovaných věkových skupinách (popisováno jako „herd“ efekt u konjugovaných vakcín).

Vakcíny vyrobené metodou reverzní vakcinologie se jeví nadějné pro použití v České republice k prevenci IMO způsobeného séroskupinou B. Předtím je však nezbytné provést analýzu pokrytí N. meningitidis B působících IMO v České republice těmito novými vakcínami. Přítomnost genů kandidátních antigenů navržených k zařazení do nových geneticky vyrobených meningokokových vakcín nebyla v České republice dosud zmapována.

V mezinárodní studii byl studován pouze fHBP na souboru vybraných N. meningitidis B izolovaných od pacientů v letech 2000–2006 [12], přítomnost ostatních GNA však u českých meningokoků nebyla dosud popsána ani u N. meningitidis B izolovaných z IMO, ani u jiných séroskupin z IMO, ani u nosičských izolátů.

V prezentovaném projektu byly české izoláty N. meningitidis studovány sekvenací s cílem sledování genů čtyř antigenů zařazených do nové MenB vakcíny a stanovení, zda tato nová vakcína je vhodná k použití v České republice.

METODIKY A MATERIÁL

Metodiky

Nová MenB vakcína registrovaná v lednu 2013 pro použití v Evropě obsahuje čtyři proteinové antigeny (tři GNA a jeden PorA):

• fHbp (factor H binding protein) = LP2086 = GNA1870
• NHBA (Neisseria Heparin Binding Antigen) = GNA2132 (NEIS2109)
• NadA (Neisserial adhesin A) = GNA1994 (NEIS1969)
• protein zevní membrány buněčné (OMP) PorA P1.4

Stuktury GNA1030 a GNA2091, původně navržené reverzní vakcinologií rovněž mezi kandidátní složky pokusných vakcín, nebyly během závěrečné formulace do nově registrované MenB vakcíny zařazeny. Naopak, byl přidán protein zevní membrány buněčné (OMP) z úspěšné novozélandské vakcíny PorA P1.4, s cílem zvýšení imunogenicity.

Metody studia GNA byly zavedeny podle údajů dostupných v literatuře a podle postupů prezentovaných na webových stránkách (http://pubmlst.org/neisseria/). Vybrané izoláty byly charakterizovány sekvenčními metodami. Geny GNA byly amplifikovány s použitím publikovaných primerů [9]. PCR produkty byly po purifikaci sekvenovány na automatickém sekvenátoru ABI PRISM 3130xL. Sekvenační data byla určena pomocí LASERGENE software. Hodnocení sekvenačních dat bylo prováděno multifaktoriální analýzou v prostředí Statistica, BURST, SplitTree. Sekvenace PorA byla prováděna již zavedenou metodou uvedenou na webových stránkách (http://neisseria.org/nm/typing/ a http://pubmlst.org/neisseria/).

Izoláty Neisseria meningitidis

Celkem bylo studováno 304 izolátů N. meningitidis z období 2007–2013: 262 izolátů z IMO (203 N. meningitidis B, 59 N. meningitidis non-B) a 42 izolátů od zdravých nosičů, zasílaných do Národní referenční laboratoře pro meningokokové nákazy z mikrobiologických laboratoří celé České republiky k ověření a k další charakterizaci.

VÝSLEDKY

Studium genů GNA na souboru izolátů N. meningitidis z období 2007–2013

1. fHbp (factor H binding protein) = LP2086 = GNA1870

Přítomnost genu peptidového antigenu fHbp byla zjištěna u všech sledovaných izolátů získaných z IMO i u izolátů od zdravých nosičů. Byly zjištěny rozdíly v zastoupení variant fHbp mezi izoláty z IMO a izoláty od zdravých nosičů. U izolátů z IMO (B i non-B) převažovala varianta fHbp1, zatímco u izolátů od zdravých nosičů převažovala varianta fHbp2 – graf 1.

2. NHBA (Neisseria Heparin Binding Antigen) = GNA2132 (NEIS2109)

Přítomnost genu nhba peptidového antigenu NHBA byla zjištěna u všech sledovaných izolátů z IMO i u izolátů od zdravých nosičů. Ve zkoumaném souboru invazivních izolátů B a non-B bylo zjištěno celkem 21 sekvenačních variant NHBA peptidu do současnosti popsaných a varianty dosud nezařazené – strukturní údaje jsou zaslány kurátorům mezinárodní nomenklatury imunogenních složek vakcín pro zařazení do příslušného schématu. Zjištěné varianty NHBA peptidu vykazovaly souvislost s klonálním komplexem izolátu. U izolátů séroskupiny B z IMO bylo zastoupení jednotlivých va­riant NHBA ­peptidu odlišné oproti izolátům z IMO non-B. Rovněž u izolátů od zdravých nosičů bylo zastoupení jednotlivých variant NHBA peptidu odlišné oproti izolátům z IMO. U invazivních izolátů B byly nejčetnější peptidové varianty NHBA-21 a NHBA-3; u invazivních izolátů non-B varianty NHBA-20 a NHBA-7; u izolátů od zdravých nosičů varianty NHBA-20 a NHBA-2 – graf 2.

3. NadA (Neisserial adhesin A) = GNA1994 (NEIS1969)

Přítomnost genu nadA peptidového antigenu NadA byla zjištěna u pouze 26,6 % sledovaných izolátů získaných z IMO B a u 40,7 % IMO non-B – graf 3. Peptidová varianta NadA-1, respektive i plošná přítomnost genu nadA jako takového, byla specificky nalézána u kmenů komplexu cc32, přítomnost varianty NadA-2/3 převažovala u kmenů komplexu cc11 a varianty NadA-4/5 u kmenů komplexu cc213. U genu varianty NadA-2/3 ojediněle se vyskytujících kmenů komplexu cc1157 byl zjištěn posun čtecího rámce znemožňující syntézu peptidu. U izolátů od zdravých nosičů byla přítomnost genu nadA zjištěna pouze u 4,8 %.

4. protein PorA P1.4

PorA charakteristika vykazovala vysokou variabilitu, vyšší však byla u séroskupiny B:

• N. meningitidis B z IMO (203 izolátů) – 53 různých variant VR1 a VR2 regionů, z nichž varianty zjištěné nejčastěji (10krát a více) byly následující: P1.7,16; P1.19,15; P1.22,14; P1.5-1,10-4; P1.18-1,3; P1.22-1,14.
• N. meningitidis non-B z IMO (59 izolátů) – 20 různých variant VR1 a VR2 regionů, z nichž varianty zjištěné nejčastěji (10krát) byly P1.5,2 a P1.5-2,10-1.
• N. meningitidis od zdravých nosičů (42 izolátů) – 22 různých variant VR1 a VR2 regionů, z nichž varianty zjištěné nejčastěji (7krát) byly P1.19,15 a P1.18-1,3.

Protein PorA P1.4 obsažený v nové MenB vakcíně byl zjištěn pouze u dvou izolátů N. meningitidis B z IMO z celkem 262 izolátů B i non-B, u nosičských izolátů nebyl zjištěn vůbec.

Očekávané pokrytí českých izolátů N. meningitidis novou MenB vakcínou

Imunogenními složkami nově registrované čtyřsložkové MenB vakcíny jsou:

1. fHbp peptid subvarianty 1.1 (součást varianty fHbp1).
2. NHBA peptid varianty 2 – podle publikovaných studií peptid navozuje imunitní odpověď plošně vůči kmenům exprimujícím i heterologní varianty NHBA.
3. NadA peptid varianty 3 – podle publikovaných studií peptid navozuje imunitní odpověď plošně vůči kmenům exprimujícím peptidové varianty NadA-1 a NadA-2/3, nikoli vůči kmenům exprimujícím peptidové varianty NadA-4/5.
4. Protein vnější bakteriální membrány PorA P1.4 – podle publikovaných studií protein navozuje imunitní reakci vůči kmenům exprimujícím pouze P1.4 variantu PorA.

Při zjištěné 100% přítomnosti genu nhba u zkoumaných invazivních (B i non-B) a nosičských kmenů by meningokoková populace cirkulující v České republice v současném období měla být hypoteticky zcela pokryta vakcínou obsahu­jící NHBA antigen (v případě přiměřené exprese genu a prezentace antigenu na buněčném povrchu). K pokrytí NHBA složkou se přidává pokrytí dalšími imunogenními složkami MenB vakcíny (fHbp, NadA, PorA), jež není již plošné. Významné je pokrytí fHbp složkou. Pokrytí NadA složkou je vzhledem k časté nepřítomnosti nadA genu nižší. Pokrytí PorA P1.4 složkou je v případě meningokokových klonů přítomných v České republice zanedbatelné. Příspěvek jednotlivých složek k hypotetickému pokrytí, odvozenému od zjištěných strukturních variant příslušných genů, ukazují grafy 4–6. Izoláty z IMO (B i non-B) jsou v první řadě pokryté kombinací antigenů NHBA + fHbp1, na druhém místě je samotný antigen NHBA a na třetím místě kombinace antigenů NHBA + fHbp1 + NadA-1+2/3. Izoláty od zdravých nosičů vykazují odlišné pokrytí: na prvním místě je samotný antigen NHBA a na druhém místě kombinace antigenů NHBA + fHbp1.

DISKUSE

Sekvenačně zjišťovaná přítomnost genů zařazených do čtyřkomponentní MenB vakcíny ukázala vysoké pokrytí touto vakcínou v řadě zemí, např. UK [13, 14, 15]. Snížená přítomnost genu nadA peptidového antigenu NadA v české meningokokové populaci odpovídá zjištěním z jiných zeměpisných oblastí.

Pokrytí MenB vakcínou sekvenačně zjišťované přítomnosti genů antigenů obsažených ve vakcíně je pouze hypotetické – zjištěné geny nemusí být funkční. Proto byla vyvinuta k testování pokrytí izolátů N. meningitidis novou čtyřkomponentní MenB vakcínou metoda MATS (Meningococcal Antigen Typing System) pracující na bázi testu ELISA [16], která je uznána jako ukazatel antimeningokokové ochrany zjišťované baktericidním testem. Metodou MATS bylo testováno pokrytí epidemiologicky aktuálních izolátů N. meningitidis B z IMO ve vybraných evropských zemích [17]. MATS predikuje pro Evropu pokrytí 78% (95% CI 63-90), s rozmezím 73–67 % v jednotlivých zemích. České izoláty N. meningitidis B (108 izolátů z invazivního onemocnění z období 2007–2010) byly do tohoto projektu zařazeny a bylo zjištěno pokrytí 74%. Nejvíce českých invazivních izolátů N. meningitidis B pokrývá samotný antigen fHbp (30 %) a kombinace dvou antigenů fHbp + NHBA (33 %). PorA antigen je v českých izolátech N. meningitidis B zjišťován minimálně (v uvedené studii zjištěn pouze v kombinaci s fHbp + NHBA jen u 1 % izolátů). Metodou MATS bylo zjištěno pokrytí vůči antigenům čtyřsložkové MenB vakcíny nižší než hypotetické 100%. Toto je dáno nikoli nepřítomností genu (kupříkladu gen pro NHBA byl zjištěn u každého studovaného českého izolátu N. meningitidis), ale patrně kvantitativně odlišnou mírou exprese daných genů, či jejich dostupnosti na buněčném povrchu pro testovací protilátku. Navíc, v recentní publikaci [18] je též konstatováno, že MATS patrně podhodnocuje pokrytí MenB vakcínou, protože do skutečné účinnosti v hostitelském organismu se zapojují nejenom protilátkové, ale též buněčné složky imunity, což MATS netestuje.

Výsledky řešení projektu ukazují, že nová MenB vakcína, vyvinutá metodou reverzní vakcinologie, registrovaná v lednu 2013 pro použití v Evropě, je vhodná k použití v České republice k prevenci IMO způsobeného séroskupinou B, vzhledem k prokázané přítomnosti genů této vakcíny v izolátech z IMO způsobeného séroskupinou B. Přítomnost genů nově registrované MenB vakcíny prokázaná sekvenací u populace N. meningitidis non-B, působících IMO v České republice ukazuje možnost snížení nemocnosti způsobené i non-B séroskupinami. Přítomnost genů nově registrované MenB vakcíny prokázaná sekvenací u populace N. meningitidis od zdravých nosičů ukazuje možnost navození imunity i u neočkované populace (jev popisovaný jako kolektivní „herd“ imunita).

Posouzení, že nová MenB vakcína vyrobená metodou reverzní vakcinologie je vhodná k aplikaci v České republice, předložila NRL pro meningokokové nákazy na jednání Národní imunizační komise (NIKO) a jednání výboru České vakcinologické společnosti ČLS JEP (ČVS). V současné době je připravována aktualizace doporučení pro očkování proti IMO, které po schválení bude zveřejněno na webových stránkách NIKO a ČVS.

Je žádoucí, aby MenB vakcína byla aplikována zejména dětem pod jeden rok věku co nejčasněji, vzhledem k nejvyšší nemocnosti IMO působeného séroskupinou B v prvním půlroce života. U kojenců ve věku 2–5 měsíců je nutno aplikovat tři dávky MenB vakcíny s odstupem nejméně 1 měsíc, s přeočkováním jednou dávkou vakcíny mezi 12.–23. měsícem věku. Vzhledem k nabitému očkovacímu kalendáři malých dětí je možné podávat MenB vakcínu současně s hexavakcínou či konjugovanou pneumokokovou vakcínou a ke snížení frekvence febrilních reakcí profylakticky aplikovat paracetamol [19].

Vývoj vakcíny proti meningokokům však není ukončen. Kromě čtyřsložkové MenB vakcíny (BEXSERO), která byla v lednu 2013 registrovaná pro Evropu, je ve vývoji MenB vakcína na bázi dvou variant fHbp [20, 21], či potencionálně univerzálně účinná vakcína na bázi proteinu zevní membrány buněčné ZnuD [22]. Je nezbytné sledovat vývoj těchto nových vakcín a studovat pokrytí české populace meningokoků těmito vakcínami. NRL má tímto možnost na základě přesných dat surveillance průběžně aktualizovat doporučení k očkování proti IMO [23, 24].

ZÁVĚRY

Antigeny zařazené do čtyřkomponentní MenB vakcíny byly sekvenací zjištěny u vysokého procenta českých izolátů N. meningitidis z invazivního meningokokového onemocnění i od zdravých nosičů. Tato čtyřkomponentní MenB vakcína registrovaná v Evropě v lednu 2013 je vhodná pro použití v České republice.

Poděkování: Sekvenční charakterizace izolátů N. meningitidis byla podpořena projektem IGA MZ reg. č. NT/11424-4/2010. Poděkování všem, kdo se podíleli na realizaci surveillance invazivního meningokokového onemocnění v České republice.

Do redakce došlo 9. 2. 2014.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Pavla Křížová, CSc.

Státní zdravotní ústav

Šrobárova 48

110 00 Praha 10

e-mail: pavla.krizova@szu.cz