Genetický a molekulový podklad vývoja autoimunitného diabetes mellitus

Súhrn

Diabetes mellitus 1. typu je choroba podmienená auto-imunitnou alebo idiopatickou deštrukciou pankreatických ostrovčekov, ktorá vyústi do absolútneho chýbania inzulínu. Vývoj choroby je podmienený genetickými a environmentálnymi faktormi. Všeobecne akceptovaným názorom je, že chorobu u geneticky predisponovaných jedincov spúšťajú environmentálne faktory, ako sú vírusová infekcia, diétne faktory v skorom detstve alebo klimatické vplyvy. Existuje niekoľko kandidátskych génov, z ktorých najvýznamnejšie sú gény hlavného histokompatibilného systému. Najčastejšími autoantigénmi sú inzulín, dekarboxyláza kyseliny glutámovej 65 a zinkový transportér ZnT8. Deštrukcia b-buniek pankreasu je sprostredkovaná bunkovými mechanizmami, protilátky sú pravdepodobne len odrazom prebiehajúcich autoimunitných procesov a do poškodenia tkaniva sa priamo nezapájajú. Objavujú sa však už pred nástupom klinických príznakov, čo umožňuje ich praktické využitie v prevencii choroby.

Kľúčové slová:
autoantigény – autoprotilátky – HLA-alely – inzulín – lymfocyty T a B – NKT-bunky

ÚVOD

Diabetes mellitus je skupina metabolických porúch charakterizovaná predovšetkým chronickou hyperglykémiou, ktorá vzniká v dôsledku poruchy sekrécie inzulínu, poruchy účinku tohto hormónu alebo ich kombináciou. Chýbanie inzulínu a jeho nedostatočný účinok v tkanivách zapríčiní poruchu metabolizmu sacharidov, čo sa následne spája so vznikom poruchy metabolizmu tukov a bielkovín. Diabetes mellitus je najčastejšou príčinou slepoty, amputácií a zlyhania obličiek a je jedným z hlavných faktorov, prispievajúcich k zvýšenému výskytu kardiovaskulárnych chorôb a predčasných úmrtí [1].

Najnovšia klasifikácia diabetes mellitus podľa ADA (American Diabetes Association) a EASD (European Association for the Study of Diabetes) sa zakladá najmä na etiológii choroby (tab. 1) [2]. Diabetes mellitus 1. typu (T1 DM) vzniká primárne následkom deštrukcie β-buniek pankreasu a nedostatočnej sekrécie inzulínu. Podľa príčiny ich deštrukcie sa ďalej delí na dva podtypy, autoimunitný a idiopatický. Autoimunitný DM vzniká na podklade autoimunitnej deštrukcie β-buniek pankreasu, ktorá vyústi do ich ireverzibilnej deštrukcie (v našej populácii predstavuje až 95 % diabetikov 1. typu). Autoimunitná deštrukcia pankreatických β-buniek je ireverzibilná a bez komplexnej imunosupresívnej liečby ničí aj tkanivo transplantovaného pankreasu. Idiopatický DM sa vyznačuje tým, že pri ňom príčinu deštrukcie buniek pankreasu nepoznáme (5 % pacientov, typický je skôr pre africkú a ázijskú populáciu) [3, 4].

T1 DM sa zvyčajne manifestuje akútnymi príznakmi hyperglykémie a absolútnou závislosťou na exogénnom inzulíne. U detí je deštrukcia β-buniek väčšinou takmer kompletná, zatiaľ čo u dospelých môže ešte niekoľko rokov pretrvávať zvyšková produkcia inzulínu – táto forma sa označuje ako latentný autoimunitný DM (latent autoimmune diabetes of adults, LADA) [5, 6, 7].

GENETICKÁ PREDISPOZÍCIA K T1 DM

Autoimunitný DM je choroba so silnou genetickou predispozíciou; opísalo sa viacero génov a génových oblastí, ktoré sa spájajú s vývojom choroby. Najvýznamnejšie postavenie majú gény prvej a druhej triedy hlavného histokompatibilného systému (HLA), aj keď v ostatnej dobe pribúdajú aj viaceré non-HLA gény. V databáze GWAS (genome-wide association studies) ich je v súčasnosti opísaných viac ako 70 [8, 9, 10, 11]; zatiaľ najaktuálnejší prehľad je v práci Zóka et al. 2013 [12] a viac informácií je možné nájsť na webovej stránke www.t1dbase.org. Viaceré z týchto génov sa exprimujú priamo v bunkách pankreatických ostrovčekov a táto expresia, spolu s  vplyvmi prostredia, vyústi do deštrukcie a zániku β-buniek.

HLA-gény predstavujú až 40 % genetického rizika rozvoja T1 DM, pričom najsilnejšiu genetickú predispozíciu k autoimunitným chorobám predstavujú HLA gény druhej triedy (obr. 1). Jedinci s najvyšším rizikom vlastnia haplotyp DQA1*05:01 - DQBl*02:01 (DQ2), ktorý sa takmer vždy dedí spolu s DRBl*03:01 (DR3) alebo haplotyp DQA1*03:01 - DQBl *03:02 (DQ8) v spojení s DRBl*04:01 alebo DRBl*04:02 (DR4) [11, 13, 14]. Takýchto pacientov označujeme ako DR3/DR4, DO2/DQ8 heterozygotov a tento genotyp sa u diabetikov prvého typu vyskytuje najčastejšie: vlastní ho asi 40 % diabetických detí v porovaní s 2 % výskytom v zdravej populácii [9, 11, 15]. Na druhej strane niektoré HLA-alely sa spájajú s rezistenciou voči vývoju choroby; najsilnejšiu ochranu (dokonca aj u tých, ktorí vlastnia niektorých z predispozičných HLA-haplotypov) poskytuje haplotyp DQA1*01:02 - DQB1*06:02 - DRB1*15:01 (DQ6, DR15). Ak sa DQB1*06:02 raritne vyskytne u diabetika, choroba sa objavuje vo vyššom veku, a to aj u pacientov s dokázanou pozitivitou „diabetických“ autoprotilátok [9, 16].

V súčasnosti existuje aj niekoľko informácií o asociácii s T1 DM s poslednou skupinou HLA aliel druhej triedy – HLA-DP. HLA-DPB1*01:01, -DPB1*03:01 a -DPB1*02:02 sú pozitívne a HLA-DPB1*04:02 negatívne asociované s rozvojom choroby [17, 18, 19]. Sumárne môžeme konštatovať, že HLA-haplotypy sú asociované s vysokým, stredným, resp. nízkym rizikom, alebo dokonca s ochranou voči rozvoju T1 DM. Ich identifikáciu možno preto využiť aj v predikcii rozvoja choroby (tab. 2).

Kľúčová úloha HLA-génov v patogenéze autoimunitných chorôb sa zakladá na ich dôležitej funkcii v indukcii recesívnej (centrálnej) tolerancie, prezentácii antigénu a aktivácii pomocných T-lymfocytov. Strata tolerancie závisí od charakteru väzby špecifických peptidov do žliabku HLA-molekúl druhej triedy a ich prezentácii T-lymfocytom, ktoré ich rozpoznávajú svojimi antigénovými receptormi. Protektívne HLA-molekuly interagujú s tými autoreaktívnymi T-lymfocytmi, ktoré majú zvýšenú afinitu pre rozpoznávanie vlastných peptidov, čo zvýši negatívnu selekciu, t. j. ich deléciu. Súčasne sa vo zvýšenej miere vznikajú prirodzené regulačné T-lymfocyty (nTreg), ktoré dokážu tlmiť autoimunitnú odpoveď viacerými mechanizmami. Naopak, interakcia HLA-molekúl s  nízkoafinitnými autoreaktívnymi T-lymfocytmi vedie k poruchám negatívnej selekcie a vývoja nTreg, čo vytvára stav predispozície k indukcii autoimunitných reakcií. Za únik autoreaktívnych T-lymfocytov z týmusu zodpovedá nestatočná väzba peptidov do žliabku HLA-molekúl [20]. Modifikácia autoantigénov, rovnako ako nadbytok jednotlivých antigénov (ako napr. inzulínu v tkanive pankreatických ostrovčekov), takisto napomáhajú úspešnej prezentácii epitopov autoreaktívnym T-lymfocytom [21].

Druhým susceptibilným lokusom významným v etio-patogenéze T1 DM je chromozóm 11p15.5 – inzulínový promotorový región. Táto oblasť je typická variabilným počtom tandemovo sa opakujúcich sekvencií nukleotidov (VNTR polymorfizmus, Variable Number of Tandem Repeats). Rozoznávame tri typy VNTR – VNTR I obsahuje 26–63 opakujúcich sa jednotiek (5’- - - ACAGGGGTGGTGGGG - - - 3’), VNTR II 80 a VNTR III až 140–210 jednotiek. U jedincov homozygótnych pre VNTR I, v porovnaní s VNTR III homozygótnymi osobami, sa T1 DM vyskytuje častejšie; naopak VNTR II homozygótnosť sa spája s rezistenciou k vývoju choroby.

Expresia inzulínu (a iných autoantigénov) v týmuse a následná delécia autoreaktívnych T-lymfocytov počas procesu negatívnej selekcie je pod regulačným vplyvom génu AIRE (autoimunne regulator). Typ VNTR v promótorovej oblasti inzulínového génu pravdepodobne ovplyvňuje nadviazanie transkripčného faktora, ktorý AIRE-gén determinuje. Alely VNTR I môžu predisponovať k vývoju T1 DM pravdepodobne tým, že nedostatočne viažu AIRE, čo zapríčiní nižšiu transkripciu a tým aj expresiu inzulínu v dreňových bunkách týmusu s následnou neúplnou deléciou autoreaktívnych T-lymfocytov. Tieto sa takto dostanú do periférnych lymfoidných orgánov a po prípadnej aktivácii môžu spustiť autoimunitný proces, ktorý v konečnom dôsledku vedie ku klinicky manifestnej chorobe.

Na druhej strane prítomnosť VNTR III sa spája so zvýšenou expresiou proinzulínu v medulárnych epitelových bunkách týmusu, čo naznačuje koreláciu medzi úrovňou antigénu a negatívnou selekciou vysokoafinitných autoreaktívnych T-lymfocytov buniek. Opätovne to podporuje významnú úlohu recesívnej tolerancie v ochrane proti rozvoju autoimunitných reakcií voči inzulínu [10, 16]. V ostatnej dobe sa tetramérovou analýzou dokázalo, že diabetici, oproti jedincom vlastniacim protektívny variant VNTR polymorfizmu, majú vyššie hladiny inzulínovo-špecifických T-lymfocytov [22].

Ďalší predispozičný genetický región sa nachádza na dlhom ramienku 2. chromozómu (2q33) a obsahuje gén kódujúci CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen-4). Tento hrá dôležitú úlohu v regulácii imunitnej odpovede, predovšetkým pri supresívnych aktivitách FOXP3

⁺CD4⁺CD25⁺ regulačných T-lymfocytov. Genetické analýzy a korelácia polymorfizmu génu pre CTLA-4 s hladinami mRNA naznačuje, že za zvýšenú vnímavosť k vývoju T1 DM zodpovedá znížená hladina solubilného CTLA-4 ako aj prirodzených Treg-lymfocytov [23, 24].

PTPN 22 (protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22) na 1. chromozóme (1p13) je štvrtým predispozičným “diabetickým” génom. Kóduje tyrozínovú fosfatázu významnú pri negatívnej kontrole aktivácie a vývoja T-lymfocytov [25,26]. Je významná najmä pri cytokínovej signalizácii (IL-2 a IL-15). PTPN22-variant asociovaný s výskytom T1 DM vedie k zníženiu fosforylácie STAT5 v T-lymfocytoch, čo narúša cytokínovú signalizáciu a môže ovplyvňovať prežívanie nTreg buniek, ktoré sú závislé od aktivity IL-2 [27].

IL-2 má v homeostáze T-lymfocytov paradoxnú funkciu – účinkuje totiž ako silný aktivátor ich rastu a zároveň ukončuje T-lymfocytovú odpoveď a navodzuje autotoleranciu. Druhá spomenutá funkcia bude pravdepodobne súvisieť s nutnosťou IL-2 signalizácie pri vývoji a fungovaní prirodzených regulačných T-lymfocytov, a preto nie je prekvapujúce, že genetická oblasť kódujúca a-reťazec receptora pre IL-2 (IL-2RA, CD25) na 10. chromozóme (10p14) je asociovaná s vývojom T1 DM [28]. U jedincov s predispozíciou k vývoju choroby pozorujeme 30–50 % pokles expresie CD25 pre-mRNA a aj samotného proteínu na aktivovaných pamäťových T-lymfocytoch a v menšej miere aj na nTreg-lymfocytoch. Navyše znížená expresia CD25 na pamäťových T-lymfocytoch u jedincov so susceptibilnými IL-2RA genotypmi sa spája aj s nižšou syntézou IL-2, čo môže pôsobiť synergicky s nižšou expresiou CD25 na nTreg-lymfocytoch a tak ďalej znižovať ich funkčnosť [29, 30].

Keďže signalizácia prostredníctvom IL-2 má kľúčovú úlohu pri vývoji nTreg-lymfocytov [31], asociácia s vývojom T1 DM je sprostredkovaná redukciou expresie IL-2 a IL2RA, ktorá narúša vývoj aj funkčnosť nTreg. Výsledky nedávnych štúdií potvrdili, že poruchy v IL-2 signalizácii majú vplyv aj na expresiu FOXP3-génu [27]. Porucha CD25 u diabetikov sa dá preto považovať za patogenetický mechanizmus, ktorý sa podieľa na rozvoji T1 DM u pacientov s IPEX-syndrómom. Ide o imunodefi-cientnú chorobu, ktorú spôsobuje mutácia vo FOXP3--géne (Xp11.23-q13.3.); výsledkom je porucha diferenciácie nTreg-lymfocytov. Klinicky sa manifestuje viacerými autoimunitnými chorobami vrátane T1 DM.

Ďalšia asociácia sa týka génu pre transkripčný faktor STAT4; ide o polymorfizmus jednotlivých nukleotidov (SNP), konkrétne rs7574865 G/T. Pozoroval sa zvýšený výskyt alely T [32,33]. STAT4 je dôležitý pre IL-12 signalizáciu a indukciu T_H1-odpovede, ktorá u diabetikov sprostredkováva autoimunitný atak. Nedávno sa opísala ďalšia „podozrivá“ genetická oblasť – región TLR7 – TLR8 na chromozóme Xp22.2 [9] (www.t1dbase.org). Tieto gény kódujú intracelulárne receptory vírusovej RNA a DNA, resp. RNA apoptotických buniek [34,35]. Toto zistenie naznačuje, že rôzne vírusové infekcie by mohli, prostredníctvom zvýšenej hladiny interferónov prvého typu zvyšovať náchylnosť k autoimunitnej deštrukcii b-buniek a rozvoju T1 DM u jedincov vlastniacich susceptibilné gény. Sezónne rozdiely vo výskyte vírusových infekcií, rovnako ako ďalšie sezónne vplyvy (ako je znížená hladina vitamínu D v severských krajinách v priebehu zimných mesiacov) by rovnako mohli čiastočne vysvetliť dobre známu sezónnu variabilitu vo výskyte T1 DM [36].

Význam vírusov, resp. vírusovej infekcie, podčiarkuje aj asociácia s polymorfizmom génu IF1H1 (interferon induced with helicase C domain 1). U pacientov s va-riantom IF1H1 rs2111485 GG progreduje choroba do klinicky manifestného DM omnoho rýchlejšie (31 % do 5 rokov) v porovnaní s tými, ktorí vlastnia variant GA alebo AA [37]. IF1H1 gén kóduje vzorkové receptory MDA5 (melanoma differentiation associated gene 5), ktoré ovplyvňujú odpoveď na vírusovú infekciu. Receptory MDA5 rozpoznávajú určité druhy RNA, ktoré sa tvoria počas replikácie niektorých RNA vírusov. Molekula MDA5 sa aktivuje okrem iného aj enterovírusmi, ktoré sú známym environmentálnym spúšťačom autoimunitných procesov vedúcich k T1 DM [38, 39].

Na asociáciu T1 DM s infekciami spôsobovanými enterovírusmi upozornili výsledky pozorovaní, ktoré ukázali, že enterovírusová infekcia predchádzala rozvoju protiostrovčekých autoimunitných reakcií u viac ako 51 % pacientov v porovnaní s 28-% výskytom u zdravých [40, 41]. Začalo sa preto uvažovať sa o tom, že vírusy by mohli stáť na samom začiatku indukcie autoimunitnej odpovede voči pankreatickým β-bunkám. Túto predstavu podporuje aj existencia sekvenčnej zhody medzi molekulou glutamátdekarboxylázy a proteínom 2 Coxasckie vírusov (aminokyselinová pozícia 249–279). Táto sekvencia je u Coxsackie B4 vírusov vysoko konzervovaná a príslušný peptid sa viaže na molekulu HLA-DQ8, nie však na DQ7 [42]. Polymorfizmus DQb reťazca v pozícii 57 je spojený s rizikom, alebo, na druhej strane, s ochranou proti rozvoju choroby. Molekuly, ktoré v tejto pozícii obsahujú kyselinu asparágovú (HLA-DQ7), sú protektívne, zatiaľ čo molekuly, ktoré v tejto pozícii majú serín alebo alanín (HLA-DQ8) predstavujú pre vývoj T1 DM riziko [43, 44]. Tieto vírusy teda stoja za aktiváciou a proliferáciou T-lymfocytov špecifických pre daný vírusový epitop, ktorý je zhodný s proteínmi tvoriacimi pankreatické β-bunky (fenomén molekulového mimikri), čo vyústi do “útoku” cytotoxických T-lymfocytov proti β-bunkovým autoantigénom. Avšak neskôr sa ukázalo, že enterovírusy majú síce svoje miesto v patogenéze T1 DM, ale nie v dobe rozvoja autoimunitných procesov [45, 46]. Infekcia bude zodpovedať skôr za progresiu choroby, avšak iniciácia autoimunitných procesov a ich ďalšia progresia budú pravdepodobne sprostredkované rozdielnymi mechanizmami – zlyhaním mechanizmov autotolerancie.

Ako sa uvádza vyššie, alely kódujúce HLA-DQ6 patria medzi protektívne. K nim možno pridať aj ďalšie gény, konkrétne gén kódujúci IL-7R alpha [47] a gén pre delta 32 variant CCR5 [48].

K poznaniu patogenézy choroby môžu napomôcť gény, ktoré nie sú asociované s T1 DM. Pri Crohnovej chorobe a psoriáze, ale aj iných autoimunitných chorobách sa opísali predispozičné gény významné pri dozrievaní a aktivácii T_H17-lymfocytov. Avšak štúdiom T1 DM databázy (www.t1dbase.org) a známych jednoduchých nukleotidových polymorfizmov (SNP) sa ukazuje, že tieto „T_H17-gény“ nebudú asociované s touto chorobou. Rovnako ďalšie genetické oblasti, ako 4p15.5, 6q22.32, 7p15.2, 7p12.1, 10q23.31, 14q24.1, 16q23.1, 19q13.32, 20p11, 22q12.2 a Xq28, pravdepodobne neobsahujú gény významné v patogenéze T1 DM [9, 12].

AUTOIMUNITNÉ MECHANIZMY

Autoimunitný diabetes mellitus je výsledkom progresívnej straty funkčných pankreatických ostrovčekov. Autoimunitná reakcia je namierená proti viacerým zložkám pankreatických b-buniek. Pri tomto chronic-kom deštruktívnom procese má význam tak celulárna, ako aj humorálna zložka imunitnej odpovede. Po naštartovaní autoimunitných reakcií (ich odrazom je pozitivita autoprotilátok a progresívne znižovanie sekrécie inzulínu) môže do objavenia sa prvých kli-nických príznakov hyperglykémie prejsť ešte pomerne dlhý čas [49, 50].

Dôležitými charakteristickými črtami T1 DM sú infiltrácia pankreatických ostrovčekov makrofágmi a lymfocytmi a prítomnosť autoprotilátok proti viacerým β-bunkovým antigénom v plazme chorých [51, 52].

Zápalová infiltrácia pankreatického tkaniva, známa tiež ako inzulitída, je typickou črtou choroby. Ako prvé infiltrujú tkanivo pankreatických ostrovčekov mono-nukleárne bunky, predovšetkým makrofágy a dendritové bunky. Následne sa k nim pridávajú B- a T-lymfocyty (tak cytotoxické, ako aj pomocné) a spoločne indukujú periinzulitídu. Keď makrofágy a aktivované T-lymfocyty napadnú bunky pankreatických ostrovčekov produkujúce inzulín, nastupuje inzulitída. Tieto procesy prebiehajú v tzv. pred-diabetickej fáze a vedú postupne k úplnej deštrukcii β-buniek pankreasu a absolútnemu nedostatku endogénneho inzulínu [42, 53].

T-lymfocyty sa považujú za bunkovú populáciu s kľúčovým významom v patogenéze choroby [54, 55]. Infiltrácia pankreatických ostrovčekov T-lymfocytmi sa pôvodne opísala pri zvieracích modeloch (myši NOD a  potkany BB) a až neskôr sa dokázalo, že predstavujú aj podstatnú časť bunkového infiltrátu u ľudí [56]. Odstránenie zrelých T-lymfocytov pri vyššie uvedených zvieracích modeloch zabránilo vzniku choroby [57, 58].

Patologický proces z veľkej časti závisí od prítomnosti autoreaktívnych CD8⁺ a CD4⁺ T-lymfocytových subpopulácií. Všeobecne sa CD8⁺ T-lymfocytom prikladá význam v priebehu počiatočných fáz patogenézy, zatiaľ čo CD4⁺ T-lymfocyty sú skôr potrebné aj na indukciu aj na udržiavanie autoimunitných procesov [49, 58, 59].

Infiltrácia ostrovčekov autoreaktívnymi T-lymfocytmi je pre rozvoj diabetes mellitus 1. typu nevyhnutná. Štúdie pri NOD-myšiach dokumentovali, že po vstupe T-lymfocytov do pankreatického tkaniva dochádza k de novo formovaniu lymfoidných folikulov, čo je typickou črtou progresívneho chronického zápalu. Experimentálne výsledky ďalej naznačujú, že interakcia medzi membránovým lymfotoxínom (LTa1b2) T-lymfocytov a ich receptorom (LTbR) v membráne stromálnych buniek je nevyhnutná pre vývoj a udržanie tohto lymfoidného mikroprostredia. Pri knock-out myšiach, ktoré neprodukujú lymfotoxín a pri normálnych myšiach, ktorým sa podával fúzny proteín obsahujúci receptor pre LTb (LTb receptor-immunoglobulin fusion protein = LTbR-Ig) bolo možné zvrátiť vývoj inzulitídy a predísť tvorbe lymfoidných folikulov, a to aj vtedy, keď už bola inzulitída rozvinutá [60, 61]. Gén LTA je u ľudí polymorfný. Z tohto dôvodu je zaujímavé pozorovanie, že LTA*1 alela je vo väzbovej nerovnováhe s haplotypom HLA-A1, -B8, -DR3 predisponujúcim k vývoju T1 DM [62].

Autoimunitné procesy začínajú aktiváciou autoreaktívnych T-lymfocytov, ktoré unikli negatívnej selekcii v týmuse a osídľujú periférne lymfoidné orgány. Neznámy inzult spôsobí uvoľnenie autoantigénov pankreatických β-buniek do prostredia. Bunky prezentujúce antigén (antigen presenting cells – APC, napr. dendritové bunky a makrofágy) ich pohltia a začnú migrovať do pankreatických lymfatických uzlín. Počas svojho presunu spracúvajú autoantigén a produkty tohto spracovania – peptidy sa viažu do žliabkov HLA-molekúl. Keď sa dostanú do lymfatických uzlín, aktivujú naivné autoreaktívne CD4⁺ a CD8⁺ T-lymfocyty.

CD8⁺ T-lymfocyty sa aktivovajú po rozpoznaní komplexu peptid + HLA molekula I. triedy v membráne APC a v prítomnosti IL-2 a ďalších cytokínov produkovaných autoreaktívnymi pomocnými CD4⁺-lymfocytmi. Následne proliferujú, diferencujú na zrelé cytotoxické CD8⁺ T-lymfocyty a migrujú do pankreatických ostrovčekov, ktoré deštruujú [21].

Výsledky štúdií o liečbe ťažkej inzulitídy použitím fúznych molekúl „LTbR-IgG1“ naznačujú, že migrácia buniek spôsobujúcich zápal do tkaniva pankreatických ostrovčekov je dynamický proces, v ktorom sa bunky neustále presúvajú dovnútra a von z cieľového tkaniva, čoho výsledkom je neustála kontinuálna aktivácia autoreaktívnych T-lymfocytov predtým nerozpoznanými autoantigénmi (šírenie epitopov) a ďalšie poškodenie tkaniva [60].

U mnohých jedincov s jasnými znakmi predklinického T1 DM však ku klinickým prejavom vôbec nedôjde. To naznačuje, že existuje možnosť, že títo jedinci môžu vyvinúť dostatočnú regulačnú imunitnú odpoveď na zvrátenie imunopatologického stavu. Avšak v tejto oblasti sú protichodné údaje. U diabetikov sa pozorovali aj normálne aj znížené počty nTreg-lymfocytov [63, 64, 65], rovnako aj ich regulačná činnosť sa hodnotila raz ako znížená a nedostatočná a raz ako normálna [66, 67, 68]. Je možné, že táto nesúrodosť výsledkov vyplýva aj z rôznych metodických a technologických postupov použitých v rôznych laboratóriách.

Makrofágy majú rovnako deštrukčný efekt ako cytotoxické T-lymfocyty, a to vďaka produkcii reaktívnych foriem kyslíka a dusíka. Aktivované makrofágy produkujú aj proinflamačné cytokíny, najmä TNF a IL-1 [69], ktoré pôsobia na pankreatické β-bunky priamo cytotoxicky. Naviac aj β-bunky samotné môžu byť zdrojom IL-1 (najmä ako reakcia na glukózu), čo môže ďalej akcelerovať deštruktívny proces potenciovaný hyperglykémiou. Hyperglykémia samotná zvyšuje expresiu prozápalových mediátorov a tie ďalej aktivujú imunitný systém a ničia β-bunky [70].

Interferóny prvého typu (IFN), ktoré sa tvoria v počiatočných fázach infekcie, parakrinným pôsobením znižujú vnímavosť susedných aj vzdialených buniek na infekciu vírusmi. Podobne skorá produkcia IFN-g môže navodiť protivírusovú obranu. Avšak interferónová odpoveď nielen znižuje vnímavosť β-buniek k vírusovej infekcii, ale zvyšuje aj expresiu HLA molekúl prvej triedy a chráni tak bunky pred útokom NK--buniek. Toto všetko naznačuje, že nedostatočná, resp. narušená antivírusová obrana β-buniek môže zvýšiť ich poškodenie, a viesť tak k uvoľneniu sekvestrovaných antigénov, ktoré sú následne terčom autoimunitných procesov [71].

iNKT-bunky sú populáciou T-lymfocytov, ktorá má niektoré spoločné vlastnosti s NK- bunkami. Ku kľúčovým charakteristikám patrí prítomnosť variabilného génu pre antigénový receptor T-lymfocytov, CD1d reštrikcia a masívna produkcia cytokínov (najmä IL-4 a IFN-γ) [72]. Vďaka tejto schopnosti sa iNKT-bunky zúčastňujú regulácie imunitnej odpovede, môžu ovplyvniť polarizáciu pomocných T-lymfocytov a tým výrazne prispieť k rozvoju autoimunitných procesov. Analýzy iNKT-buniek u diabetikov podľa niektorých autorov vykazujú znížené počty aj funkčnosť, v ďalších štúdiách sa však tieto sledovania úplne nepotvrdili [73, 74]. Aj napriek tomu však štúdie na zvieracích myších modeloch prinášajú sľubné výsledky a naznačujú, že úprava hladiny iNKT buniek môže viesť k prevencii, resp. aj liečbe DM1 [75].

Hoci v patogenéze T1 DM mimoriadne významnú úlohu zohrávajú T-lymfocyty, svoje miesto tu majú aj B-lymfocyty. Ak sa NOD-myšiam, ktoré spontánne vyvíjajú diabetes, zabráni, aby produkovali B-lymfocyty, napriek fyziologickým počtom T-lymfocytov, sa choroba nevyvinie [76]. Význam B-lymfocytov podčiarkuje aj skutočnosť, že aj u človeka [77] aj pri myšiach [78] podávanie monoklonových anti-CD20 protilátok zvráti progresiu choroby. Vzhľadom k tomu, že B-lymfocytmi sa nedá preniesť ani inzulitída, ani diabetes, plnia pravdepodobne nedeštruktívne funkcie; po vhodnej stimulácii a aktivácii plnia predovšetkým funkciu buniek prezentujúcich antigén [77, 79].

Autoprotilátky sa nachádzajú v plazme u 60–80 % pacientov (tab. 3), ale u časti z nich v dobe stanovenia diagnózy ich stále nesme schopní dokázať [80, 81]. Výskyt autoprotilátok je odrazom autoimunitného ataku voči pankreatickým b-bunkám, pričom ich množstvo odráža progresiu autoimunitnej deštrukcie. Prítomnosť len jednej protilátky voči niektorej zo štyroch hlavných antigénových skupín predstavuje len hranične zvýšené riziko, ktoré sa však výrazne zvyšuje, ak sa u detí zachytí pozitivita dvoch (alebo viacerých) autoprotilátok. Riziko vzniku choroby u prvostupňových príbuzných rastie z < 25 % na 25–50 % a > 50 % pri pozitivite jednej, dvoch alebo troch autoprotilátok. V rámci jednotlivých autoprotilátok sa s najvyšším rizikom vzniku choroby spája IA-2 (ICA512 alebo IA-2b alebo phogrin) [16, 49, 82] (tab. 4, tab. 5). Zároveň platí, že čím skôr sa protilátky objavia, tým rýchlejšie choroba progreduje [83]. Longitudinálne štúdie preukázali, že u detí s vysokým genetickým rizikom rozvoja choroby sa dajú autoprotilátky detegovať už pred 6. mesiacom života. U mnohých detí dôjde k sérokonverzii do troch rokov ich veku a takmer u všetkých približne do 7 rokov. Priemerný vek v čase stanovenia diagnózy je pritom 12 rokov [7].

Skutočnosť, že nie u všetkých pacientov s autoprotilátkovou pozitivitou sa choroba aj vyvinie, naznačuje, že protilátky v patogenéze kľúčovú úlohu hrať nebudú. Dôkazom toho, že autoprotilátky priamo neprispievajú k poškodeniu β-buniek je aj skutočnosť, že transplacentárne prenesené autoprotilátky matiek-diabetičiek chorobu u ich detí nevyvolajú [1, 84].

Súčasti pankreatických β-buniek, ktoré môžu byť roz-poznávané ako potenciálne autoantigény, sú najmä inzulín alebo proinzulín, GAD65, IA-2 a ZnT8. Inzulín sa pritom identifikoval ako prvý autoantigén a pre b-bunky pankreasu je stále jediným špecifickým. Uvoľňuje sa po enzýmovom odštiepení tzv. C-peptidu (connecting peptide) z molekuly proinzulínu v sekrečnych granulách pankreasu. Autoprotilátky rozpoznávajú priamo molekulu inzulínu, dajú sa však len veľmi ťažko dokázať. Protilátky proti inzulínu (IAA, antibodies against insulin) sú jedným z najskorších klinických znakov choroby. Vyskytujú sa v sére u 60 % novodia-gnostikovaných pacientov ešte pred začatím liečby inzulínom. Ich hladina inverzne koreluje s vekom pacienta v dobe stanovenia diagnózy (s takmer 100 % záchytom u detí vo veku menej ako 5 rokov v porovnaní s 20 % pozitivitou vo vekovej skupine viac ako 15 rokov). Hladiny IAA rovnako odrážajú aj intenzitu autoimunitnej deštrukcie a v sére od pacientov sa nachádzajú už pred objavením sa prvých klinických príznakov. Z uvedeného vyplýva, že IAA majú svoje nesporné postavenie tak v diagnostike, ako aj v prevencii choroby [49, 84].

Dekarboxyláza kyseliny glutámovej s Mr 65 000 (GAD65) je enzým, ktorý konvertuje glutamát na g-aminomaslovú kyselinu. Exprimuje sa na pankreatických β-bunkách (ale aj na α- a δ-bunkách ostrovčekov) a predstavuje hlavný autoantigén. Protilátky proti GAD65 (GADA, glutamic acid decarboxylase antibodies) bývajú pozitívne v sére od pacientov s novodiagnostikovaným diabetom takmer v 80 % (viz tab. 3). Pri súčasnej pozitivite iných špecifických „diabetických“ autoprotilátok predstavuje takáto kombinácia vysoké riziko; pri izolovanej pozitivite GADA sa častejšie stretávame s pomalou progresiou choroby. Je zároveň najčastejšie zachytenou autoprotilátkou u pacientov s tzv. LADA [81, 84].

U 60–75 % novodiagnostikovaných pacientov zachytávame pozitivitu protilátok proti ostrovčekovému antigénu 512 (ICA 512 alebo IA-2), zatiaľ čo u zdravých jedincov sa jej záchyt pohybuje len okolo 2 %. ICA512 je molekula, ktorá sa podobá tyrozínovej fosfatáze, ale nemá enzýmovú aktivitu; exprimuje sa v pankrease a v mozgu. Molekula sa syntetizuje v dvoch variantoch, IA-2α a IA-2β (phogrin). Približne 10 % pacientov reaguje len voči jednému variantu, ostatní väčšinou tvoria autoprotilátky voči obom [16].

Najnovší autoantigén významný v patogenéze T1 DM je zinkový transporter 8 (ZnT8, zinc transporter 8). Jeho molekula sa nachádza v membráne sekrečnych granúl pankreasu a prenáša zinok, ktorý tvorí komplexy s inzulínom. Autoprotilátky ZnT8A (zinc transporter 8 antobodies) sa pozorovali u 60–80 % novodiagnostikovaných pacientov v porovnaní s 2 % v zdravej populácii. U jedincov sledovaných od narodenia po objavenie sa choroby sa objavili priemerne vo veku dvoch rokov (teda neskôr ako GADA alebo IAA). Stanovenie kombinácie autoprotilátok, t. j. ZnT8A, GADA, IA-2A a IAA, zvyšuje záchyt autoimunitných procesov až na 98 %. Pri tak vysokom záchyte sa dá o tomto vyšetrení uvažovať aj ako o preventívnom vyhľadávaní potenciálnych pacientov vo všeobecnej detskej populácii [83, 84, 85].

V detstve je autoimunitný diabetes charakteristický skorým výskytom autoprotilátok. Pozorovania ukazujú, že druhý vrchol výskytu sa objavuje v období puberty. Profil autoprotilátok proti antigénom pankreatických ostrovčekov u detí s „neskorým“ výskytom autoprotilátok je heterogénny a odlišný od mladších (1–2-ročných). Častá je pozitivita autoprotilátok proti jednej antigénovej skupine (najčastejšie proti GAD65 a inzulínu), bez reakcie voči ďalším ostrovčekovým proteínom. Objavenie sa autoprotilátok v útlom veku sa silne spája s predispozičnými HLA-alelami triedy II, na druhej strane pri neskoršom rozvoji autoimunity sa genotyp HLA-DRB1*04-DQB1*03:02 objavuje menej často.

Aj u starších jedincov bez pozitívnej rodinnej anamnézy výskytu T1 DM je badateľný trend k slabšej HLA--dominancii a heterogénnejšiemu autoprotilátkovému profilu [49] (viz tab. 4). Jedným z vysvetlení rozdielov súvisiacich s vekom pacientov a autoprotilátkovým spektrom je odlišnosť imunizácie a faktorov, ktoré vedú k rozvoju autoimunitných procesov (anti-inzulínových) vo veku jedného roku a tých, ktoré spôsobujú anti-GAD65 reakcie vo veku 11 a viac rokov. Existuje možnosť, že prah pre spustenie imunitných reakcií voči ostrovčekovým antigénom v detstve je naprogramované už počas fetálneho života.

ZÁVER

V súčasnosti je jasné, že diabetes mellitis typu 1 je spôsobený komplexným autoimunitným procesom, ktorý spúšťajú zatiaľ nie presne definované environmentálne faktory u jedinca s predispozičným gene-tickým pozadím. Viaceré génové varianty sú roztrúsené v celom genóme a všeobecne pôsobia cez relatívne malé zmeny v expresii a/alebo funkcii. Tým naštartujú celý rad zmien v imunitnej odpovedi, do ktorej sú zahrnuté prakticky všetky typy buniek imunitného systému a ktorá nakoniec vrcholí v takmer úplnej deštrukcii β-buniek pankreasu [86]. Pochopenie tejto komplexnej poruchy je nevyhnutné v snahe o adekvátnu liečbu, resp. vyliečenie. Zavádzanie sofistikovaných technologických postupov laboratórnej medicíne a zdokonalenie štatistických metód iste v budúcnosti prinesie nové poznatky a dopomôže nám splniť tento cieľ.

Do redakce došlo dne 11. 2. 2015.

Adresa pre korešpondenciu:

MUDr. Ján Mikler, PhD.

Klinika detí a dorastu JLF UK a UNM

Kollárova 2

036 59 Martin

Slovenská republika

e-mail: mikler@unm.sk