Dysregulace dlouhých nekódujících RNA u multiformního glioblastomu a jejich studium s využitím moderních molekulárně-genetických přístupů

Česká verzia English info

Dysregulation of Long Non-coding RNAs in Glioblastoma Multiforme and Their Study Through Use of Modern Molecular-Genetic Approaches

Background:
Glioblastoma (GBM) is the most frequent primary brain tumor characterized by an unfavourable prognosis despite multimodal therapy. Therefore, a lot of efforts and financial resources are dedicated to the research of new therapeutic targets and prognostic or predictive biomarkers. Long non-coding RNAs (lncRNAs) are regulators of gene expression which play a significant role in GBM pathology and, thus, present promising candidates.

Material and Methods:
Our study included 14 patients with GBM and 8 patients with intractable epilepsy from whom we acquired brain tissues during surgical intervention. Ribosomal RNA depleted RNA was used for sequencing by NextSeq 500 instrument (Illumina). Statistical analysis evaluated 24,087 protein-coding and 8,414 non-coding RNAs and their sequential variants with non-zero reads per kilobase per million mapped reads (RPKM) at least in one sample. CLC Genomic Workbench was used for the alignment and target counts. Targeted downregulation of up-regulated ZFAS1, one of the identified lncRNA, level has been carried out by the transient transfection of specific small interfering RNA (siRNA) in GBM stable cell lines (A172, U87MG, T98G). The success of transfection and viability were analyzed in vitro using quantitative real time polymerase chain reaction and MTT assay, resp.

Results:
Statistical analysis has revealed 274 (p < 0.01) dysregulated lncRNAs in GBMs in comparison with non-tumor brain tissues. Moreover, the results have showed 489 dysregulated mRNAs (p < 0.0001) and 26 mRNAs (p < 0.000001). Transfection of ZFAS1 inhibitor led to successful downregulation of ZFAS1 expression level, although it did not have a significant effect on proliferation of GBM cells.

Conclusion:
We described a significant dysregulation of lncRNAs and mRNAs in GBM tissue in comparison with non-tumor tissue. We also succesfully decreased expression level of ZFAS1, which in turn, however, had no impact on the viability of GBM cell lines.

Key words:
glioblastoma – long non-coding RNA – next-generation sequencing

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

This tudy was supported by Ministry of Health of the Czech Republic, grant No. 15-33158A. All rights reserved.

Submitted:
19. 3. 2018

Accepted:
10. 4. 2018

Autoři: M. Večeřa ¹; J. Šána ¹; R. Bútová ¹; Š. Reguli ²; M. Hermanová ³; L. Křen ⁴; R. Lipina ²; M. Smrčka ⁵; O. Slabý ¹
Působiště autorů: CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno ¹; Neurochirurgická klinika LF UO a FN Ostrava ²; I. patologicko-anatomický ústav, LF MU a FN u sv. Anny v Brně ³; Ústav patologie, LF MU a FN Brno ⁴; Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno ⁵
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2018; 31(Supplementum1): 168-170
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska:
Glioblastom (GBM) je nejčastější primární nádor mozku, který je charakterizován nepříznivou prognózou i navzdory veškeré dostupné léčbě. Z tohoto důvodu je vynaloženo mnoho finančních prostředků a úsilí do výzkumu nových prognostických a prediktivních biomarkerů či terapeutických cílů. Dlouhé nekódující RNA (long non-coding – lncRNA) jsou regulátory genové exprese, které hrají významnou roli v patologii GBM, a zdají se proto být vhodnými kandidáty ke studiu.

Materiál a metody:
Naše studie zahrnovala 14 pacientů s GBM a 8 pacientů s intraktabilní epilepsií, kterým byla odebrána mozková tkáň v rámci epileptochirurgických výkonů. Ribozomální RNA depletovaná RNA byla použita na sekvenování pomocí přístroje NextSeq 500 (Illumina). Statistickou analýzou bylo vyhodnoceno 24 087 mRNA a 8 414 lncRNA a jejich sekvenčních variant s nenulovým RPKM (počet readů na kilobázi na milión mapovaných readů) alespoň v jednom vzorku. Pro mapování sekvencí na referenční genom a součet čtení připadajících na cílovou sekvenci byl použit CLC Genomic Workbench. Cílené utlumení zvýšené exprese ZFAS1 bylo provedeno pomocí tranzientní transfekce specifické skupiny dvouvláknových RNA (small interfering – siRNA) do stabilních GBM linií (A172, U87MG, T98G). Úspěšnost transfekce byla ověřena prostřednictvím kvantitativní real-time polymerázové řetězové reakce a vliv na viabilitu pomocí MTT assay.

Výsledky:
Statistickou analýzou bylo objeveno 274 (p < 0,01) lncRNA dysregulovaných ve tkáňových vzorcích GBM v porovnání s nenádorovými mozkovými tkáněmi. Sekvenování taktéž odhalilo 489 dysregulovaných mRNA (p < 0,001) a 26 mRNA (p < 0,000001). Transfekce inhibitoru ZFAS1, jedné z identifikovaných lncRNA, vedla k úspěšnému utlumení hladiny ZFAS1, které ovšem nemělo vliv na snížení míry proliferace buněčných linií.

Závěr:
Popsali jsme významnou dysregulaci lncRNA a mRNA ve tkáních GBM v porovnání s nenádorovou tkání. Dále jsme úspěšně utlumili hladinu ZFAS1, což ovšem nemělo vliv na proliferaci glioblastomových buněk.

Klíčová slova:
glioblastom – dlouhé nekódující RNA – sekvenování nové generace

Východiska

Glioblastom (GMB) je nejčastější primární maligní intrakraniální tumor mozku, který je spjatý s velmi nepříznivou prognózou a terapeutickou odpovědí [1]. Konvenční léčba je sestavena z chirurgické resekce a konkomitantní chemoradioterapie s temozolomidem (TMZ), a v některých případech z následné aplikace TMZ v monoterapii [2]. Medián celkového přežití (overall survival – OS) pacientů mladších 70 let se pohybuje přibližně mezi 12 a 16 měsíci od stanovení diagnózy [1,3]. Standardní histopatologická diagnostika bohužel není schopna reflektovat tuto variabilitu v přežívaní [4]. Studium molekulárního pozadí GBM je z tohoto hlediska tedy klíčovým přístupem vedoucím nejen ke správné diagnóze, ale i k přesnějšímu určení prognózy, příp. predikce terapeutické odpovědi [5]. Epigenetické umlčení genu MGMT metylací jeho promotorové oblasti je jediným doposud známým molekulárním prediktivním markerem odpovědi na léčbu TMZ [6,7]. Jedním z pozitivních prognostických molekulárních markerů u GBM je heterozygotní mutace genu IDH1 v kodonu 132 s výskytem přibližně 12 % a téměř výlučně v sekundárních GBM [8]. Největší pokrok a detailnější poznání v této oblasti umožnil rozvoj nových metod vč. sekvenování nové generace, které odhalilo mnoho genetických aberací v nádorovém genomu GBM a dysregulaci hladin exprese vybraných skupin genů.

Jednou z těchto skupin jsou i dlouhé nekódující RNA (long non-coding – lncRNA), které jsou definované jako transkripty delší 200 nt bez schopnosti kódovat proteiny sloužící v buněčné fyziologii jako strukturní a regulační jednotky. V lidském organizmu bylo doposud identifikováno 50 000 lncRNA, o jejichž fyziologických a aberantních funkcích je zatím známo málo [9,10]. Současné studie u GBM se zabývají především schopností lncRNA plnit role nových prognostických a prediktivních biomarkerů, a možných terapeutických cílů zvyšujících efektivitu léčby GBM.

Vícero studií se zaměřilo na komparativní profilování lncRNA v nádorových a nenádorových tkáních a hledání potenciálních prognostických či prediktivních markerů GBM pomocí sekvenování a statistických a výpočetních metod. Příkladem je studie od Zhang et al, kteří v kohortě 213 GBM tumorů z The Cancer Genome Atlas identifikovali a na dvou nezávislých kohortách validovali sadu 6 lncRNA, jejichž exprese nezávisle na věku a metylačním statusu promotoru MGMT významně korelovala s OS. Tato sada zahrnovala již v literatuře popsané lncRNA PART1, MIAT a GAS5 [11]. Stejný tým se také zaměřil na asociaci exprese lncRNA s mutací IDH1 (R132). S využitím dat z Gene expression omnibus databáze identifikovali několik dysregulovaných lncRNA v GBM s touto mutací v porovnání s GBM s nemutovanou variantou. Z nich pak byly identifikovány dvě lncRNA KIAA0495 a HOTAIRM1, které vykazovaly významně sníženou expresi v GBM s mutovaným genem IDH1 a mohly by tak přispět k přesnějšímu určení prognózy [12]. Další typ studií se zabýval přímo rolí lncRNA v biologii GBM a mechanizmem jejich účinku a zkoumal, jestli by některé z nich mohly v budoucnu posloužit jako nové terapeutické cíle. Příkladem jsou HOXA11-AS s prognostickým významem a jeho silná asociace s progresí buněčného cyklu a zvýšenou proliferací nádorových buněk [13] a tumor supresorová MEG3 asociováná s p53 a zvýšenou apoptózou [14].

Materiál a metody

V naší práci jsme se zaměřili na analýzu transkriptomu 14 vzorků GBM tkáně získaných od pacientů léčených Stuppovým protokolem a 8 zdravých mozkových tkání bez známek dysplastických změn odebraných pacientům s intraktabilní epilepsií. Informovaný souhlas schválený etickou komisí byl obdržen od pacientů před započetím léčby. RNA zbavená ribozomální RNA byla použita na přípravu komplementární DNA knihoven a sekvenování pomocí přístroje NextSeq 500 (Illumina). Statistickou analýzou pak bylo vyhodnoceno 24 087 mRNA a 8 414 lncRNA a jejich sekvenčních variant s nenulovým počtem čtení genu na kilobázi délky jeho transkriptu na milión mapovaných čtení alespoň v jednom vzorku. Pro mapování sekvencí na referenční genom a součet čtení připadajících na cílovou sekvenci byl použit CLC Genomic Workbench. Cílené utlumení zvýšené exprese ZFAS1 bylo provedeno pomocí tranzientní transfekce specifické skupiny dvouvláknových RNA (small interfering – siRNA) do stabilních GBM linií (A172, U87MG, T98G) a úspěšnost transfekce byla ověřena prostředníctvím kvantitativní real-time polymerázové řetězové reakce a vliv na viabilitu pomocí MTT assay.

Výsledky

Z výše uvedeného počtu hodnocených molekul bylo statistickou analýzou objeveno 274 (p < 0,01) dysregulovaných lncRNA ve vzorcích GBM v porovnání s nenádorovými mozkovými tkáněmi. Výsledky sekvenování navíc odhalily 489 dysregulovaných mRNA (p < 0,0001) a 26 mRNA (p < 0,000001). Jedna z nejvíce v GBM exprimovaných lncRNA, ZFAS1, byla vybrána pro následnou in vitro funkční analýzu v stabilních buněčných liniích A172, U87MG a T98G. Tranzientní transfekce siRNA inhibitoru ZFAS1 měla za následek sníženou expresi ZFAS1 ve všech třech buněčných liniích. Cílené utlumení exprese ZFAS1 ovšem nevedlo k významnému snížení míry proliferace a viability ani u jedné z buněčných linií.

Diskuze a závěr

Uvedené výsledky potvrdily statisticky významnou dysregulaci lncRNA a mRNA v GBM v porovnání s nenádorovými mozkovými tkáněmi. Tyto RNA tedy mají značný potenciál stát se vhodnými diagnostickými biomarkery či terapeutickými cíli u GBM. Výsledky však bude nutné validovat na širším nezávislém souboru GBM vzorků. Dále jsme úspěšně utlumili hladinu lcnRNA ZFAS1, což ovšem nemělo vliv na viabilitu a proliferaci buněčných linií. Je tedy pravděpodobné, že ZFAS1 se na nádorovém fenotypu nepodílí skrze regulaci proliferace či apoptózy, ale spíše zapojením do dějů souvisejících s migrací a invazivitou.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Tato studie byla vypracována s grantovou podporou Ministerstva zdravotnictví České republiky, grant č. 15-33158A. Všechna práva vyhrazena.

doc. MUDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU

Kamenice 753/5 625 00 Brno

e-mail: on.slaby@gmail.com

Obdrženo: 19. 3. 2018

Přijato: 10. 4. 2018

Zdroje

1. Delgado-López PD, Corrales-García EM. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clin Transl Oncol 2016; 18 (11): 1062–1071. doi: 10.1007/s12094-016-1497-x.

2. Stupp R, Hegi ME, Mason WP et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol 2009; 10 (5): 459–466. doi: 10.1016/S1470-2045 (09) 70025-7.

3. Lakomy R, Fadrus P, Slampa P et al. Multimodal treatment of glioblastoma multiforme: results of 86 consecutive patients diagnosed in period 2003–2009. Klin Onkol 2011; 24 (2): 112–120.

4. Ohgaki H, Kleihues P. The definition of primary and secondary glioblastoma. Clin Cancer Res 2013; 19 (4): 764–772. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-3002.

5. Verhaak RG, Hoadley KA, Purdom E et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell 2010; 17 (1): 98–110. doi: 10.1016/j.ccr.2009.12.020.

6. Agnihotri S, Gajadhar AS, Ternamian C et al. Alkylpurine-DNA-N-glycosylase confers resistance to temozolomide in xenograft models of glioblastoma multiforme and is associated with poor survival in patients. J Clin Invest 2012; 122 (1): 253–266. doi: 10.1172/JCI59334.

7. Lee SY. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes Dis 2016; 3: 198–210. doi: 10.1016/j.gendis.2016.04.007.

8. Sanson M, Marie Y, Paris S et al. Isocitrate dehydrogenase 1 codon 132 mutation is an important prognostic biomarker in gliomas. J Clin Oncol 2009; 27 (25): 4150–4154. doi: 10.1200/JCO.2009.21.9832.

9. Iyer MK, Niknafs YS, Malik R et al. The landscape of long noncoding RNAs in the human transcriptome. Nat Genet 2015; 47 (3): 199–208. doi: 10.1038/ng.3192.

10. Derrien T, Johnson R, Bussotti G et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Res 2012; 22 (9): 1775–1789. doi: 10.1101/gr.132159.111.

11. Zhang XQ, Sun S, Lam KF et al. A long non-coding RNA signature in glioblastoma multiforme predicts survival. Neurobiol Dis 2013; 58: 123–131. doi: 10.1016/j.nbd.2013.05.011.

12. Zhang XQ, Kiang KM, Wang YC et al. IDH1 mutation-associated long non-coding RNA expression profile changes in glioma. J Neurooncol 2015; 125 (2): 253–263. doi: 10.1007/s11060-015-1916-9.

13. Wang Q, Zhang J, Liu Y et al. A novel cell cycle-associated lncRNA, HOXA11-AS, is transcribed from the 5-prime end of the HOXA transcript and is a biomarker of progression in glioma. Cancer Lett 2016; 373 (2): 251–259. doi: 10.1016/j.canlet.2016.01.039.

14. Wang P, Ren Z, Sun P. Overexpression of the long non-coding RNA MEG3 impairs in vitro glioma cell proliferation. J Cell Biochem 2012; 113 (6): 1868–1874. doi: 10.1002/jcb.24055.