Močové mikroRNA jako potenciální biomarkery karcinomu močového měchýře

Urinary MicroRNAs as Potential Biomarkers of Bladder Cancer

Background:
Currently, there are no urinary-based tumour markers with sufficient sensitivity and specificity to replace cystoscopy in the detection of bladder cancer (BCA). Urinary microRNAs are emerging as clinically useful class of biomarkers for early and non-invasive detection of urologic malignancies.

Patients and Methods:
In this study, 155 patients with BCA and 83 healthy controls were enrolled. Expression profiles of urinary miRNAs were obtained using Affymetrix miRNA microarrays and candidate miRNAs further validated in independent cohort using specific TaqMan assays and quantitative real-time polymerase chain reaction method.

Results:
Whole-genome profiling identified miRNA signature with significantly different concentrations in urine of BCA compared to controls (p < 0.01). In the independent validation phase of the study, three miRNAs were confirmed to have significantly higher levels in urine of patients with BCA in comparison with control groups (p < 0.0001). In addition, we observed significant decrease in two miRNAs (p < 0.01) concentrations in the urinary samples collected 3 months after surgery compared to pre-operative samples.

Conclusion:
We identified and validated miRNAs to have significantly higher concentrations in urine of patients with BCA in comparison with controls. Our data have shown that urinary miRNAs could serve as sensitive and specific biomarkers enabling non-invasive detection of BCA.

Key words:
urinary microRNAs – biomarkers – bladder cancer

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

This study was supported by Ministry of Health of the Czech Republic, grant No. 15-31071A. All rights reserved.

Submitted:
19. 3. 2018

Accepted:
20. 3. 2018

Autoři: J. Juráček ¹; M. Staník ²; B. Peltanová ³; S. Adamcová ¹; J. Doležel ²; M. Fedorko ⁴; L. Radová ¹; O. Slabý ¹
Působiště autorů: CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno ¹; Oddělení urologické onkologie, Masarykův onkologický ústav, Brno ²; Ústav biochemie, PřF MU, Brno ³; Urologická klinika LF MU a FN Brno ⁴
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2018; 31(Supplementum1): 155-157
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska:
V současnosti nejsou klinicky využitelné tumorové markery založené na analýze moči, které by byly dostatečně citlivé a specifické, aby nahradily cystoskopii v detekci karcinomu močového měchýře (bladder cancer – BCA). Jednou z možností jsou močové mikroRNA (miRNA) představující novou skupinu biomarkerů pro časnou a neinvazivní diagnostiku urologických malignit.

Soubor pacientů a metody:
Do studie bylo zařazeno 155 pacientů s BCA a 83 zdravých kontrol. Expresní profily močových miRNA byly identifikovány za použití Affymetrix miRNA microarrays. Kandidátní miRNA byly dále validovány na nezávislé kohortě pacientů pomocí specifických TaqMan assays metodou kvantitativní real-time polymerázové řetězové reakce.

Výsledky:
Globální profilování genové exprese odhalilo panel miRNA, které byly významně rozdílně exprimovány u pacientů s BCA ve srovnání se zdravými kontrolami (p < 0,01). V rámci validační fáze byla u tří miRNA potvrzena významně vyšší koncentrace v moči pacientů s BCA v porovnání s kontrolními skupinami (p < 0,0001).

Závěr:
Identifikovali jsme miRNA, jejichž hladina je významně zvýšena v moči pacientů s BCA. Naše data ukazují, že močové miRNA mohou sloužit jako senzitivní a specifické biomarkery pro časnou a neinvazivní detekci BCA.

Klíčová slova:
močové mikroRNA – biomarkery – karcinom močového měchýře

Východiska

Karcinom močového měchýře (bladder cancer – BCA) představuje s přibližně 430 000 novými případy ročně nejčastější urologickou malignitu [1]. Z více než 90 % se jedná o uroteliální karcinom, který se na základě TNM klasifikace a histopatologického gradingu dále dělí na sval invadující (muscle-invasive bladder cancer – MIBC) a sval neinvadující karcinomy (non-muscle-invasive bladder cancer – NMIBC) postihující až 80 % pacientů [2]. Přes relativně dobrou prognózu sval neinvadující formy je u těchto karcinomů v 50–70 % detekována lokální recidiva a u přibližně 20 % primárně povrchových karcinomů dochází k progresi v invazivní formu [3]. Základní metodou pro stanovení diagnózy a monitorování pacientů je uretrocystoskopie a to i přes invazivní charakter vyšetření a nižší citlivost v případě malých papilárních karcinomů nebo karcinomů in situ [4]. Vylepšení detekce a sledování onemocnění ideálně za využití analýzy moči by tak vedlo ke snížení mortality i výdajů spojených s opakovanými resekcemi a častými cystoskopickými kontrolami.

MikroRNA (miRNA) tvoří početnou skupinu regulačních krátkých nekódujících RNA zapojených do patogeneze mnoha nádorových onemocnění vč. BCA [5]. Velké množství studií již popsalo přítomnost cirkulujících miRNA v tělních tekutinách a zejména močové miRNA představují relativně novou třídu molekulárních biomarkerů vykazujících vysokou stabilitu a výborné analytické vlastnosti [6].

Soubor pacientů a metody

Do studie bylo zařazeno 155 pacientů, kteří v období 2013–2016 podstoupili na Oddělení urologické onkologie Masarykova onkologickém ústavu (MOÚ) transuretrální resekci (TUR) nebo radikální cystektomii (RACE) s potvrzeným BCA nebo podezřením na toto onemocnění. Studie byla schválena etickou komisí MOÚ a všichni účastníci podepsali informovaný souhlas. Zdravé kontroly zahrnují chirurgicky léčené pacienty s benigními urologickými obtížemi. Vzorky moči byly odebírány před chirurgickým výkonem, u vybraných pacientů byla moč sbírána také pooperativně a 3 měsíce po operaci.

Vzorky první ranní moči byly sbírány do 15ml zkumavek s přídavkem EDTA sloužícího k prezervaci RNA a centrifugovány 15 min při 4 °C a 2 000 g. Močový supernatant byl odebrán a skladován při –80 °C. Před izolací RNA byly vzorky opětovně centrifugovány 15 min při 4 °C a 12 000 g. Celková RNA z 1 ml močového supernatantu byla izolována za použití Urine miRNA Purification Kit (Norgen Biotek).

V rámci explorativní fáze studie byl analyzován močový supernatant 15 pacientů s BCA a 16 zdravých kontrol pomocí GeneChip miRNA 3.0 arrays (Affymetrix) umožňující detekci 1 733 lid-ských maturovaných miRNA. Expresní data byla normalizována a statisticky evaluována v prostředí programovacího jazyka R za použití nástrojů Bioconductor [7]. miRNA splňující přednastavená kritéria (fold change > 2,5, průměrná exprese > 3, p < 0,0025) byly vybrány pro následnou validaci.

Během validační fáze studie byla stanovena koncentrace miR-31-5p, miR-93-5p a miR-191-5p ve vzorcích moči 140 pacientů s BCA, 67 zdravých kontrol a 30 pacientů s renálním karcinomem (renal cell carcinoma – RCC) za použití metody qRT-PCR (kvantitativní real-time polymerázové řetězové reakce) v souladu s TaqMan MicroRNA Assay protokolem (ThermoFisher Scientific). Analýza byla provedena na přístroji Roche LightCycler 480 PCR system a v rámci každé PCR desky byla zahrnuta inter-plate kontrola. Absolutní koncentrace miRNA byla stanovena za použití chemicky syntetizovaných miRNA oligonukleotidů (IDT), které byly sériově ředěny a analyzovány paralelně s qRT-PCR biologických vzorků. Ct hodnoty biologických vzorků byly převedeny na absolutní koncentraci na základě relevantní kalibrační křivky. Statistická analýza byla provedena za použití softwaru GraphPad Prism vs. 6.00. Srovnání koncentrace miRNA mezi pacienty s BCA a referenčními skupinami bylo provedeno Mann-Whitney U testem a Kruskal-Wallis testem. ROC analýza byla provedena za účelem stanovení diagnostických schopností miRNA.

Výsledky

Za pomocí globálního profilování genové exprese jsme identifikovali sadu 76 miRNA významně rozdílně exprimovaných v moči pacientů s BCA (p < 0,01) v porovnání se zdravými kontrolami, z toho 64 mělo zvýšenou hladinu a 12 miRNA hladinu sníženou. Na základě statistické analýzy byly pro validaci vybrány molekuly miR-31-5p, miR-93-5p a miR-191-5p, jejichž koncentrace byla dále stanovena ve vzorcích moči 140 pacientů s BCA, 67 zdravých kontrol a 30 pacientů s RCC. Koncentrace miR-31-5p (p < 0,0001), miR-93-5p (p < 0,0001) a miR-191-5p (p < 0,0001) v moči pacientů s BCA byla statisticky významně vyšší v porovnání s kontrolními skupinami. Následná ROC analýza ukazuje schopnost miR-31-5p, miR-93-5p a miR-191-5p rozlišit pacienty a zdravé kontroly s plochou pod křivkou 0,78, 0,8 a 0,76.

Diskuze a závěr

Močové miRNA představují slibnou skupinu potenciálních biomarkerů urologických malignit [6]. V naší předchozí studii jsme popsali miRNA v moči pacientů s RCC, kde by mohly sloužit jako potenciální neinvazivní biomarkery tohoto onemocnění [8]. Podobně několik dalších prací popisuje specifické miRNA ve vztahu k časné detekci nebo předpovědi prognózy u BCA [9,10]. Většina těchto studií se však neshoduje v identifikovaných miRNA, což může být způsobeno častým statistickým podhodnocením z důvodu zařazení malého počtu subjektů do studie nebo absence nezávislé validační kohorty. Kromě toho některé studie pracují s diagnostickými/prognostickými systémy založenými na expresi velkého množství miRNA a často se liší v důležitých technologických aspektech spojených zejména s preanalytickou fází, které mají zásadní vliv na získané výsledky [11–13].

V naší studii jsme identifikovali a validovali miR-31-5p, miR-93-5p a miR-191-5p jako molekuly s významně vyšší koncentrací v moči pacientů s BCA v porovnání s kontrolními skupinami. Zvýšená hladina těchto miRNA v moči může být asociovaná s jejich hladinou v tkáni BCA. V rámci datasetu v databázi TCGA (The Cancer Genome Atlas) je hladina miR-93-5p významně zvýšena v tkáni uroteliálního karcinomu močového měchýře v porovnání s přilehlou nenádorovou tkání a miR-31-5p je nejvýznamněji deregulovanou miRNA definující podtyp 4 [14]. Jedním z ukazatelů zvýšené sekrece těchto miRNA do moči může být i fakt, že u miR-93-5p a miR-191-5p byl pozorován významný pokles v koncentraci ve vzorcích moči odebraných 3 měsíce po odstranění tumoru.

V porovnání s ostatními pracemi je naše studie provedena na zatím největší klinicky charakterizované skupině pacientů s BCA. Výsledky jasně ukazují diagnostický potenciál močových miRNA, přesto jsou pro případné klinické využití nutné nezávislé validační studie.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Tato studie byla vypracována s grantovou podporou Ministerstva zdravotnictví České republiky, grant č. 15-31071A. Všechna práva vyhrazena.

Mgr. Jaroslav Juráček

CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU

Kamenice 753/5 625 00 Brno

e-mail: juracek.jaroslav@gmail.com

Obdrženo: 19. 3. 2018

Přijato: 20. 3. 2018

Zdroje

1. Antoni S, Ferlay J, Soerjomataram I et al. Bladder cancer incidence and mortality: a global overview and recent trends. Eur Urol 2017; 71 (1): 96–108. doi: 10.1016/j.eururo.2016.06.010.

2. Colombel M, Soloway M, Akaza H et al. Epidemiology, staging, grading, and risk stratification of bladder cancer. Eur Urol Suppl 2008; 7 (10): 618–626. doi: 10.1016/j.eursup.2008.08.002.

3. Prout G, Barton B, Griffin P et al. Treated History of Noninvasive Grade 1 Transitional Cell Carcinoma. J Urol 1992; 148 (5): 1413–1419.

4. Lee C, Yoon C, Witjes J. The past, present and future of cystoscopy: the fusion of cystoscopy and novel imaging technology. BJU Int 2008; 102 (9 Pt B): 1228–1233. doi: 10.1111/j.1464-410X.2008.07964.x.

5. Lu J, Getz G, Miska E et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 2005; 435 (7043): 834–838. doi: 10.1038/nature03702.

6. Mlcochova H, Hezova R, Stanik M et al. Urine microRNAs as potential noninvasive biomarkers in urologic cancers. Urol Oncol 2014; 32 (1): 41.e1–e9. doi: 10.1016/j.urolonc.2013.04.011.

7. R Core Team. R. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. [online]. Available from: http: //www.R-project. org/.

8. Fedorko M, Juracek J, Stanik M et al. Detection of let-7 miRNAs in urine supernatant as potential diagnostic approach in non-metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Biochem Med 2017; 27 (2): 411–417. doi: 10.11613/BM.2017.043.

9. Hanke M, Hoefig K, Merz H et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol 2010; 28 (6): 655–661. doi: 10.1016/j.urolonc.2009.01.027.

10. Puerta-Gil P, García-Baquero R, Jia AY et al. miR-143, miR-222, and miR-452 are useful as tumor stratification and noninvasive diagnostic biomarkers for bladder cancer. Am J Pathol 2012; 180 (5): 1808–1815. doi: 10.1016/j.ajpath.2012.01.034.

11. Pospisilova S, Pazourkova E, Horinek A et al. MicroRNAs in urine supernatant as potential non-invasive markers for bladder cancer detection. Neoplasma 2016; 63 (5): 799–808. doi: 10.4149/neo_2016_518.

12. Urquidi V, Netherton M, Gomes-Giacoia E et al. A microRNA biomarker panel for the non-invasive detection of bladder cancer. Oncotarget 2016; 7 (52): 86290–86299. doi: 10.18632/oncotarget.13382.

13. De Long J, Sullivan TB, Humphrey J et al. A non-invasive miRNA based assay to detect bladder cancer in cell-free urine. Am J Transl Res 2015; 7 (11): 2500–2509.

14. Weinstein J, Akbani R, Broom B et al. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of urothelial bladder carcinoma. Nature 2014; 507 (7492): 315–322. doi: 10.1038/nature12965.