Využití mozkomíšního moku pro analýzu mikroRNA

Souhrn

Východiska:
Deregulované hladiny mikroRNA (miRNA), krátkých nekódujících RNA pojících se s patogenezí mnoha onemocnění, byly pozorovány i v mozkomíšním moku (cerebrospinal fluid – CSF). Analýza miRNA v CSF u pacientů postižených nádory centrální nervové soustavy (CNS) by mohla pomoci vyvinout novou diagnostickou platformu umožňující přesnější diagnostiku. Proto se v naší studii snažíme optimalizovat metodické přístupy sloužící pro detekci miRNA, jako je izolace RNA a výběr vhodné technologie pro globální profilování miRNA v CSF.

Materiál a metody:
V rámci optimalizace izolace RNA z CSF bylo porovnáváno několik komerčně dostupných izolačních kitů s různými modifikacemi v protokolu. Při výběru nejvhodnější metody pro vysokokapacitní profilování miRNA byly testovány dva panely založené na kvantitativní polymerázové řetězové reakci a sekvenování nové generace.

Výsledky:
Jako nejvhodnější izolační kit byl vyhodnocen Urine miRNA Purification kit (Norgen). Jako nejlepší metoda pro následné vysokokapacitní profilování miRNA v CSF bylo vybráno sekvenování nové generace.

Závěr:
Optimalizovali jsme protokol pro izolaci RNA a vysokokapacitní analýzu miRNA v mozkomíšním moku.

Klíčová slova:
nádory centrální nervové soustavy – mozkomíšní mok – mikroRNA

Východiska

Primární nádory mozku představuji > 2 % všech malignit. Avšak maligní formy představují asi 33 % těchto nádorů, kdy prognóza a předpokládaná doba přežití pacienta závisí na typu nádoru. Určení správné diagnózy pak samozřejmě hraje rozhodující roli při výběru nejvhodnější terapie. Navzdory významným pokrokům v diagnostice nádorů mozku, jako jsou různé modifikace zobrazovacích metod a následné histopatologické vyšetření tkáně, je diagnostika stále omezena lokalizací nádoru a jeho značnou heterogenitou [1]. Proto je stále potřeba vyvíjet nové přístupy, které společně s existujícími metodami zvýší přesnost diagnostiky nádorů mozku a tím i přežití pacientů. Slibné diagnostické markery mnoha nádorových onemocnění se zdají být cirkulující biomolekuly, jejichž hladiny mohou být změněny v tělních tekutinách jako je krev, moč nebo sliny. Nicméně přítomnost hematoencefalické bariéry brání uvolňování nádorově specifických molekul do výše uvedených tělesných tekutin [2]. Mozkomíšní mok (cerebrospinal fluid – CSF), který omývá centrální nervovou soustavu (CNS) a je v přímém kontaktu s patologickou tkání mozku, se jeví jako vhodný zdroj diagnostických biomarkerů [3,4]. MikroRNA (miRNA) jsou skupinou jednořetězcových nekódujících RNA, jež jsou často tkáňově specifické a zapojeny do patogeneze mnoha nádorových onemocnění. Jelikož deregulované hladiny miRNA pojící se s nádory CNS byly již v CSF detekovány, mohla by jejich analýza pomoci k přesnějšímu stanovení diagnózy [5]. Bohužel detekce miRNA v tělních tekutinách není snadný úkol, zvláště v případě CSF s extrémně nízkým obsahem celkové RNA. Proto se zde snažíme optimalizovat příslušné metodické postupy především na úrovni izolace RNA z CSF a následného expresního profilování miRNA.

Materiál a metody

Pro fázi optimalizace byly použity vzorky CSF od pacientů s glioblastomem a kontrolních pacientů s hydrocefalem bez malignity v anamnéze. Všichni pacienti podepsali informovaný souhlas týkající se využití mozkomíšního moku a klinických dat pro výzkumné účely. Ihned po dodání byly vzorky CSF centrifugovány 500 g/10 min k odstranění buněčných komponent CSF, supernatant byl alikvotován po 1 ml a dále skladován při –80 °C. Během optimalizace izolace celkové RNA byly testovány následující izolační kity – miRNeasy (Qiagen) při vstupním objemu 500 µl CSF, použití glykogenu (50 ng/1 vzorek) a snížení objemu elučního roztoku na 30 µl, Urine miRNA Purifficaion kit (Norgen) při vstupním objemu 1 ml a snížení objemu elučního roztoku na 30 µl spolu s 20min inkubací na kolonce. Při výběru nejvhodnější metody pro vysokokapacitní profilování miRNA byly odzkoušeny – miRCURY LNA™, miRNA Ready-to-Use PCR (polymerase chain reaction), Human Panel I V4-R (Exiqon); TaqMan Low Density Arrays, TaqMan® Array Human MicroRNA A + B Cards Set v3.0 s preamplifikačním krokem (Thermo Fisher Scientific) a sekvenování nové generace na přístroji NextSeq 500 s využitím CleanTag small RNA Library Preparation Kitu (Trilink, Biotechnologies) pro přípravu knihoven.

Výsledky

Vzhledem k informacím získaným v dosavadní literatuře a našim zkušenostem s izolací RNA byly na dvou vzorcích CSF otestovány dva nejlépe hodnocené kity s určitými modifikacemi v protokolu – miRNeasy s glykogenem (Qiagen) a Urine miRNA Purification kit (Norgen). Dosažené výsledky ukazují, že Urine miRNA Purification kit umožňuje izolovat RNA v průměru 17× účinněji než miRNeasy kit s glykogenem, což bylo následně validováno a statisticky potvrzeno pomocí Wilcoxonova párového testu na dalším souboru šesti vzorků CSF (p < 0,05).

Při výběru nejvhodnější metody pro vysokokapacitní analýzy hladin miRNA v CSF byly nejprve na dvou vzorcích vyzkoušeny tři nejčastěji používané technologie – miRCURY LNA™: miRNA Ready-to-Use PCR, Human Panel I V4-R, Exiqon; TaqMan Low Density Arrays (TLDA): TaqMan® Array Human miRNA A + B Cards Set v3.0 s preamplifikačním krokem, Thermo Fisher Scientific a sekvenování nové generace na přístroji NextSeq 500, Illiumina.

U obou vzorků byla pozorována velmi nízká míra korelace u hladin vybraných miRNA výsledků následující generaci sekvenování (next generation sequencing – NGS) ve srovnání s oběma technologiemi založenými na PCR.

Diskuze a závěr

Jelikož izolace miRNA z tělních tekutin o nízkém obsahu celkového RNA není jednoduchá, protokol již zmiňovaných komerčně dostupných kitů byl modifikován dle dosavadní literatury a našich zkušeností [6,7]. Zvyšování vstupního objemu vzorku, delší inkubace na kolonce a snižování objemu elučního roztoku se ukázaly jako nejvíce účinné při použití kitu Urine miRNA Purification kit (Norgen). Při výběru vhodné vysokokapacitní technologie pro analýzu globálních profilů miRNA jsme porovnávali tři nejčastěji užívané přístupy – miRCURY LNA (Exiqon) a TLDA s preamplifikačním krokem (ThermoFisher Scientific), jež jsou založeny na PCR platformě a dále NGS na přístroji NextSeq 500 (Illumina). Jednou z hlavních nevýhod, související s vlastní podstatou metody, technologií založených na real-time PCR (RT-PCR) je omezený počet miRNA, které je možné detekovat. Další nevýhodou je možná vyšší pravděpodobnost chybovosti již při manipulaci se vzorkem kvůli nízké koncentraci miRNA ve vzorku. Z důvodu preamplifikace cDNA je u TLDA ve srovnání s miRCURY počet detekovaných miRNA a medián jejich Ct hodnot navýšen, nicméně krok preamplifikace nejspíše způsobuje určitou míru zkreslení ve výsledných datech. Toto tvrzení potvrzuje korelační analýza porovnávající výsledky NGS a obou RT-PCR technologií, kdy byla nejnižší míra korelace detekována vždy u TLDA metody. Normalizace obdržených dat představuje další problém a to v nalezení vhodné endogenní kontroly [8]. U metod založených na RT-PCR je navíc důležité také vyřešit normalizaci mezi Panely (I + II) u systému Exiqon či deskami (A + B) v případě systému TLDA. Z tohoto důvodu jsou nejčastější endogenní kontroly (RNU48, RNU44, snoRNA, U6) již součástí každé desky, avšak jak bylo pozorováno ve studii [9] nebo i v našem případě, tyto kontroly nejsou v CSF vždy přítomné. Naproti tomu NGS, u kterého je počet detekovatelných miRNA neomezen a je tedy možné objevit i nové miRNA, jejich izoformy nebo další druhy krátkých RNA, vychází jako nejvhodnější technologie pro globální analýzy miRNA v CSF. Proveditelnost této metody v CSF již byla prokázána [7].

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Tato studie byla vypracována s grantovou podporou Ministerstva zdravotnictví České republiky, grant č 15-34553A. Všechna práva vyhrazena.

MUDr. Pavel Fadrus, Ph.D.

Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno

Jihlavská 20 625 00 Brno

e-mail: fadrus.pavel@fnbrno.cz

Obdrženo: 19. 3. 2018

Přijato: 10. 4. 2018