Využití sérového kalprotektinu jako rutinního biomarkeru bakteriální infekce.

Súhrn

Cíl studie: posouzení využitelnosti sérového kalprotektinu jako biomarkeru bakteriální infekce v rutinní praxi.

Typ studie: prospektivní, observační studie.

Název a sídlo pracoviště: Ústřední vojenská nemocnice – Vojenská fakultní nemocnice Praha

Materiál a metody: do studie byli zařazeni všichni pacienti přijatí na Kliniku infekčních nemocí v období leden až březen 2020. Sérový kalprotektin byl stanoven pomocí systému EVOLIS™ Microplate a komerčně dostupné enzymoimunoeseje firmy Biovendor.

Výsledky: celkem byla vyhodnocena data 36 nemocných (24 mužů a 12 žen s průměrným věkem 63,9 let), u kterých byla potvrzena diagnóza virové nebo bakteriální infekce. Nejčastějším zdrojem bakteriální infekce byly dýchací cesty (33,3 %), následované měkkými tkáněmi (25 %) a infekcemi urogenitálního a gastrointestinálního traktu (shodně 16,7 %). Virovou infekci nejčastěji představovala chřipka A (66,6 %). Medián sérové koncentrace kalprotektinu u bakteriální infekce byl 4,12 mg/L oproti 2,03 mg/L při infekci virové. U 12 nemocných s bakteriální infekcí a zvýšeným C-reaktivním proteinem (CRP), u kterých nebyl zvýšen prokalcitonin (PCT), byla zjištěna zvýšená hodnota sérového kalprotektinu. Naopak u osmi nemocných s potvrzenou bakteriální infekcí nebyl kalprotektin zvýšen, čtyři z těchto pacientů měli současně s CRP zvýšený i PCT a čtyři nemocní měli zvýšené pouze CRP. V souboru byl rovněž případ bakteriální infekce se zvýšeným kalprotektinem a negativním CRP i PCT.

Závěr: výsledky naší studie naznačily význam sérového kalprotektinu jako doplňkového parametru pro diagnostiku bakteriální infekce.

Klíčová slova:

biomarker – bakteriální infekce – sérový kalprotektin

Úvod

Kalprotektin je kalcium-vázající protein, který patří do skupiny tzv. danger associated molecular patterns (DAMPs), známých jako alarminy. Kalprotektin se běžně vyskytuje ve většině lidských buněk, včetně neutrofilů, monocytů, epiteliálních buněk a keratinocytů [1]. Kalprotektin v krvi je zvýšen při celé řadě akutních stavů zahrnujících sepsi, trauma a rozsáhlý chirurgický výkon, stejně jako u chronických onemocnění včetně revmatoidní artritidy, dny, aterosklerózy, cystické fibrózy, Crohnovy choroby, zánětlivých onemocnění svalů, psoriázy či některých maligních nádorů [2-6].  Ačkoliv se dle řady dostupných studií kalprotektin zdá jako nadějný biomarker systémové bakteriální infekce a sepse, jeho rutinní využití není zatím běžné [7].

Systémová bakteriální infekce začíná aktivací vrozené imunitní odpovědi, která je stimulovaná detekcí DAMPs nebo pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) receptory PRRs (pattern-recognition receptors) na hostitelských buňkách. Po aktivaci vrozené imunitní odpovědi dochází nejdříve k vzestupu zánětlivých mediátorů, jako jsou tumor nekrotizující faktor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-10 a monocytární chemoatraktantový protein 1 (MCP-1). Tyto mediátory jsou dále následovány vzestupem hladin prokalcitoninu (PCT), kalprotektinu, proadrenomedulinu, pentraxinu-3 či C-reaktivního proteinu (CRP) v krvi. Mnoho z těchto molekul již slouží nebo bylo navrženo jako rutinní biomarkery sepse [8,9].

Mezi v praxi nejčastěji používané biomarkery sepse a bakteriální infekce v současné době patří počet leukocytů, CRP a méně často PCT a poměr neutrofilů/lymfocytů (NLR). Z novějších biomarkerů je v rutinní praxi nejčastěji testován heparin vázající protein (HBP), presepsin nebo sérový kalprotektin [10-12]. K rozlišení bakteriální od virové infekce se nejčastěji využívá CRP, který je běžně dostupný i v ambulantní praxi, u hospitalizovaných pacientů je často využíván PCT a omezeně IL-6. Tyto biomarkery mají však své limitace, neboť reagují na zánětlivou odpověď organismu, a nelze je tedy vždy využít pro odlišení různých typů zánětlivých reakcí [13].

Cílem této práce je posoudit sérový kalprotektin jako časný biomarker bakteriální infekce u pacientů přijímaných k hospitalizaci s podezřením na akutní infekční onemocnění a jeho využití ve vztahu k CRP a PCT.

Metody

Do prospektivní studie byli zařazeni všichni pacienti bez rozdílu diagnózy, kteří byli přijati s akutním onemocněním na Kliniku infekčních nemocí 1. LF UK a ÚVN (KIN) v období od 10. 1. 2020 do 13. 3. 2020. U všech pacientů byla vstupně provedena rutinní laboratorní vyšetření (krevní obraz s diferenciálním rozpočtem a biochemická vyšetření zahrnující stanovení zánětlivých parametrů) a ze zbytků materiálu byl doměřen v biochemické laboratoři kalprotektin.

Hladina sérového kalprotektinu byla stanovena s využitím systému EVOLIS™ Microplate (Stratec Biomedical Systems AG, Mnichov, Německo). Analýza byla provedena pomocí komerčně dostupné soupravy pro ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) zakoupené od firmy BioVendor – Laboratorní medicína a.s. (Brno, Česká republika).

Výsledky

Na KIN v uvedeném období bylo celkem přijato 43 pacientů. Do studie bylo zařazeno 36 pacientů s bakteriální či virovou infekcí. Sedm pacientů bylo vyřazeno z důvodu diagnózy neinfekčního nebo parazitárního onemocnění. Z 36 zařazených pacientů bylo 20 mužů a 16 žen. Průměrný věk pacientů byl 63,9 let (medián 67 let, rozptyl 19-89 let). Průměrná délka hospitalizace byla pět dnů (medián čtyři dny, rozptyl 1-13 dnů). Po určení etiologického agens se jednalo o 24 pacientů s bakteriální infekcí a 12 pacientů s infekcí virovou.

Nejčastější diagnózou u pacientů s bakteriální infekcí byla respirační infekce (33,3 % pacientů), následovaná infekcí kůže a měkkých tkání (25 % pacientů) a poté infekce gastrointestinálního nebo urogenitálního traktu (shodně u 16,7 % pacientů). Etiologicky se jednalo dvakrát o Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae a Clostridium difficile a po jednom případu Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae a Pseudomonas aeruginosa. U 11 pacientů s pravděpodobnou bakteriální infekcí léčených antibiotiky se etiologické agens nepodařilo určit, nicméně, diagnózu bakteriální infekce potvrzoval příznivý efekt antibiotické terapie. U virových infekcí dominovala chřipka A u osmi pacientů (66,7 %) a z dalších virů se jednalo o virus hepatitidy E, norovirus, virus varicely a zosteru a virus Epsteina a Barrové, a to vždy po jednom případu.

Kalprotektin

Průměrná hladina kalprotektinu u přijatých pacientů byla 8,53 mg/L (medián 3,62), přičemž u pacientů s bakteriální infekcí byla 11,47 mg/L (medián 4,12) a u pacientů s virovou infekcí 2,66 mg/L (medián 2,03). Další sledované hodnoty jsou uvedeny v Tabulce 1.

Rozřazení pacientů na základě kombinace vstupní hodnoty kalprotektinu a CRP

Pro porovnání sledovaných parametrů jsme si pro bakteriální infekci, v souladu s dostupnou literaturou, nastavili cut-off hodnoty pro CRP 60 mg/L, pro PCT 0,5 µg/L a pro kalprotektin 3,4 mg/L.

Celkem 17 pacientů mělo vstupně vyšší hladinu sérového CRP spolu s kalprotektinem, z těchto bylo u 15 pacientů (62,5 % pacientů) verifikována bakteriální infekce. Bylo zajímavé, že z těchto 15 pacientů mělo 12 nemocných negativní PCT. U zbylých dvou pacientů byl sice identifikován virus chřipky A a byli zařazeni do skupiny virových infekcí, ale u těchto pacientů se současně rozvinula bakteriální superinfekce.

U osmi pacientů s nízkou sérovou hladinou kalprotektinu a zvýšenou koncentrací CRP byla potvrzena bakteriální infekce, zatímco u jednoho pacienta se zvýšenou vstupní hladinou kalprotektinu a negativní hodnotou CRP byla diagnostikována taktéž bakteriální infekce (obr. 1.).  Z výše uvedené skupiny osmi  pacientů s bakteriální infekcí, u kterých byla vstupní hodnota kalprotektinu nízká, a naopak CRP zvýšená, měli čtyři pacienti nízký PCT a čtyři nemocní PCT zvýšený (obr. 2.). Osm pacientů s virovou infekcí (66,7 % pacientů) mělo vstupně nízkou hladinu sérového CRP i kalprotektinu a jeden nemocný s virovou infekcí měl nízký kalprotektin ale zvýšené CRP.

Diskuse

Testování využitelnosti stanovení sérových hladin kalprotektinu v rutinní praxi následovalo po ukončení akademického výzkumného projektu, který v naší instituci probíhal do roku 2019. V rámci tohoto výzkumného projektu byl kalprotektin vyšetřován u řady patologických stavů enzymoimunoesejí, která však není vhodná pro stanovování parametrů akutní infekce [6, 12, 14]. Nicméně v závěru provádění výzkumného projektu bylo na trh uvedeno několik esejí vhodných pro statimové vyšetření sérových hladin kalprotektinu, což byl i důvod testování provedeného v roce 2020 v naší nemocnici [15, 16].

Naše výsledky v zásadě potvrdily data z předchozích studií, která poukázala na sérový kalprotektin jako na zajímavý biomarker bakteriální infekce a sepse [12, 17, 18]. V těchto studiích nešlo jen o vstupní hladinu sérového kalprotektinu jako rozřazovacího parametru bakteriální infekce, ale bylo poukázáno i na to, že zvýšené hodnoty kalprotektinu v krvi po zahájení antibiotické terapie rychle klesají, což může být využito pro kvalifikovaný odhad účinnosti empiricky nasazených antibiotik (12). Dostupnost nově certifikovaných esejí pro rutinní stanovování pak předchozí výsledky vědeckých studií učinila i prakticky zajímavými.

Dá se předpokládat, že dostupnost nových esejí pro rutinní stanovení sérového kalprotektinu povede k většímu zájmu kliniků o tento parametr. Z tohoto důvodu je vhodné upozornit na úskalí spojená s vyhodnocováním zvýšených hladin kalprotektinu v séru. Především jde o nižší specificitu sérového kalprotektinu ve vztahu k bakteriální infekci. Zvýšené koncentrace kalprotektinu v krvi jsou totiž nacházeny při celé řadě neinfekčních stavů zahrnující chronická zánětlivá onemocnění, některé nádory, chirurgické zákroky a traumata [3-6, 14]. Falešnou pozitivitu zvýšených sérových hladin kalprotektinu ve vztahu k bakteriální infekci přinášejí i některá infekční onemocnění jako je tuberkulóza, melioidóza nebo v poslední době koronavirové onemocnění covid-19 [19-21]. Podobně jsme v naší studii měli tři případy, kdy byl kalprotektin zvýšen, a přitom šlo o virovou infekci. Na druhou stranu ve dvou z těchto případů šlo o nemocné s chřipkou, jejíž průběh byl komplikován bakteriální superinfekcí, což mohlo být příčinou elevace kalprotektinu. Nicméně důležitějším problémem jsou v naší kohortě případy bakteriální infekce s nízkým kalprotektinem a zvýšenou koncentrací CRP.  U těchto osmi případů mohla hrát roli lokalizace infekce či další faktory. Konkrétně šlo o tři případy střevní infekce (z toho 2x vyvolané C. difficile a 1x s neurčenou mikrobiální etiologií), tři případy infekce močových cest, exacerbaci chronické bronchitidy a sepsi u HIV-pozitivního pacienta. Ve čtyřech případech, podezření na bakteriální infekci, silně podporovala zvýšená hladina PCT, ale u dalších čtyř případů byla rychlá diagnostická rozvaha založena pouze na pozitivitě CRP. Tento fakt zdůrazňuje známou situaci, a to, že není jeden „zlatý“ biomarker bakteriální infekce, ale že je nutné biomarkery racionálně kombinovat a dávat do kontextu s klinickým nálezem.

Limitací studie je malý počet zařazených pacientů a její monocentrický charakter. Na druhou stranu dosažené výsledky jsou zcela v souladu s daty získanými z naší předchozí poměrně velké akademické studie, ve které byla zjištěna vysoká senzitivita sérových hladin kalprotektinu pro bakteriální sepsi, která byla vyšší než v případě PCT [12]. Další limitací studie je využití jiné eseje, než kterou jsme použili v předchozí studii, což znemožňuje přesné srovnání zjištěných sérových koncentrací kalprotektinu u bakteriální a virové infekce. Nicméně, relativní poměry – tj. vyšší koncentrace sérového kalprotektinu u bakteriální infekce než u infekce virové – jsou přesto při srovnání výsledků obou studií jasně patrné. 

Závěr

V klinickém provozu jsme potvrdili výsledky výzkumných studií, které upozornily na sérový kalprotektin jako doplňkový parametr pro diagnostiku bakteriální infekce a sepse. Dostupnost esejí pro rutinní stanovení sérového kalprotektinu nyní umožňuje tento potenciální biomarker testovat v různých klinických situacích a ověřit tak na velkých souborech jeho výhody a nevýhody.

Seznam zkratek

DAMPs    danger associated molecular patterns

PAMPs    pathogen-associated molecular patterns

PRRs       pattern-recognition receptors

TNF-α      tumor nekrotizující faktor-α

IL             interleukin

MCP-1     monocytární chemoatraktantový protein 1

PCT         prokalcitonin

CRP         C-reaktivní protein

NLR         poměr neutrofilů/lymfocytů

HBP         heparin vázající protein

KIN         Klinika infekčních nemocí 1. LF UK a ÚVN

ELISA     enzyme-linked immunosorbent assay

Práce je podpořena projektem institucionální podpory MO1012.

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Do redakce došlo 31. 8. 2021

Adresa pro korespondenci

MUDr. Simona Arientová, Ph.D.

Ústřední vojenská nemocnice – Vojenská fakultní nemocnice Praha

Klinika infekčních nemocí 1. LF UK a ÚVN

U Vojenské nemocnice 1200

169 02 Praha 6

simona.arientova@uvn.cz