Úloha regulačních T buněk v protinádorové imunitní odpovědi

Súhrn

Regulační T lymfocyty (Treg) jsou nezbytné v regulaci imunitní homeostázy a prevenci rozvoje autoimunitních reakcí. Regulační T buňky zabraňují vzniku autoimunitních nemocí, udržují imunitní homeostázu a modulují imunitní odpověď během infekce. Jejich aktivita je precizně kontrolována. Regulační T buňky jsou jednou ze skupin imunitních buněk, jež mohou podporovat růst nádoru. Svou funkci uskutečňují skrze inhibici efektorových T buněk a regulaci nádorového mikroprostředí pomocí produkce řady solubilních faktorů. Řada prací prokázala, že množství Treg buněk je zvýšeno u solidních nádorů i u hematologických malignit. Nicméně stále je málo známo o mechanizmech, které vedou ke zvýšení a udržení zvýšených hladin Treg buněk u nádorových onemocnění. V tomto přehledu se mimo jiné zaměříme na popis funkce a fenotypu Treg buněk, jejich modulaci humorální imunitní odpovědi a interakci s nádorovými kmenovými buňkami. Nové možnosti ovlivnění účinků Treg buněk mimo jiné dovoluje i současný rozvoj moderní imunoterapie nádorů.

Klíčová slova:
regulační T lymfocyty – Foxp3 – fenotyp – humorální imunita – nádorové kmenové buňky

Úvod

Relevantní výzkum, který se zabýval supresorovými T buňkami, započal začátkem 70. let 20. století. V roce 1971 byly identifikovány tzv. supresorové buňky [1], řada problémů však zpomalila další pokrok na tomto poli. Především bylo obtížné nalézt znaky, které by odlišily regulační T buňky (Treg) od ostatních T buněk. Molekulární mechanizmus imunologické suprese regulačními T buňkami tak nebyl velmi dlouho pochopen. Ačkoliv v 80. letech 20. století zůstal koncept T supresorových buněk stále zahalen rouškou tajemství, identifikace CD4⁺ T klonů, které potlačovaly autologní protinádorovou odpověď, naznačovala, že mechanizmus celulární imunosuprese stimulovaný nádorem in vivo musí existovat [2]. V 80. letech 20. století byly také popsány významné funkce různých cytokinů, včetně IL-10 [3]. V roce 1995 byla následně objevena koexprese antigenu CD25, α řetězce receptoru IL-2, na Treg [4]. Byly identifikovány T buňky CD4⁺ fenotypu vysoce exprimující nízkoafinitní receptor IL-2 CD25, které zabraňovaly vzniku autoimunity na zvířecím modelu. Následně byly popsány rozdílné T subpopulace zahrnující přirozené CD4⁺25^hi+ Treg buňky, indukované Treg (Tr1 a Th3 buňky) a CD4⁺25^hi+ vznikající v periferii z CD4⁺25^– buněk [5]. U člověka není CD25 antigen zcela specifický pro Treg buňky a je exprimován v různé intenzitě také na efektorových T buňkách. Při hledání více specifického znaku byl identifikován transkripční faktor Foxp3. Charakteristickou vlastností CD4⁺25^hi+Foxp3⁺ Treg buněk je schopnost aktivně inhibovat CD4⁺ a CD8⁺ T buňky, dendritické buňky, NK buňky, NKT buňky a B buňky při mezibuněčném kontaktu, a to také v závislosti na jejich množství.

Funkce Treg buněk

Forkhead box P3 (Foxp3⁺) Treg buňky regulují mimo jiné (prevence vzniku autoimunitních chorob, regulace odpovědi na infekce virové, bakteriální a parazitické) protinádorovou a transplantační imunitní odpověď [6,7]. Treg buňky ve zdravém organizmu musí navíc umožnit funkci protektivní protinádorové imunity. Tyto buňky tedy modulují aktivity řady buněčných komponent, což závisí na jejich migraci do specifických tkání a mikroprostředí, aby se dostaly do kontaktu se svými cílovými buňkami. Treg buňky mohou být rozděleny do několika podskupin. Ačkoliv se Treg vyskytují v sekundárních lymfatických tkáních, mohou být nalezeny prakticky ve většině nelymfatických orgánů, dokonce bez přítomnosti zánětu [8]. Navíc se Treg buňky nacházejí v nádorové tkáni, kde mohou narušit efektivní protinádorovou odpověď [7].

Pro správnou distribuci a funkci exprimují Treg homing receptory, např. CD103 a chemokinový receptor CCR4. Ztráta exprese CCR7 např. blokuje migraci Treg do lymfatických uzlin. Treg buňky využívají pro své funkce celou řadu homing receptorů, včetně molekul CCR1 až CCR9, CXCR3 až CXCR6, integriny a ligandy P- a E-selektinu.

Existují také značné rozdíly mezi Treg v lymfatických a nelymfatických tkáních s velkou funkční i fenotypovou variabilitou. Vyvíjející se Treg v thymu jsou relativně homogenní populací CD25^hi+62L⁺CCR7⁺ buněk. Jakmile se buňka dostane do periferie, stává se CD44^hi+ a zvyšuje expresi homing receptorů. CD44^hi+ buňky také vykazují rychlejší proliferaci; IL-10 je rovněž produkován CD44^hi+ Treg buňkami. Treg buňky mohou indukovat perforin dependentní cytolýzu dendritických buněk v sentinelové lymfatické uzlině nádoru [9]. Treg buňky využívají také více mechanizmů, které omezují aktivitu dendritických buněk v sekundárních lymfatických tkáních.

Fenotyp Treg buněk

Fenotyp této subpopulace T lymfocytů je nejčastěji definován jako CD4⁺25⁺Foxp3⁺. Treg lymfocyty tvoří přibližně 10 % periferních CD4⁺ T lymfocytů. CD25 se svou afinitou k IL-2 plní důležitou biologickou roli: normálně je trvale exprimován na Treg buňkách, zatímco je variabilně exprimován na aktivovaných T buňkách. Tento fakt činí antigen CD25 problematickým pro identifikaci Treg buněk. Dalším znakem Treg buněk je TNF receptor typu 2 (TNFR2). Znak CD103 je rovněž exprimován na Treg.

Skutečným strukturním znakem Treg buněk je forkhead box P3 (Foxp3) popsaný v roce 2003, který je i molekulou zprostředkující Treg funkce [10,11]. Foxp3 je extenzivně exprimován přirozenými Treg buňkami a je v současnosti jejich nejvíce specifickým markerem [12].

Glukokortikoid-induced TNF receptorrelated gene (GITR, CD357) patřící do TNFR superrodiny je exprimován v Treg buňkách ve zvýšené míře. Regulace GITR řídí pro i antiapoptotické efekty a u Treg buněk ukončuje jejich supresivní aktivitu [13]. GITR hraje důležitou úlohu v diferenciaci přirozených Treg buněk a v expanzi přirozených i indukovaných Treg buněk [14].

Exprese transkripčního faktoru Helios z rodiny Ikaros je důležitým znakem přirozených Treg buněk [15]. Faktor Helios se váže na faktor Foxp3. Potlačení faktoru Helios významně oslabuje supresivní funkci Treg. Bylo nicméně prokázáno, že faktor Helios se vyskytuje také u indukovaných Treg buněk [16].

Metodou detekce Treg buněk je multiparametrická průtoková cytometrie zaměřená na expresi jednotlivých CD antigenů. Alternativní možností je využití metylačně senzitivní PCR, která je zacílena na demetylované oblasti TSDR regionu genu Foxp3 [17].

Subtypy Treg buněk

Často bývají rozlišovány přirozené Treg (nTreg) a indukované Treg (iTreg). Pro diverzitu fenotypu, secernovaných cytokinů a mechanizmů suprese však musíme rozlišit nejméně čtyři (nejspíše však více než čtyři) subsety Treg: přirozené Treg, Tr1, Th3 a Tr1-like buňky. Treg lymfocyty ve folikulárních centrech jsou označovány jako Tfreg buňky [18]. Tr1, Th3 a Tr-like buňky vyžadují opakovanou antigenní stimulaci k tomu, aby mohly být generovány. Tr1 buňky produkují abundantně IL-10, který potlačuje imunitní reakci spolu s Tr1 buňkami [19–21]. Supresivní úloha Th3 buněk je zprostředkována sekrecí TGF-β, IL-4 a IL-10, zatímco Tr1-like buňky regulují nezralé dendritické buňky [22–24].

nTreg lymfocyty

Přirozené Treg lymfocyty se vytvářejí v časných stadiích embryonálního a neonatálního vývoje T lymfocytů. Tyto buňky se vytvářejí v thymu a poté se dostávají do periferních tkání, kde plní svou funkci. nTreg buňky jsou CD4⁺, exprimují vysokou úroveň CD25, CTLA-4, GITR a Foxp3. nTreg jsou normálně se vyskytující subpopulací T lymfocytů [25].

iTreg lymfocyty

Klasický fenotyp této subpopulace T lymfocytů je CD4⁺25⁺Foxp3⁺. Treg lymfocyty hrají podstatnou roli v zachování imunologické self-tolerance [26,27]. Funkce Treg buněk je kontrolována jednak expresí transkripčního faktoru Foxp3 [28–30] regulujícího expresi CTLA-4 a snižujícího produkci IL-2 a udržováním epigenetické specifické DNA hypometylace, která je potřeba pro stabilitu a plnou funkčnost T buněk [31].

Tfreg lymfocyty

Kritickým faktorem v regulaci germinálních center je pomoc T lymfocytů [32,33]. Tfh buňky mají specializovanou funkci poskytující pomoc folikulárním B buňkám [34,35]. Treg buňky fenotypu CD4⁺25⁺69^– mají schopnost downregulace CCR7 a simultánní upregulace CXCR5, což jim dovoluje migrovat do B buněčné zóny [36]. V důsledku toho mohou být tyto Tfreg buňky zobrazeny v germinálních centrech [36,37]. Tfreg buňky suprimují T dependentní produkci protilátek a inhibují produkci protilátek CD40 stimulovanými B buňkami v nepřítomnosti Th buněk [36,37]. Tfreg buňky exprimují vysokou úroveň CXCR5, PD-1 a ICOS, neexprimují IL-4, IL-21 a CD40L, ale exprimují vysoké úrovně CTLA-4 a IL-10 [38]. Tfreg se diferencují z Treg buněk. Bylo také prokázáno, že Tfreg buňky kontrolují expanzi Tfh buněk.

Treg a modulace humorální imunity

Treg buňky disponují řadou mechanizmů, kterými mohou modulovat humorální imunitu. Treg buňky mají široký repertoár supresivních mechanizmů, který závisí na úrovni stimulů, jimž byly Treg buňky vystaveny [39]. některé z těchto mechanizmů jsou popsány v dalších odstavcích.

CTLA-4

Inhibiční molekula CTLA-4 je vysoce exprimována na povrchu Treg buněk a hraje klíčovou úlohu v jejich inhibiční funkci limitací dostupnosti CD80 a CD86. CD80 a CD86 jsou exprimovány na antigen prezentujících buňkách (antigen presenting cells – APC) a poskytují kostimulační signály T buňkám ligací CD28 společně se signalizací skrze T buněčný receptor (TCR) [40]. Mechanizmy deplece molekul CD80 a CD86 byly recentně objasněny: CTLA-4 je schopno transendocytovat CD80/ CD86 z povrchu APC do Treg buněk, kde jsou pak tyto molekuly degradovány [41]. CTLA-4 vázající se na CD80/ CD86 na B buňkách může přímo ovlivňovat produkci protilátek v germinálních centrech.

PD-1

Inhibiční receptor PD-1 je důležitým regulátorem řady imunitních regulačních drah [42]. PD-1 je upregulován na Tfh a Tfreg buňkách. PD-1 rovněž reguluje humorální imunitu. Jeho exprese je kritická pro udržení normální funkce Tfreg buněk. Za přítomnosti PD-1 mají Tfreg buňky zvýšený supresivní potenciál a zvýšenou schopnost inhibice produkce protilátek [43]. Exprese PD-1 ligandů na Treg buňkách může také hrát roli v jejich supresivní funkci. Treg specifická exprese PD-1 ligandu 1 a ligandu 2 přímo inhibuje funkci autoreaktivních B buněk s expresí PD-1 bez nutnosti zprostředkované interakce s Th buňkami [44].

IL-10

Tento pleiotropní cytokin má komplexní úlohu v humorální imunitě a jeho funkcí je inhibovat nebo posilovat protilátkovou odpověď. Treg buňky samy vyžadují IL-10 signalizaci k udržení své funkce a kontroly IL-17 produkujících buněk [45]. Role IL-10 je komplexní, neboť B buňky, dendritické buňky, efektorové T buňky i Treg buňky exprimují IL-10R a také samy mohou produkovat IL-10.

TGF-β

Supresivní cytokin TGF-β hraje roli v potlačení protilátkové odpovědi Treg buňkami. Membránově vázaný TGF-β zprostředkovává kontakt dependentní supresi produkce protilátek B buňkami [46].

IFN-γ a IL-12

IFN-γ a IL-12 podporují diferenciaci a funkci Th1 buněk. IFN-γ aktivně inhibuje generaci Foxp3⁺ Treg z naivních CD4⁺ buněk [47]. IFN-γ a IL-12 mohou jak podporovat, tak i inhibovat funkci Treg buněk v závislosti na síle cytokinové odpovědi a jejím kontextu.

IL-6

IL-6 je široce exprimovaný cytokin s mnohočetnými funkcemi, který ovlivňuje rovněž Treg vývoj a aktivitu. IL-6 zabraňuje vzniku TGF-β indukovaných Treg buněk a místo toho spolu s TGF-β indukuje Th17 diferenciaci [48].

Indukce apoptózy B buněk

Přímým mechanizmem regulace B buněk je indukce jejich apoptózy Treg buňkami. In vitro aktivované Treg buňky preferenčně zabíjejí antigen prezentující B buňky. Navíc může docházet ke granzyme indukované apoptóze a Fas-FasL indukované lýze B buněk pomocí Treg buněk [49].

Treg a nádorové kmenové buňky

Koncept nádorových kmenových buněk (cancer stem cells – CSC) by mohl být jedním z klíčů k léčbě nádorových onemocnění v budoucnu. Teorie, že CSC nebo nádor iniciující buňky (cancer initiating cells – CIC) jsou typem buněk zodpovědných za vznik a růst nádorů, získala v posledních letech značnou pozornost. Pro jejich vysokou rezistenci a potenciál iniciace nádorového růstu jsou CSC považovány za kritický faktor spojený s relapsem nádoru [50].

V hierarchickém modelu jsou nádory, podobně jako fyziologické tkáně, organizovány rozdílnými buňkami s různou schopností sebeobnovy, úrovní direfenciace a rezistencí k léčbě. CSC, skupina buněk na vrcholu pyramidy, tvoří minoritní populaci buněk, které iniciují nádor a udržují jeho růst. Ke své definici podle koncepce kmenových buněk obecně musí CSC splňovat nejméně dvě kritéria: 1. mít schopnost iniciovat růst nádoru a 2. mít schopnost asymetrické sebeobnovy. V roce 1994 byla popsána skupina leukemii iniciujících buněk [51]. O více než 10 let později byla prokázána kapacita CD44⁺24⁺ buněk nádoru prsu iniciovat nový tumor [52]. Bohužel jednoznačné specifické markery CSC nebyly dosud identifikovány. V úloze mechanizmů regulujících CSC buňky byly kromě mikroprostředí (stem-cell niche) prokázány tři dráhy: Wnt, Hedgehog a Notch. Podle stochastického modelu CSC představují volatilní kompartment, do něhož náhodně vstupují non-CSC buňky, a narušují tak představu klasického hierarchického modelu [53].

Regulační T lymfocyty zprostředkovávají svou funkci pomocí inhibice efektorových T buněk a regulací nádorového mikroprostředí sekrecí řady solubilních faktorů. Zde je možno sledovat styčné plochy Treg a CSC. některé práce uvádějí přítomnost Treg jako nezávislý prognostický faktor u některých typů nádorů. Analýza interakce mezi Treg buňkami a CSC je předmětem současného výzkumu.

Kontrola CSC Treg buňkami prostřednictvím angiogeneze

Angiogeneze se podílí na působení Treg buněk na CSC. Je zde především důležitý vliv cévního niche a VEGF na regulaci kmenových vlastností CSC. Erlotinib, her-2 blokátory a bevacizumab inhibují CSC v nádorech se sníženou cévní denzitou. Protilátka anti-CD25 redukuje mikrovaskulární denzitu nádoru [54]. TGF-β exprimovaný Treg buňkami je rovněž zahrnut do tohoto regulačního procesu. Přežití při antiangiogenní léčbě metastatického karcinomu ledviny sunitinibem koreluje s poklesem Treg buněk. VEGF indukuje zvýšení Treg buněk. Ačkoliv je angiogeneze slibným zprostředkovatelem interakce mezi CSC a Treg, stále chybí dostatek přesvědčivých důkazů jak in vivo, tak in vitro pro komplikovanost Treg interakcí.

Foxp3 IL-17 T buňky a CIC

Foxp3⁺ Treg buňky za určitých podmínek exprimují IL-17, který spolu s hypoxií hraje roli v regulaci nádor iniciujících buněk [55]. Foxp3⁺ IL-17 buňky např. stimulují vývoj markerů asociovaných s kolorektálním karcinomem v mononukleárních buňkách kostní dřeně. Hypoxie posiluje přechod Treg buněk do Foxp3⁺ IL-17⁺ buněk. Tyto buňky dále exprimují TGF-β, CXCR3 a CCR6.

Makrofágy zprostředkovaný nepřímý efekt na CSC

Makrofágy jsou modulovány mechanizmy zprostředkovanými molekulami CTLA-4, IL-10 a TGF-β. V časných fázích vývoje nádoru M1 typ makrofágů infiltruje tumor a produkuje proinflamatorní molekuly. V pozdějších fázích růstu v hypoxických podmínkách dochází k tranzici do M2 typu. M2 makrofágy produkují chemokinové ligandy CCL17, CCL22 a CCL24, které přitahují Treg buňky. Diferenciace M2 makrofágů je indukována CD4⁺25⁺ Treg buňkami, zatímco M1 makrofágy mohou být indukovány CD4⁺25^– T efektorovými buňkami. Diferenciace M1/ M2 je tedy modifikována přítomností Treg.

Modulace Treg CSC buňkami

Na druhé straně rovněž CSC ovlivňují Treg buňky rozličnými mechanizmy. Navíc k solubilním faktorům, které jsou produkovány CIC, CSC také regulují Treg pomocí přímého kontaktu indukovaného PD-L1.

Závěry

Treg buňky mají vitální úlohu v kontrole T dependentní protilátkou odpovědi. Treg buňky preferenčně kontrolují expanzi autoreaktivních T a B buněčných klonů. Nicméně Treg buňky se mohou podílet i na kontrole non-self odpovědí. Modulace humorální imunity Treg buňkami je komplexní proces zahrnující několik mechanizmů reagujících synergisticky nebo redundantně. CTLA-4 je klíčovým mechanizmem, kterým Treg buňky regulují formaci germinálních center. Tfreg buňky mohou využívat celou škálu dalších supresivních mechanizmů (jako jsou IL-10 a TGF-β), kterými mohou jemně ladit odpovědi germinálního centra.

Kvůli nedostatku znaků charakterizujících CSC a jejich vzájemný překryv zůstává specifická identifikace těchto buněk problematická. Experimentální výsledky ukazují na jejich vysokou rezistenci k chemoterapii a radioterapii, tedy zřejmý klinický význam jako terapeutický cíl v léčbě a prevenci recidivy nádoru. Na druhé straně, vzhledem ke klinické korelaci mezi Treg a špatnou prognózou pacientů s nádory, jsou nezbytné studie objasňující mechanizmus jejich interakcí. Existují přímé i nepřímé vazby mezi CSC a Treg. M2 typ makrofágů indukovaný Treg buňkami, který koreluje se špatnou prognózou některých nádorů, může hrát roli v regulaci CSC.

Četnost a funkce Treg u nádorů je významná, neboť zvýšený počet Treg buněk může podporovat rozvoj a růst nádoru. První práce přinesly informace o zvýšeném zastoupení Treg buněk u nemalobuněčného karcinomu plic a ovariálního karcinomu [56]. Tyto buňky produkovaly TGF-β a vykazovaly vysokou expresi CTLA-4. Zvýšený počet Treg buněk byl sledován u maligního melanomu [57] a u ovariálního karcinomu [58]. Totéž bylo prokázáno i u jiných typů nádorů. Tento fakt vyvolává další otázky: Je zvýšená frekvence Treg buněk časnou událostí při vzniku nádoru, nebo je pozdní reakcí organizmu na existující nádor? Jak současná terapie ovlivňuje množství Treg buněk? Existuje možnost deplece Treg buněk in vivo bez rizika indukce autoimunitní odpovědi?

Z myších modelů vyplývá, že k indukci tumor specifických Treg buněk dochází velmi časně ve vývoji nádoru [59]. Tento fakt může mít značný klinický význam, neboť k indukci Treg buněk dojde pravděpodobně před stanovením diagnózy nádoru u většiny pacientů. Selektivní akumulace Treg buněk byla studována na myších modelech. Blokáda IL-10 a FGF-β částečně obrátila supresi indukovanou Treg buňkami. Dále pak místní deplece CD4⁺ buněk vedla k eradikaci tumoru a rozvoji dlouhodobé protinádorové paměti [60]. To naznačuje, že suprese protinádorové odpovědi Treg buňkami se odehrává především v místě nádoru a že lokální ovlivnění může být velmi efektivní. Deplece Treg buněk může vést k obnovení protinádorové imunitní odpovědi. Tento směr výzkumu naznačuje velmi slibné výsledky v budoucnu.

Tato práce byla podpořena projektem VaVpI RECAMO – CZ.1.05/2.1.00/03.010.

Autor deklaruje, že v souvislosti s předmětem studie nemá žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

doc. MUDr. Martin Klabusay, Ph.D.

Klinika komplexní onkologické péče

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: martin.klabusay@mou.cz

Obdrženo: 2. 9. 2015

Přijato: 10. 11. 2015