Chromatografická charakterizace aminokyselinových profilů vzorků moči pacientů s karcinomem prostaty

Souhrn

Cíle studie:
Cílem studie bylo vytvořit protokol pro zpracování vzorků moči pro získání aminokyselinových profilů pomocí iontově výměnné chromotografie s detekcí ve viditelném spektru (IEC/Vis) na základě tvorby komplexů aminokyselin s ninhydrinem a následné zkrácení času analýzy pro klinicky zajímavé molekuly (sarkosin či taurin), které mohou byt využity jako potenciální nádorové biomarkery.

Typ studie:
Metodická

Materiál a metody:
Vzorky moči, odebrané pacientům s diagnostikovaným karcinomem prostaty (n = 500) byly shromažďovány po dobu 1 roku a uskladňovány při teplotě -80°C. Pro vlastní analýzu aminokyselinových profilů byly vzorky připraveny kyselou hydrolýzou v mikrovlnném reaktoru. Za optimalizovaných podmínek (80 W, 120°C, 25 bar, 105 min) bylo 500 µl vzorku, smíchaného s 500 µl 35% kyseliny chlorovodíkové zhydrolyzováno na výsledný produkt, který byl následně ředěn pufrem sodíkového cyklu (0,2 mol/l NaCl, 60 mmol/l C₆H₈0₇, 1,5 mmol/l N₃Na a 0,4 % S(CH₂CH₂OH)₂). Po centrifugaci (25 000 g při 4°C, 20 min) byly vzorky neutralizovány (0,6 mol/l NaOH) a analyzovány iontově-výměnnou kapalinovou chromatografií s postkolonovou derivatizací ninhydrinem využívající optickou detekci při vlnových délkách λ = 440 a 570 nm. Pro detekci sarkosinu a taurinu byly vzorky připraveny odpařením 250 µl vzorku na dusíkové odparce (40 min, teplota dusíku 60°C, tlak 1 bar) a následně resuspendovány pufrem sodíkového cyklu (250 µl).

Výsledky a závěr:
Analýzou aminokyselinových profilů (n = 500) bylo zjištěno, že lze docílit získání důležitých informací z neinvazivně odebraných vzorků moči. Použití dusíkové odparky redukuje manipulaci se vzorkem a zlepšuje opakovatelnost analýzy. Zkrácená analýza sarkosinu a taurinu ze vzorků odpařených na dusíkové odparce může sloužit jako metoda pro citlivou a nízkonákladovou analýzu klinických vzorků.

Klíčová slova:
Iontově-výměnná chromatografie, Karcinom prostaty, Neinvazivní biomarkery, Sarkosin, Taurin.

Úvod

Aminokyseliny jsou jedním ze základních metabolitů a jejich biochemické dráhy jsou úzce spojeny s fyziologickými či patologickými pochody, což z nich dělá slibné indikátory změn zdravotního stavu [1]. Jakožto důležité biomolekuly tvoří základ každé tkáně a alterace v jejich hladinách mohou indikovat rozmanité patologické stavy včetně zhoubných onemocnění či oxidativního stresu [12]. Vzhledem k potenciálu sarkosinu či taurinu jako slibných biomarkerů jsou neustále vyvíjeny nízkonákladové a citlivé metody, které by mohly být do budoucna využity pro screeningová vyšetření. Význam má především stanovení sarkosinu a taurinu v moči pro včasné odhalení možného rozvoje maligních novotvarů prostaty.

Díky svým amfolytickým vlastnostem jsou aminokyseliny často separovány pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie na základě rozdílného náboje mezi aminokyselinou a stacionární fází. Jako iontoměnič je využit katex [2, 3], kde je hlavním faktorem určujícím retenci analytu jeho izoelektrický bod [4]. Separace aminokyselin je možná i na reverzně fázových kolonách, které však pro účinnou separaci nutně vyžadují předkolonovou derivatizaci separovaných analytů [5]. Separace aminokyselin je možná i na hydrofobně interakčních kolonách [6]. Možná je i separace pomocí kapilární elektroforézy, avšak ve srovnání s chromatografickými technikami bývá identifikace analytů obtížnější [7].

Pro detekci aminokyselin je u iontově výměnné separace využito postkolonové derivatizace ninhydrinem za definovaných podmínek při reakční teplotě 120°C. Ninhydrin reaguje s primární aminoskupinou a dává vzniknout purpurově zbarvenému komplexu (Ruhemannova červeň) (Obr. 1) [8]. Nejvyšší výnos derivatizační reakce byl popsán v detekčním rozmezí λ = 400 - 800 nm [2]. Další možností je fluorescenční detekce, nicméně i ta vyžaduje po separaci zařazení derivatizačního kroku [9]. Hmotnostní detekce nabízí vysokou citlivost, která je vykoupena vysokou pořizovací a provozní cenou přístroje. Problémem může být i komplexnost eluentů po separaci reálných vzorků.

Cílem této práce bylo sestavit jednoduchý protokol úpravy reálných vzorků moči pro získání aminokyselinového profilu pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie s Vis detekcí. Dalším cílem byla optimalizace separačních podmínek sarkosinu a taurinu pro získání rychlé a finančně nenáročné metody pro identifikaci těchto aminokyselin.

Materiál a metody

Chemikálie

Standardy a chemikálie na přípravu pufrů byly pořízeny v 99% čistotě od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), pokud není uvedeno jinak. Methylcelosolve, ninhydrin a chlorid cínatý byly pořízeny od firmy Ingos (Praha, Česká republika).

Vzorky moči

Pro účely ověření funkčnosti optimalizovaných metod byly použity vzorky moči (n = 500). Soubor se skládal ze vzorků získaných od pacientů s karcinomem prostaty (n = 320) a vzorky kontrolní skupiny subjektů bez diagnostikovaných malignit s definovaným zdravotním stavem (n = 180). Vzorky byly získány z Fakultní nemocnice v Motole v Praze a Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně a zpracovány se souhlasem etické komise (referenční číslo EK-377/13). Vzorky moči pacientů byly shromažďovány po dobu 1 roku a uskladňovány při teplotě -80°C.

Stanovení prostatického specifického antigenu (PSA)

PSA a fPSA v moči bylo analyzováno imunoenzymometrickou metodou (IEMA). Pro analýzu byl použit automatizovaný analyzátor AIA 600 II (Tosoh, Bioscience, Tokyo, Japonsko). Pro analýzu byl použit komerční kit ST AIA-PACK PSAII dle pokynů výrobce.

Příprava vzorků pro analýzu aminokyselinových profilů

Pro účely kyselé hydrolýzy v mikrovlnném reaktoru MW 3000 (Anton Paar, Graz, Rakousko) bylo odebráno 500 µl vzorku a smícháno s 500 µl 35% kyseliny chlorovodíkové. Za použití optimalizovaných mineralizačních podmínek (power: 80 W, Ramp: 15 min, Hold: 90 min, tlak: 25 bar, Rotor XF-1006) byl získán vzorek, který byl následně 10 x ředěn ředícím pufrem sodíkového cyklu (0,2 mol/l NaCl, 60 mmol/l C₆H₈0₇, 1,5 mmol/l N₃Na a 0,4 % S(CH₂CH₂OH)₂). Po ředění byly vzorky centrifugovány při 25 000 g a 4°C po dobu 20 minut v mikrocentrifuze 5417R (Eppendorf, Hamburg, Německo), následovalo ředění 1:2 v neutralizačním roztoku (0,6 mol/l NaOH). Takto připravený vzorek byl následně analyzován pomocí IEC/Vis.

Příprava vzorků pro analýzu sarkosinu a taurinu

Vzorky moči (500 µl) byly převedeny do mikrotitrační destičky Deepwell plate 96 (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) a odpařeny pomocí dusíkové odparky (Ultravap 96, Porvair Sciences limited, Leatherhead, Spojené Království). Odpařené vzorky byly resuspendovány pufrem sodíkového cyklu (500 µl) a analyzovány pomocí IEC/Vis.

Iontově-výměnná kapalinová chromatografie s Vis detekcí

Separace a identifikace aminokyselin byla provedena pomocí vysokoúčinné iontově-výměnné kapalinové chromatografie s Vis detekcí (IEC/Vis) na přístroji AAA-400 (Ingos, Praha, Česká republika.). Stanovení aminokyselin pomocí derivatizačního činidla ninhydrinu je jednou z nejpoužívanějších metod. Mezi přednosti této metody patří přesnost, citlivost a velké spektrum detekovaných látek v různých matricích jako jsou krev či moč. Analýzator aminokyselin není určen pro běžnou analýzu aminokyselin taurinu a sarkosinu. Vzorky moči pacientů byly shromažďované po dobu 1 roku a uskladňované při teplotě -80°C. Skleněná chromatografická kolona s vnitřním průměrem 3,7 mm a délkou 350 mm byla naplněna silným katexovým ionexem v sodíkovém cyklu s průměrnou velikostí částic 12 µm a sítěním 8 % a temperována. Objem nástřikové smyčky byl 100 µl při přesnosti nástřiku s relativní směrodatnou odchylkou (RSD) 1 %. Ninhydrin byl rozpuštěn v 75 % (v/v) metylcelosolvu a v 25 % (v/v) 4 mol/l acetátovém pufru (pH 5,5). Derivatizační činidlo bylo po celou dobu uchováno pod inertní atmosférou N2 a chlazeno. Stanovení aminokyselin probíhalo dle následujících podmínek:

• Složení mobilní fáze: pufr (A) 60 mmol/l C₆H₈0₇, 20 mmol/l Na₃C₆H₅O₇, 0,2 mol/l NaCl, 1,5 mmol/l N₃Na, 0,4 % S(CH₂CH₂OH)₂, pufr (B) 50 mmol/l C₆H₈0₇, 30 mmol/l Na₃C₆H₅O₇, 0,15 mol/l NaCl, 1,5 mmol/l N₃Na, 0,4 % S(CH₂CH₂OH)₂, pufr (C) 40 mmol/l C₆H₈0₇, 40 mmol/l Na₃C₆H₅O₇, 0,3 mol/l NaCl, 1,5 mmol/l N₃Na, 0,4 % S(CH₂CH₂OH)₂, pufr (D) 90 mmol/l Na₃C₆H₅O₇, 0,9 mol/l NaCl, 30 mmol/l H₃BO₃, 1,5 mmol/l N₃Na, pufr (E) 0,2 mol/l NaOH,
• Skokový gradient mobilní fáze (průběh v čase viz Tabulka 1),
• Průtok mobilní fáze 0,25 ml/min,
• UV detekce při 570 nm (440 nm pro detekci prolinu).

Popisná statistika

Statistické zpracování dat a jejich grafická interpretace byly provedeny v programech Microsoft Excel^®, Microsoft Word^® and Microsoft PowerPoint^®. Mez detekce (3 S/N) a mez kvantifikace (10 S/N) byly vypočítány dle [10], kde N je vyjádřeno jako standardní směrodatná odchylka šumu stanoveného v oblasti signálu.

Výsledky a diskuse

Aminokyselinové profily

Stacionární fáze - katex v kombinaci se skokovým gradientem pufrů o různých pH a iontové síle nabízí vhodnou cestu pro separaci aminokyselin na základě jejich rozdílných izoelektrických bodů [11]. Z předchozích optimalizačních kroků byly získány základní analytické parametry pro 17 analyzovaných aminokyselin (Tabulka 2). Údaje v tabulce byly zaokrouhleny na jednu platnou číslici. Kalibrační křivky byly sestrojeny s použitím 10 kalibračních roztoků. Parametry LOD a LOQ byly vypočítány jako průměr pěti nezávislých analýz jako trojnásobek (LOD, 3S/N) a desetinásobek (LOQ, 10S/N) směrodatné odchylky 50 hodnot šumu (v každé analýze) v blízkosti píku analytu. Hodnoty opakovatelnosti byly stanoveny z 10 hodnot a hodnoty mezilehlé preciznosti z 25 hodnot. Kalibrační body byly proloženy přímkou, tak aby součet čtverců odchylek byl minimální. Získané parametry přímky (úsek na ose y a směrnice) byly otestovány, zda jsou statisticky významné od nuly. Bylo zjištěno, že směrnice je statisticky významná od nuly, zatímco úsek na ose y není statisticky významný. Byl sestrojen graf reziduí (závislosti velikosti reziduí na předpovídané hodnotě), který potvrdil, že zvolený regresní model je správný (body reziduí jsou rozmístěny v grafu náhodně) a nebyly odhaleny odlehlé body.

V našem případě byla pro desintegraci peptidových vazeb a získání komplexních profilů moči zapojena kyselá hydrolýza v mikrovlnném reaktoru, která ale zásadně prodlužuje dobu celkové analýzy (doba mikrovlnné přípravy vzorku - 105 minut). Po hydrolýze je vzorek rozložen na základní aminokyseliny, z kterých je konstituován. Po kyselé hydrolýze je zásadní další ředění vzorku pomocí pufrů, stabilizující pH vzorku.

Výše zmíněným postupem byly připraveny vzorky moči, odebrané pacientům s indikovanou radikální prostatektomií. Dva vybrané chromatogramy z těchto analýz jsou znázorněny na Obr. 2. Detailnější informace (hladiny PSA a fPSA, včetně přidružených diagnóz) o pacientech jsou přiřazeny ke každému chromatogramu a pro porovnání je ukázán i vybraný chromatogram vzorku moči zdravého muže, získaný stejným postupem přípravy a analýzy.

Chromatogramy jasně ukazují na zvýšení hladiny všech aminokyselin v moči pacientů s karcinomem prostaty. Tento jev je zřejmě spojen se zvýšeným obsahem proteinů v moči, který může být důsledkem zánětlivých stavů či jiných patologií, asociovaných s nádorovými onemocněními [13]. Jako zajímavá cílová molekula se jeví především sarkosin, který jakožto neproteinogenní aminokyselina není úzce spřízněn se zvýšeným obsahem proteinů a jeho zvýšená koncentrace v matrici je dána především přítomností patologických stavů [1].

Zkrácené analýzy sarkosinu a taurinu

Sarkosin (N-methylglycin) není obsažen v proteinech, a proto není zapotřebí kyselé hydrolýzy pro jeho kvantifikaci. Díky tomu byl postup přípravy vzorků zjednodušen na pouhé odpaření 250 µl vzorku a následné resuspendování stejným objemem ředícího pufru sodíkového cyklu. Výhodou postupu je časová nenáročnost, eliminace možných chyb v přípravě často velmi cenných vzorků a šetření finančních prostředků. Při analýze sarkosinu je zásadní jeho rozlišení od hmotnostně identického alaninu (89,0932 Da) [14]. Nejčastěji používané metody - GC/MS [15] a LC/MS [16] nabízí vysokou citlivost, avšak za cenu složité předúpravy vzorku a nutnosti zapojení dobře školeného a zkušeného personálu pro obsluhu. Při zavedení dobře fungující metody jsou tyto komplikace u IEC-Vis eliminovány a finanční náklady se redukují pouze na pořizování chemikálií, potřebných k analýzám.

Stejná příprava vzorku moči byla zvolena i pro analýzu taurinu (kyselina 2-aminoethansulfonová), který ač postrádá karboxylovou skupinu, je často řazen mezi aminokyseliny [17]. Tato sulfonová kyselina je součástí většiny živočišných tkání a hraje významnou roli v mnoha fyziologicky důležitých procesech, jako je antioxidační ochrana organismu [18], inhibice neurotransmise [19] nebo stabilizace buněčných membrán [20]. Zvýšené hladiny taurinu v moči byly již dříve identifikovány u zánětlivých onemocnění střev [21], rozvoji nemoci z ozáření [22] či chronických onemocnění ledvin [23]. Použité metody, nejčastěji nukleární magnetická resonance (NMR) či kombinace kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí (trojitý kvadrupól nebo orbitrap) sice nabízejí vysokou citlivost, nicméně vykoupenou vysokou pořizovací a provozní cenou a značnými nároky na přípravu vzorku.

Z toho důvodu byly optimalizovány zkrácené IEC/Vis metody pro samostatné analýzy taurinu a sarkosinu. Jejich analytické parametry jsou znázorněny v Tabulce 3. Údaje v tabulce byly zaokrouhleny na jednu platnou číslici. Analytické parametry byly získány stejným postupem jako v Tabulce 2. Kalibrační křivky byly sestrojeny s použitím 10 kalibračních roztoků v pracovních rozsazích 7,8 – 1000 µmol/l pro sarkosin a 0,8 - 800 µmol/l pro taurin.

V porovnání s délkou analýzy aminokyselinových profilů (120 minut) byla délka analýzy samotného sarkosinu zkrácena na 45 minut, kdy eluce analytu probíhala v tR = 18,76 min. U taurinu byla analýza zkrácena na 25 minut s elucí v tR = 12,10 min. Záznamy z analýz standardů (10 µg/ml) těchto biologicky významných látek jsou znázorněny na Obr. 3A (taurin) a 3B (sarkosin).

Po optimalizaci byla metoda aplikována na vzorky pacientů s adenokarcinomem prostaty a po přípravě vzorku odpařením na dusíkové odparce byly získány chromatogramy sarkosinu a taurinu znázorněné na Obr. 3C, kdy byly po přepočtu na kreatinin získány hodnoty 33 µmol/mmol kreatininu pro sarkosin a 26,5 µmol/mmol kreatininu pro taurin.

Závěr

Prostatický specifický antigen (PSA) představuje v současnosti nejdůležitější nádorový marker nádorových onemocnění prostaty, avšak patři mezi markery, kde dochází k narušení integrity tkáně. Proto jsou hledány markery, pomocí kterých by bylo možné identifikovat karcinom prostaty pouhou analýzou moči. Jednou z látek, jejichž potenciál by se mohl v diagnostice karcinomu využit je neproteinogenní aminokyselina sarkosin. Podle několika studií je sarkosin hodnocen jako výrazně lepší marker rozvíjejících se nádorů prostaty než PSA, a proto bylo cílem této práce zavedení jednoduchého testu na hladinu sarkosinu v moči pacientů s diagnostikovaným zhoubným nádorem prostaty a zdravé kontrolní skupiny. Iontově-výměnná kapalinová chromatografie s postkolonovou derivatizací ninhydrinem je spolehlivá separační technika, která je navíc relativně jednoduchá na obsluhu a díky tomu by mohly naše optimalizované separační postupy být zavedeny do rutinní praxe. Naše výsledky ukazují možnost získání komplexních informací z moči s využitím této metody. A to ať už použitím kyselé hydrolýzy vzorku a následné IEC/Vis analýzy, anebo jednoduchým odpařením až 96 vzorků současně a následnou rychlou chromatografickou analýzou taurinu a sarkosinu. Vzhledem k neustále se zvyšujícímu zájmu o sarkosin může metoda jeho neinvazivního stanovení v moči posloužit jako screeningová, nízkonákladová metoda, využitelná pro pre-bioptické testování pacientů s podezřením na přítomnost karcinomu prostaty. Stejně tak stanovení taurinu v tělesných tekutinách může poskytovat důležité informace o hladinách oxidativního stresu v organismu.

Práce byla finančně podpořena ze zdroje BR62400000. Autoři děkují Martině Staňkové za technickou asistenci.

Do redakce došlo 22. 7. 2014

Adresa pro korespondenci:

Prof. Ing. René Kizek, Ph.D.

Ústav chemie a biochemie

Mendelova univerzita v Brně

Zemědělská 1

CZ-613 00 Brno

e-mail: kizek@sci.muni.cz