VI. Diagnostické metody v onkologii a biobanking

VI/ 30. DNA metylační profilování – nová dia­gnostická metoda pronikající do rutinní praxe v chirurgické patologii zejména mozkových a mezenchymálních nádorů

Michal M., Martínek P., Švajdler M.

Oddělení patologie, Bioptická laboratoř s.r.o. Plzeň

Východiska: DNA metylace patří mezi zásadní epigenetické mechanizmy hrající důležitou roli jak při normálním fyziologickém vývoji, tak při vzniku a rozvoji onemocnění. Tzv. metylační pattern DNA nádorových buněk je ovlivněn jak typem buňky, ze které nádor vzniká, tak získanými změnami během progrese onemocnění. Rozsáhlý výzkum DNA metylačního profilování mozkových nádorů prokázal, že tento pattern je pro jednotlivé nádorové jednotky v neuropatologii vysoce specifický a umožňuje ve většině případů pomocí této metody velmi přesně rozlišit mezi různými typy mozkových neoplazií. Navíc bylo prokázáno, že dia­gnostické schopnosti této metody v ně­kte­rých případech dokonce převyšují dosud používané dia­gnostické nástroje (mikroskopii, imunohistochemii spolu s tradičními metodami molekulární genetiky). Pomocí této metody byla následně objevena řada nových a klinicky vysoce relevantních typů a podtypů mozkových nádorů, což nakonec v roce 2016 vedlo k vydání zcela nové WHO klasifikace mozkových nádorů primárně založené právě na výsledcích revolučních objevů metylačního profilování. Jednotlivé nádorové jednotky v neuropatologii. Mozkové nádory jsou dnes díky tomu klasifikované na základě korelace klinických, mikroskopických, imunohistochemických, molekulárních a právě metylačních dat, což v konečném důsledku vede k daleko přesnější stratifikaci nemocných a možnosti indikace vhodnější léčby. V posledních letech pak dochází k výzkumu metylačních patternů i u jiných nádorů, přičemž mezi jednoznačně nejpokročilejší oblast se řadí metylační profilování sarkomů, dalších mezenchymálních tumorů a také ně­kte­rých high-grade non-mezenchymálních tumorů, které vstupují do diferenciální dia­gnózy sarkomů, např melanomů. Ačkoliv klasifikace všech mezenchymálních tumorů ještě zdaleka není kompletní, již dnes je v ně­kte­rých případech možné ně­kte­ré její schopnosti využít jako pomůcku v rutinní dia­gnostické praxi i v této části patologie, přičemž mezi nejnadějnější se řadí právě dia­gnostika dediferencovaných (tj. imunohistochemicky negativních) melanomů. Cíl: Cílem našeho sdělení je seznámit klinické lékaře s principem, možnostmi a limitacemi této nové metody a představit naše dosavadní praktické zkušenosti. Závěr: Metylační profilování již dnes poskytuje klinicky vysoce relevantní data pro dia­gnostiku mozkových a v ně­kte­rých případech i mezenchymálních či jiných tumorů. Není pochyb o tom, že v budoucnosti budou jeho schopnosti využity i v dalších oblastech patologie a základní povědomí o této metodě bude proto patřit mezi důležité všeobecné znalosti mnoha klinických lékařů.

VI/ 80. Biobankování v populačních studiích jako součást výzkumné infrastruktury

Klánová J., Piler P., Andrýsková L.

RECETOX, PřF MU Brno

Dlouhodobé populační studie (kohorty) poskytují nenahraditelné informace o vývoji zdravotního stavu sledovaných jedinců v závislosti na přírodním a sociálním prostředí, ve kterém žijí, a na jejich životním stylu. Nové poznatky umožňují lepší porozumění mechanizmům rozvoje chronických onemocnění i faktorům, které jejich rozvoj urychlují, nebo naopak brzdí. Zvláště cenné jsou v tomto ohledu novorozenecké kohorty sledující své účastníky od prenatálního stavu až do dospělosti (a příp. dále). Informace jsou přitom získávány z dotazníkových šetření, lékařských vyšetření i analýz bio­logického materiálu. Vzhledem k tomu, že založení nové populační kohorty je nákladnou a dlouhodobou investicí, je třeba zajistit, aby byla po celou dobu sledování veškerá data i bio­logické materiály správně odebrány, kvalitně uloženy a zpřístupněny pro budoucí analýzy. Biobanka populačních studií CELSPAC byla proto od samého počátku budována jako velká výzkumná infrastruktura otevřeně dostupná mezinárodní vědecké komunitě usilující o multidisciplinární výzkum faktorů expozomu jako determinanty lidského zdraví. Je součástí národní infrastruktury RECEROX RI a nové evropské ESFRI infrastruktury EIRENE_RI propojující 50 výzkumných institucí ze 17 zemí světa (vč. Velké Británie a USA). Je však také budována v synergii s mezinárodní bio­bankovací infrastrukturou BBMRI. Biologický materiál uskladněný v plně automatických skladovacích systémech pochází z populačních, environmentálních, bio­-monitorovacích a klinických studií a je určen pro základní výzkum, ale i k ověřování nových dia­gnostických metod. EIRENE RI se prezentuje jako klíčová evropská výzkumná infrastruktura umožňující rozvoj pokročilých technologií a doplňkových služeb pro charakterizaci komplexních environmentálních expozic a jejich dopadů na zdraví evropské populace. Evropským výzkumným pracovníkům poskytuje fyzický a/ nebo virtuální přístup k harmonizovaným kapacitám, jedinečným službám a komplexním údajům, které řeší současné a budoucí potřeby veřejných orgánů.

VI/ 82. Biobankování v hematoonkologii

Broskevičová L., Trlifajová N., Klepáčová J., Hájek R.

Klinika hematoonkologie LF OU a FN Ostrava

Biobankování znamená proces archivace bio­logického materiálu pro výzkumné účely. V současnosti jsou bio­banky definovány jako sbírky bio­logického materiálu, jakož i souvisejících informací a dat. Tato kombinace z nich činí nepostradatelný nástroj mnoha směrů moderního výzkumu v hematoonkologii, jako jsou např. genomika, precizní medicína či imunomonitoring. Biobanky zároveň chrání důvěrné osobní údaje každé osoby, která souhlasí s poskytnutím bio­logického materiálu. Biobanka ve Fakultní nemocnici Ostrava (FNO) byla založena ve spolupráci s Lékařskou fakultou Ostravské univerzity (LF OU) v roce 2012. Specializuje se na odběr vzorků od pacientů s hematoonkologickými dia­gnózami, zejména monoklonálními gamapatiemi, ale i dalšími, jako jsou lymfomy či

leukemie. V kooperaci s národními a mezinárodními centry probíhá také sběr vzorků raritních onemocnění, především Waldenströmovy makroglobulinemie a AL amyloidózy. Odebraný bio­logický materiál (krev, kostní dřeň, tkáň atd.) se po podepsání informovaného souhlasu zpracovává dle standardních provozních postupů, což zajišťuje vysokou kvalitu vzorků, a tedy i reprodukovatelnost výsledků. Krev se využívá především pro získání plazmy, séra a DNA. Z kostní dřeně jsou dále separovány různé typy buněk dle konkrétní dia­gnózy. Všechny vzorky jsou poté zamrazeny a skladovány v monitorovaných podmínkách. Záznamy o uložených vzorcích jsou vedeny v papírové i elektronické formě a speciálně pro monoklonální gamapatie je navíc vytvořena online databáze. V Biobance FNO bylo ke konci roku 2021 archivováno 57 124 vzorků od 3 342 pacientů (tab. 1). V průběhu fungování se Biobanka zapojila do více než 25 projektů na národní i mezinárodní úrovni.

Zásadní je účast v projektu „iMMunocell“, což je mezinárodní projekt zaměřený na výzkum progrese doutnajícího mnohočetného myelomu do aktivní formy nemoci. Dále probíhá kooperace se zahraniční firmou Vivia Biotech S.L., která se zabývá vývojem individualizovaných strategií pro léčbu hematologických malignit. Dalším významným milníkem je zapojení do „EMN Biobanking project“, který byl iniciován „European Myeloma Network“ a jehož cílem je vytvořit společnou mezinárodní infrastrukturu pro jednotný sběr a skladování bio­logických vzorků u monoklonálních gamapatií. Biobanka funguje také jako centrální laboratoř pro klinické studie České myelomové skupiny. Celkem bylo z Biobanky vydáno k analýzám již téměř 4 000 vzorků, především do projektů Blood Cancer Research Group. Biobanka se za dobu fungování stala nedílnou součástí výzkumné a publikační činnosti Kliniky hematoonkologie LF OU a FNO.

Podpořeno MZ ČR – RVO – FNOs/ 2020.                       

VI/ 83. Zmeny v glykozylácii ako marker onkologických ochorení

Tkáč J., Bertók T.

Glycanostics Bratislava

Glykozylácia je najčastejšia posttranslačná modifikácia proteínov, týkajúca sa väčšiny membránových aj sérových proteínov. Glykány zvyšujú rozpustnosť aj stabilitu glykoproteínov a zúčastňujú sa na bunkovej adhézii či signalizácii. Štruktúra glykánov sa nedá odvodiť od žiadneho templátu a jej zmeny sprevádzajú rôzne patologické procesy, ako sú autoimunitné či onkologické ochorenia [1,2]. Zmeny v glykozylácii sérových IgG (desialylácia a degalaktozylácia) vedie k postupnému odhaľovaniu N-acetylglukozamínových a manózových zvyškov, čo prispieva k aktivácii lektínovej cesty aktivácie komplementu a k rozvoju reumatoidnej artritídy. Sledovanie zmien v glykánovej štruktúre má potenciál odhaliť aj séronegatívnu formu tohto ochorenia, ktorá sa vyznačuje neprítomnosťou RF a anti-CCP markerov v krvi [3]. Kedže analýza glykánov je technicky aj časovo náročná (predkoncentračné a purifikačné kroky, enzymatické uvoľňovanie glykánov) a využíva najčastejšie metódy hmotnostnej spektrometrie, pre analýzu minoritných glykoproteínov izolovaných z reálnych vzoriek môže tento prístup predstavovať problém [4]. Nami vyvinutá technológia umožňuje glykoprofiláciu málo zastúpených onkomarkerov v minimálnom množstve krvného séra in situ (bez uvoľnenia glykánu), vrámci jednoduchého dvojkrokového protokolu na báze magnetických nanočastíc v bežnej ELISA platničke. Táto technológia bola úspešne aplikovaná na skorú dia­gnostiku a monitorovanie účinnosti ochorenia pri karcinómoch prostaty s presnosťou vyššou ako bežne používaný tPSA, fPSA% či PHI test [5].

Literatúra: [1] Tkac J, Bertok T, Hires M et al. Glycomics of prostate cancer: updates. Expert Rev Proteomics 2019; 16(1): 65– 76. doi: 10.1080/ 14789450.2019.1549993. [2] Tkac J, Gajdosova V, Hroncekova S et al. Prostate-specific antigen glycoprofiling as dia­gnostic and prognostic bio­marker of prostate cancer. Interface Focus 2019; 9(2): 20180077. doi: 10.1098/ rsfs.2018.0077. [3] Chocholova E, Bertok T, Jane E et al. Glycomics meets artificial intelligence –potential of glycan analysis for identification of seropositive and seronegative rheumatoid arthritis patients revealed. Clinica Chimica Acta 2018; 481: 49–55. doi: 10.1016/ j.cca.2018.02.031. [4] Trbojević-Akmačić I, Lageveen-Kammeijer GS, Heijs B et al. High-throughput glycomic methods. Chemical Reviews 2022 [in press]. doi: 10.1021/ acs.chemrev.1c01031. [5] Bertok T, Jane E, Bertokova A et al. Validating fPSA glycoprofile as a prostate cancer bio­marker to avoid unnecessary bio­psies and re-bio­psies. Cancers 2020; 12(10): 2988. doi: 10.3390/ cancers12102988.

VI/ 84. Zapojení BBM RU ve vědecko-výzkumných projektech

Stibůrková B.

Revmatologický ústav Praha

Banka bio­logického materiálu Revmatologického ústavu (BBM RU) je organizační součástí Revmatologického ústavu v Praze od roku 2009. BBM RU je součástí oddělení Molekulární bio­logie a imunogenetiky a od roku 2021 se stala součástí konsorcia BBMRI-CZ. Náplní BBM RU je kromě bio­bankingu také aktivní zapojení do vědecko-výzkumných projektů, vč. mezinárodní spolupráce. Obsahem sdělení je shrnutí publikačních výstupů za rok 2021–2022 s významným autorským podílem BBM RU a dedikací BBMRI-CZ (desítka publikací s IF 4,473–7,561) týkající se různých přístupů k analýzám vzniku, progrese, a odpovědi na terapii u autoimunitních a/ nebo revmatologických onemocnění. Jedná se zejména o analýzu pacientů se zánětlivými myopatiemi (studium kardiovaskulárního rizika, vliv pohybové intervence, zhodnocení farmakoterapie), dále analýzu pohybových intervencí u pacientů se systémovou sklerodermií, studium dynamiky IL-40 u pacientů s revmatoidní artritidou, analýzu vlivu mi-RNA v progresi asymptomatické hyperurikemie v klinicky definovanou dnu, funkční charakterizace alelických variant urátových transportérů rizikových pro hyperurikemii/ dnu aj.

VI/ 85. Spolupráce Biobanky Plzeň na onkologickém výzkumu

Karlíková M.1, Topolčan O.1, Kučera R.2, Fiala O.3, Vodička J.4, Třeška V.4, Hora M.5

1 Centrální laboratoř pro imuoanalýzu, LF v Plzni UK, 2 Ústav farmakologie a toxikologie, LF v Plzni UK, 3 Onkologická a radioterapeutická klinika LF v Plzni UK a FN Plzeň, 4 Chirurgická klinika LF v Plzni UK a FN Plzeň, 5 Urologická klinika LF v Plzni UK a FN Plzeň

Východiska: Biobanka Lékařské fakulty v Plzni Univerzity Karlovy funguje od roku 2014, navázala na repozitář tekutých vzorků bio­logického materiálu (nejen) onkologických pacientů spravovaný Oddělením imunochemické dia­gnostiky FN Plzeň. Od té doby se Biobanka v Plzni rozrostla o další prostory a vybavení a modernizovala se v souladu s ČSN/ ISO 20387, novou normou pro bio­bankovnictví. Posláním Biobanky je poskytovat soubory vysoce kvalitních vzorků bio­logického materiálu a souvisejících dat pro bio­medicínský výzkum, který povede ke zlepšení dia­gnostiky, prognostiky či léčby onkologickým pacientů. Cíl: V tomto příspěvku chceme představit několik úspěšných výzkumných studií realizovaných odborníky FN Plzeň /  LF v Plzni UK, kde soubory vzorků Biobanky Plzeň významně přispěly k jejich výsledkům. Jedná se o tyto studie: 1) nalezení algoritmu pro dia­gnostiku karcinomu prostaty za použití sérových bio­markerů a index zdravé prostaty (PHI) a jeho zavedení do praxe [1]; 2) identifikace prognostických bio­markerů plicních metastáz kolorektálního karcinomu [2]; 3) testování markeru PIVKA II pro prognostiku hepatocelulárního karcinomu a jeho zavedení do praxe. Závěr: Biobanka Plzeň na konkrétních příkladech prokázala svoji připravenost a schopnost plnit svoje poslání. V současné době se podílí na dalších výzkumných studiích jak na národní, tak mezinárodní úrovni.

Literatura: [1] Sedláčková H, Dolejšová O, Hora M et al. Prostate cancer dia­gnostic algorithm as a „road map“ from the first stratification of the patient to the final treatment decision. Life (Basel) 2021; 11(4): 324. doi: 10.3390/ life11040324. [2] Vodička J, Fichtl J, Šebek J et al. Outcomes and prognostic factors following surgical treatment of pulmonary metastases from colorectal carcinoma. Anticancer Res 2020; 40(12): 7045–7051. doi: 10.21873/ anticanres.14731.

VI/ 210. Dynamika středního objemu erytrocytů (MCV) jako potenciálního bio­markeru compliance a terapeutické toxicity sunitinibu u onkologických pacientů

Řiháček M.1, Selingerová I.1, Štěrba J.2, Valík D.3, Řiháčková E.4, Kocáková I.5, Kocák I.5

1 Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ Brno, 2 Klinika dětské onkologie LF MU a FN Brno, 3 Ústav laboratorní medicíny, FN Brno, 4 Interní kardiologická klinika LF MU a FN Brno, 5 Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno

Východiska: Sunitinib je tyrozinkinázový inhibitor s širším spektrem molekulárních buněčných cílů. Používá se v 2. linii léčby neresekovatelného a metastazujícího gastrointestinálního stromálního tumoru (GIST) a v 1. linii léčby metastatického karcinomu ledviny. V pediatrické onkologii je použití sunitinibu v režimu off-label a opírá se o rozhodnutí specialisty v dětské onkologii. Bylo zjištěno, že po zahájení léčby sunitinibem dochází u dospělých pacientů k signifikantnímu nárůstu středního objemu erytrocytů (MCV). Naším cílem bylo bližší posouzení dynamiky tohoto jevu, jeho možného vztahu k toxicitě a terapeutickému účinku léčby, a to současně na pediatrické populaci, u níž dosud nebyla k této problematice publikována žádná data. Soubor pacientů a metody: Do retrospektivní studie bylo zařazeno celkem 179 dospělých (MOÚ Brno) a 21 dětských pacientů (Klinika dětské onkologie FN Brno) léčených sunitinibem. Data o průběhu léčby, toxicitě a terapeutickém efektu sunitinibu byla zpětně dohledána v dokumentaci jednotlivých pacientů a následně pro účely práce parametrizována se souhlasem etické komise. Dynamika hodnot parametru MCV v čase byla statisticky hodnocena s využitím regresního modelu softwaru R. Výsledky: Bylo zjištěno, že ve skupině dospělých pacientů dochází k signifikantnímu nárůstu MCV během 21,6 týdne léčby (medián) sunitinibem na hladinu 99,8 fL (medián). V následném časovém úseku dochází ke stabilizaci této hodnoty za předpokladu pokračující léčby sunitinibem. U pacientů, kteří měli evidován ně­kte­rý z hodnocených nežádoucích účinků, docházelo k rychlejšímu nárůstu MCV během léčby než u pacientů bez evidovaných nežádoucích účinků (21,3 vs. 24,6 týdne, p = 0,01). U dětských pacientů byla během léčby sunitinibem pozorována dynamika parametru MCV srovnatelná s dospělou populací. Závěr: Sledování dynamiky MCV u onkologických pacientů lze využít ke sledování léčebné compliance a terapeutickému monitorování léčby. Dle výsledků naší studie může být strmější nárůst tohoto parametru u dospělých pacientů prediktorem výskytu nežádoucích účinků léčby.

VI/ 225. Tekutá bio­psie a její narůstající význam v onkologické dia­gnostice

Pokorná P.

CEITEC, MU Brno

Východiska: S rostoucí incidencí nádorových onemocnění v celosvětovém měřítku a s pokroky v oblasti molekulárního profilování nádorové tkáně přetrvává snaha zlepšovat dia­gnostické postupy a klinický management onkologických pacientů. Jedním ze zásadních témat v této oblasti je rozšíření možností neinvazivní dia­gnostiky a hledání efektivních přístupů k monitorování průběhu onemocnění a léčebné odpovědi. Právě v tomto ohledu je velká pozornost směrována k využití tzv. tekuté bio­psie. Pojmem tekutá bio­psie označujeme odběr vzorku tělních tekutin (krve, mozkomíšního moku, moči aj.) s cílem izolovat a analyzovat cirkulující elementy derivované z nádorové tkáně, jako jsou například cirkulující nádorové buňky či cirkulující nukleové kyseliny. Kromě již zmíněného benefitu neinvazivního odběru a sledování dynamiky vývoje nádorového onemocnění je také vyzdvihován její potenciál lépe postihnout heterogenitu nádorové populace, která nemusí být při analýze tkáňové bio­psie v důsledku provedení odběru jen z jednoho místa plně reflektována. Cíl: V rámci přednášky budou představeny metody používané k analýze tekuté bio­psie se zaměřením zejména na metody sekvenování nové generace a digitální PCR, dále důležité aspekty preanalytické fáze a také stávající limitace tohoto přístupu. Zároveň budou uvedeny vlastní praktické příklady využití tekuté bio­psie v dia­gnostice inoperabilních nádorů centrální nervové soustavy či monitoringu zbytkové choroby u pacientů s histiocytózou z Langerhansových buněk léčených MEK inhibitory. Závěr: Tekutá bio­psie představuje méně invazivní alternativu získání bio­logického materiálu a velmi slibný a postupně se rozšiřující dia­gnostický přístup v onkologii. Širší implementace analýzy tekuté bio­psie má velký význam především u pacientů s inoperabilními nádory a zároveň může mít důležité implikace pro správné nastavení léčebného protokolu, stanovení prognózy či monitorování zbytkové choroby.

VI/ 248. Clinical application of liquid bio­psy

Bořilová S.

Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno

Background: Over the past decade, circulating tumor cells (CTC) and circulating tumor DNA (ctDNA) have received enormous attention. Liquid bio­psy is considered a potential game changer for cancer, as it seeks to provide a real-time and comprehensive snapshot of tumor cell evolution, recurrence, treatment response, and even the presence of minimal residual disease. Purpose: Liquid bio­psies could assess the dia­gnosis, prognosis, and treatment selection, complement current surveilling strategies and monitor disease evolution and treatment response in real-time. Early detection of cancer is one of the prime applications for ctDNA blood tests, which have gained enormous attention. However, despite the enormous advances in ctDNA technologies, it became apparent in recent years that the bio­logy of cancer development seems to be the strongest limitation. After the dia­gnosis of cancer, CTC and ctDNA measurements now provide an opportunity to refine the current staging systems, which may help to better discriminate patients at low or high risk. Furthermore, CTC and ctDNA analyses can contribute to individual real-time monitoring of patients with cancer. Besides PSA monitoring in prostate cancer, there is no blood test that is specific and sensitive enough to detect early relapse before any clinical symptoms or imaging tests. However, the quantitative assessment of the dynamic changes in CTC counts and ctDNA amounts over time can assess a minimal residual disease and early relapse. Present therapy decision-making is often based on the analysis of the primary tumor resected/ bio­psied shortly after the initial dia­gnosis. However, it is well known that natural and therapy-induced evolution of disseminated tumor cells requires bio­psies of metastatic lesions. Even if one metastatic lesion can be bio­psied, substantial genetic heterogeneity of metastatic lesions can be present in the same patient. Taken together, these arguments have greatly stimulated the use of CTCs and ctDNA for the identification of therapy targets and resistance mechanisms in patients with advanced cancer. Conclusion: To date, liquid bio­psy has been successfully used in patients affected by melanoma as well as breast, colorectal, and lung cancer. Thus, it is reasonable to suppose that, once methodological procedures will be standardized and harmonized across laboratories, liquid bio­psy-based evaluations will be even more used in routine  settings.

VI/ 307. Radiační ochrana na nukleární medicíně aneb „nebojte se nás!“

Rossi T., Čepeláková Š.

1 Oddělení nukleární medicíny, MOÚ Brno

Hlavním cílem radiační ochrany je zcela vyloučit deterministické účinky ionizačního záření a omezit pravděpodobnost vzniku stochastických účinků na míru přijatelnou pro jednotlivce a společnost. Deterministické účinky jsou ty, jejichž závažnost roste s dávkou ionizujícího záření. Stochastické jsou účinky vyvolané mutacemi a nezávisí na dávce záření. Práce s otevřenými zářiči na odděleních nukleární medicíny je specifická a je spojena jak s rizikem vnějšího ozáření, tak s rizikem vnitřní kontaminace. Je tedy nutné dodržovat zásady ochrany před zářením, tj. ochrana časem, vzdáleností a stíněním, a zároveň provádět opatření zabraňující kontaminaci pracovníků i pacientů, jako je nošení osobních ochranných pomůcek a pracovních oděvů, používání stínicích ochranných obalů při manipulaci se zdrojem ionizujícího záření, pravidelná monitorace či dekontaminace pracovních prostor. Velmi důležitá je osobní dozimetrie pracovníků ve správných intervalech. V prezentaci srovnáme dávky záření obsažené při vyšetřeních na oddělení nukleární medicíny s dávkami z jiných dia­gnostických a terapeutických metod. Nabídneme shrnutí toho, jakou dávku člověk obdrží například při letu na dovolenou z Prahy do New Yorku ve srovnání s naším vyšetřením a jiné. Dále třeba graf rozdělení dávek ionizujícího záření obyvatelstvu a jeho zdroje. Ukážeme, jak vypadá v praxi vyšetření na nukleární medicíně. Chceme vyvrátit ně­kte­ré mýty, které si s sebou toto oddělení nese, a ukázat, že záření nemusí být jen strašák, ale i velký  pomocník.

VI/ 308. ⁶⁸Ga-DOTA-TOC – dva roky zkušeností

Slezáková H., Kučera R., Ďulíková Z.

Oddělení nukleární medicíny, MOÚ Brno

Pozitronová emisní tomografie (PET) je moderní a v mnoha směrech nepostradatelná metoda nukleární medicíny. Hnací silou metody PET je [18F]-fluorodeoxyglukóza (FDG), díky níž je možno v těle identifikovat místa s nepřirozeně zvýšenou, či naopak sníženou metabolickou aktivitou. FDG trpí určitou nespecifičností – zvýšený příjem vykazují také např. místa s probíhajícím zánětlivým procesem. Proto byla za posledních 20 let vyvíjena jiná, specifičtější radiofarmaka. Nejvýraznějším novým prvkem na poli PET dia­gnostiky je galium- 68 (⁶⁸Ga). Pravděpodobně nejvýznamnější aplikace je v tomto ohledu značení somatostatinových analogů – v PET obdobě dlouho využívaného OctreoScanu (SPECT varianta vyšetření s ¹¹¹In) pro dia­gnostiku somatostatin-pozitivních neuroendokrinních nádorů. Značených peptidů s ⁶⁸Ga je několik typů. Pro zobrazení neuroendokrinních nádorů se využívá zejména radiofarmakum ⁶⁸Ga-DOTA-TOC. Pro dia­gnostiku neuroendokrinních tumorů bylo dlouhou dobu standardem vyšetření pomocí somatostatinových receptorů značených ¹¹¹In. Nevýhody tohoto vyšetření (¹¹¹In-OctreoScan) jsou: 1) dlouhá akumulační doba s nutností 2–3denního vyšetření; 2) relativně vyšší radiační zátěž pro pacienta i jeho okolí související s delším poločasem rozpadu použitého india; 3) horší prostorové rozlišení v souvislosti s použitou technologií SPECT a použitým radiofarmakem. Oddělení nukleární medicíny v MOÚ Brno bylo prvním pracovištěm v ČR, kde bylo pacientovi aplikováno ⁶⁸Ga-DOTA-TOC. První vyšetření bylo provedeno 26. 6. 2019. Od července 2019 provádíme na PET/ CT pomocí ⁶⁸Ga-DOTA-TOC průměrně osm vyšetření měsíčně. Závěr: ⁶⁸Ga-DOTA-TOC PET/ CT vyšetření má oproti scintigrafii ¹¹¹In-pentetreotidem (OctreoScan) vyšší senzitivitu (96 vs. 86 %) a výrazně vyšší specificitu (93 vs. 50 %). Je proto logické, že dnes je toto vyšetření u pacientů s neuroendokrinními nádory považováno za metodu volby k dia­gnostice, lokalizaci a sledování pacientů. Dalším využitím izotopu ⁶⁸Ga je v poslední době radiofarmakum ⁶⁸Ga-PSMA, které slouží k dia­gnostickému zobrazení karcinomu prostaty a zlepšuje i dia­gnostiku jeho metastáz.

VI/ 316. Principy interpretace laboratorních testů

Jabor A., Franeková J.

Pracoviště laboratorních metod, 3. LF UK a IKEM Praha

Východiska: Racionální indikace laboratorních vyšetření tvoří základní stavební kameny pro jejich interpretaci, ale vlastní interpretace výsledky jednotlivých vyšetření spojuje do informační hodnoty s využitím při medicínských aktivitách. Interpretace je proces vycházející z více konceptů s podílem erudice a zkušenosti. Materiál a metody: Popis významu základních konceptů pro interpretaci. Výsledky: 1) Referenční intervaly jsou vztaženy k fyziologii a představují základní „ukotvení“ hodnot výsledků. 2) Rozhodovací (cut-off) meze charakterizují klinické využití testu. 3) Poločas eliminace (enzymy, proteiny, nádorové markery, léky a další) má vztah k frekvenci monitorování a hodnocení kinetiky bio­markeru. 4) Biologická variabilita je rozhodující pro výběr analytické metody, způsob použití testu a základní interpretaci. 5) Z analytické a intraindividuální bio­logické variability je odvozena kritická diference (reference change value) jako základní koncept interpretace změn po sobě jdoucích výsledků. 6) Senzitivita a specifičnost testu charakterizují vlastnost testu při jeho použití v definované populaci. 7) Prediktivní hodnota pozitivního (nebo negativního) výsledku testu ukazuje pravděpodobnost klinického stavu při určitém výsledku u konkrétního nemocného. 8) Analýza velkých dat (big data) z regionálních nebo mezinárodních databází umožňuje větší výtěžnost testů díky robustnějším datům o chování testů u různých kohort, za zvláštních podmínek použití, o vazbách mezi testy, o vztahu k patofyziologii, terapii a outcome pacientů. 9) Všechny předchozí koncepty vyžadují harmonizaci analytických postupů, ideálně na celosvětové úrovni. Závěr: Interpretace laboratorních testů je strukturovaný proces využívající řadu exaktních postupů (externí data a důkazy získané prostřednictvím analytiky a statistiky) s vazbou na patofyziologické procesy (individualizace), které při správném použití zásadně přispějí k dia­gnostickému a léčebnému procesu konkrétního pacienta.

VI/ 317. Interference při imunochemických stanoveních

Racek J.

Ústav klinické biochemie a hematologie FN Plzeň

Východiska: Imunochemické reakce se užívají ke stanovení antigenů a protilátek vč. autoprotilátek. Jsou rychlé, dají se automatizovat, obvykle nevyžadují úpravu bio­logického materiálu. Musíme však počítat s četnými analytickými úskalími; patří mezi ně tzv. hook efekt či zkřížená reaktivita, ale i další vlivy, které ilustrují následující čtyři kazuistiky. Popis případů: Přítomnost heterofilních protilátek (v tomto případě proti myším antigenům) vedla k falešně vysoké hladině hCG u 45leté nemocné. Před rozpoznáním interference podstoupila 2× revizi dutiny děložní a laparoskopii, uvažovalo se i o podání metotrexátu. Jsou probrány možnosti, jak tento stav včas rozpoznat; že se nejedná o vzácný nález, svědčí i v literatuře užívaný název Phantom hCG. U 86letého nemocného vedly perzistující vysoké hladiny digoxinu k jeho vysazení. Byly však způsobeny přítomností tzv. digoxin-like immunoreactive substances, nikoli předávkováním lékem. U 58leté nemocné s bolestí na hrudi a nejasným EKG obrazem byla pro vysokou koncentraci hs-cTnI indikována koronarografie; nebyla nalezena významná stenóza věnčitých tepen. Pro normální hladinu hs-cTnT bylo vysloveno podezření na přítomnost makro-cTnI, která byla potvrzena gelovou filtrací. Čtyřiašedesátiletý nemocný byl vyšetřován pro patologické koncentrace hormonů štítné žlázy (vysoké FT4 a FT3, nízký TSH). Přestože neměl klinické známky onemocnění štítné žlázy, byl pro podezření na primární hyperthyreózu postupně léčen dvěma thyreostatiky; nedošlo však k úpravě laboratorních hodnot, ale objevily se klinické známky hypothyreózy. Dodatečně bylo zjištěno, že nemocný užíval na sclerosis multiplex velké dávky bio­tinu; protože imunochemické stanovení thyroidálních hormonů bylo založeno na vazbě streptavidin-bio­tin, vedl přívod bio­tinu k falešně vysoké hodnotě FT4 a FT3 (kompetitivní metoda) a falešně nízké hodnotě TSH (sendvičová metoda). Po vysazení bio­tinu byly hladiny thyroidálních hormonů normální. Závěr: Při interpretaci imunochemických metod se mohou objevit nečekané problémy, které vedou ke špatné dia­gnóze, nevhodnému zákroku či léčbě, nebo naopak k jejímu opomenutí. Příčinou může být přítomnost heterofilních protilátek, makroproteinů nebo přívod bio­tinu u metod využívajících vazbu streptavidin-bio­tin. Pro odhalení možných interferencí musíme o této možnosti vědět a znát principy imunochemických metod.

VI/ 318. Pseudohyperkalemie

Šálek T.

Oddělení klinické bio­chemie, Krajská nemocnice T. Bati a. s., Zlín

Východiska: Fyziologicky je koncentrace draslíku v séru asi o 0,3 mmol/ l vyšší než v plazmě. Důvodem je uvolnění draslíku z trombocytů při srážení krve. Tento rozdíl může být větší při trombocytóze a/ nebo leukocytóze. Metody: Při podezření na pseudohyperkalemii v séru se provádí měření draslíku v plné krvi na acidobazickém analyzátoru nebo v lithium-heparinové plazmě po centrifugaci. Pseudohyperkalemie může být zvažována, když je rozdíl mezi koncentrací draslíku v séru a plazmě alespoň 0,4 mmol/ l. Někteří autoři z praktických důvodů doporučují, aby tento rozdíl byl alespoň 1,0 mmol/ l. Výsledky: Příklad kazuistiky pacienta s myeloproliferativním onemocněním a trombocytózou ukazuje rozdíl mezi koncentrací draslíku v plné krvi a v séru 2,9 mmol/ l. Obecným řešením suspektní pseudohyperkalemie v séru je vydávání výsledku společně s interpretačním komentářem, který doporučuje stanovení draslíku v plné krvi na acidobazickém analyzátoru. Závěr: Léčba pseudohyperkalemie by mohla vést k hypokalemii, čímž můžeme u pacienta vyvolat vážný, život ohrožující stav. Je proto vhodné, aby měla klinická bio­chemie vypracovaný algoritmus k reportování výsledků se suspektní pseudohyperkalemií.

VI/ 320. MikroRNA jako inovativní bio­markery v dia­gnostice solidních nádorů

Slabý O.1,2

1 CEITEC, MU Brno, 2 Lékařská fakulta, MU Brno

Východiska: MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující RNA dlouhé 18–25 nukleotidů, které posttranskripčně regulují genovou expresi v průběhu rozličných buněčných procesů, jako jsou apoptóza nebo diferenciace, ale i maligní transformace. Změny v expresních profilech miRNA již byly pozorovány u většiny solidních nádorů. Mechanistické studie v nádorové buňce prokázaly schopnost jednotlivých miRNA vykazovat funkci nádorových supresorů a onkogenů. Nejnovější pozorování navíc popisují potenciál jedné miRNA vykazovat v závislosti na kontextu jak funkci nádorového supresoru, tak onkogenu. Tato pozorování zásadním způsobem rozšířila koncept molekulární patogeneze nádorových onemocnění a naznačila potenciál miRNA nejen jako dia­gnostických bio­markerů, ale také jako potenciálních terapeutických cílů. Cíl: Sdělení zahrnuje novinky z oblasti bio­geneze a funkce miRNA, izomiRs, koncept kompetujících endogenních RNA (ceRNAs), význam miRNA v nádorové bio­logii a jejich zapojení do hlavních znaků maligního nádoru, bio­logie nádorové kmenové buňky či autofagie. V kontextu našich výsledků bude diskutována schopnost vybraných miRNA sloužit jako tkáňové bio­markery (prognostické a prediktivní), sérové a močové bio­markery (dia­gnostické) a potenciální terapeutické cíle u kolorektálního karcinomu, renálního karcinomu a glioblastomu. Závěr: Specifické expresní profily miRNA byly u pacientů se solidními nádory úspěšně využity ke stanovení prognózy, k predikci léčebné odpovědi na vybrané terapeutické režimy nebo k upřesnění dia­gnostiky u metastáz neznámého původu. Přítomnost miRNA byla prokázána v krevním séru a plazmě, ale také v moči nebo mozkomíšním moku, kde vykazovaly nejen vysokou míru stability, ale u vybraných solidních nádorů rovněž velice dobré analytické vlastnosti. V současné době je kromě možného dia­gnostického využití cirkulujících miRNA intenzivně studován jejich původ a příčiny jejich extrémně vysoké stability. MiRNA jsou také velice slibnými terapeutickými cíli, přičemž první protinádorová terapie na bázi miRNA vstupuje do klinického hodnocení začátkem  příštího roku.

VI/ 321. Stanovení lipidomického profilu jako nového bio­markeru u nádorů  slinivky břišní

Holčapek M., Wolrab D., Peterka O., Jirásko R., Chocholoušková M.

Katedra analytické chemie, Univerzita Pardubice

Lipidomika patří mezi nejrychleji se rozvíjející omické přístupy v současnosti. Změny v koncentracích různých lipidů v tkáních či tělních tekutinách doprovázejí řadu závažných onemocnění vč. rakoviny, a proto má lipidomická analýza velký potenciál při dia­gnostice těchto nemocí. Hmotnostní spektrometrie je klíčovou technikou pro kvalitativní a kvantitativní analýzu lipidů [1], ať už ve spojení se separačními technikami (kapalinová chromatografie nebo superkritická fluidní chromatografie [2]), nebo samostatně s využitím přímé infuze vzorku v toku kapaliny do iontového zdroje nebo s použitím ionizace MALDI [3]. Rozsáhlá studie lipidomické analýzy krevního séra pacientů s karcinomem slinivky břišní (Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC) a zdravých kontrol pro více než 800 vzorků [4] prokázala, že lipidomický profil pacientů s PDAC vykazuje statisticky významné rozdíly oproti kontrolám, což umožňuje jejich rozlišení, jak bylo ověřeno měřeními na 3 nezávislých pracovištích v ČR, Německu a Singapuru s 5 různými analytickými metodami založenými na hmotnostní spektrometrii. Vyhodnocení analytických dat se provádí pomocí našeho softwaru LipidQuant 1.0, který je volně dostupný [5]. Na základě stanovení koncentrací pro cca 200–400 různých lipidů byly s využitím vícerozměrné statistické analýzy (analýza hlavních komponent nebo metoda nejmenších čtverců) vypracovány statistické modely, které umožní rozlišit skupiny pacientů od zdravých dobrovolníků se správností, selektivitou a specificitou vyšší než 90 %, což platí jak pro datové soubory se známou klasifikací pro tvorbu statistických modelů, tak i pro validační soubory se zaslepenou klasifikací. Mezi nejvíce dysregulované lipidy patří velmi dlouhé ceramidy a sfingomyeliny s jednou dvojnou vazbu a ně­kte­ré další fosfolipidy a sfingolipidy. Podobné typy dysregulací jsou pozorovány i u dalších typů nádorových onemocnění, jako např. karcinom ledvin, prsu nebo prostaty [6]. Dalším krokem bude klinická validace v prospektivní studii osob se zvýšeným rizikem karcinomu slinivky břišní a následně převedení metodiky do klinické praxe s cílem zavedení nové metodiky pro neinvazivní screening karcinomu slinivky u osob se zvýšeným rizikem.

Tato práce je podpořena grantovým projektem č. NU21-03-00499 od Agentury pro zdravotnický výzkum České republiky.

Literatura: [1] Holčapek M, Liebisch G, Ekroos K. Lipidomic analysis. Anal Chem2018; 90(7): 4249–4257. doi: 10.1021/ acs.analchem.7b05395. [2] Wolrab D, Chocholoušková M, Jirásko R et al. Validation of lipidomic analysis of human plasma and serum by supercritical fluid chromatography-mass spectrometry and hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 412(10): 2375–2388. doi: 10.1007/ s00216-020-02473-3. [3] Jirásko R, Holčapek M, Khalikova M et al. MALDI orbitrap mass spectrometry profiling of dysregulated sulfoglycosphingolipids in renal cell carcinoma tissue. J Amer Mass Spectrom Soc 2017; 28(8): 1562–1574. doi: 10.1007/ s13361-017-1644-9. [4] Wolrab D, Jirásko R, Cífková E et al. Lipidomic profiling of human serum enables detection of pancreatic cancer. Nat Commun 2022; 13(1): 124. doi: 10.1038/ s41467-021-27765-9. [5] Wolrab D, Cífková E, Čáň P et al. LipidQuant 1.0: automated data processing in lipid class separation mass spectrometry quantitative workflows. Bioinformatics 2021; 37(23): 4591. [6] Wolrab D, Jirásko R, Peterka O et al. Plasma lipidomic profiles of kidney, breast and prostate cancer patients different from healthy controls. Sci Rep 2022; 11(1): 20322. doi: 10.1038/ s41598-021- 99586-1.

VI/ 322. Využití membránových a intracelulárních bio­markerů nádorových buněk  v průtokové cytometrii

Řiháček M., Wagnerová A., Lazecká V., Koštovalová L., Čermáková Z.

Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ Brno

Dia­gnostika krevních buněčných populací v moderní hematologické laboratoři se již prakticky neobejde bez průtokové cytometrie využívající značených protilátek proti specifickým povrchovým strukturám buněčných populací. Indikacemi k provedení průtokové cytometrie je zejména podezření na hematoonkologické onemocnění a provádí se primárně z krve a aspirátu kostní dřeně. Její vysoká citlivost, reprodukovatelnost a preciznost je nepostradatelná nejen v dia­gnostice, ale i v monitorování léčebné odpovědi a reziduální choroby. Hematopoetické krevní buňky leukocytární řady, které na svém povrchu nesou s různou intenzitou exprimovaný antigen CD45, jsou hlavním zájmem většiny rutinně prováděných cytometrických metod v klinických laboratořích. Mimo periferní krev, např. v kostní dřeni nebo tělních tekutinách, se však vyskytují četné CD45 negativní elementy, jejichž frakce nebývá komplexněji došetřována. V onkologické dia­gnostice má tato frakce zásadní význam, protože právě mezi CD45 negativními elementy můžeme prokázat případné elementy většiny solidních malignit. Na Oddělení laboratorní medicíny MOÚ se v současné době intenzivně věnujeme optimalizaci a nastavení flowcytometrické metody k diferenciaci jednotlivých frakcí CD45 negativních elementů. Naším cílem je vytvoření rychlé, klinicky implementovatelné a pro kliniky snadno dostupné alternativy analýzy tělních tekutin či kostní dřeně na přítomnost maligních buněk, komplementární k časově i personálně náročnému cytologickému vyšetření.

VI/ 325. Význam laboratorních vyšetření v diferenciální dia­gnostice kostních lézí

Gescheidtová L.

Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ Brno

Východiska: Patologické fraktury jsou zlomeniny vzniklé při minimálním traumatu či běžném zatížení. Patří mezi stavy vedoucí k imobilizaci a často i invalidizaci pacienta, ztrátě soběstačnosti, bolestivosti a výraznému snížení kvality života. Vznik patologické fraktury je však pouze manifestací jiného závažného chorobného procesu a mnohdy prvním příznakem tohoto onemocnění. Příčinou kostní léze může být: 1) primární kostní nádor; 2) metastáza solidního zhoubného nádoru; 3) hematoonkologické onemocnění; 4) osteoporóza; 5) jiné metabolické kostní onemocnění. Osteoporóza je metabolické onemocnění, které má s onkologií značnou spojitost. Jednak může být důsledkem paraneoplastické hormonální produkce, která vede k úbytku kostní hmoty (ACTH, parathormon (PTH) či PTH-related peptid), jednak se může jednat o nežádoucí účinek protinádorové léčby. Popis případů: Zde předkládáme 3 kazuistiky, které zastupují 3 odlišná kostní onemocnění. 1. případ: Pacientka s karcinomem plic a patologickou frakturou obratle. U pacientky byla v rámci vertebroplastiky provedena bio­psie z kostní léze, která neprokázala přítomnost nádorových buněk. Byla doplněna denzitometrie s výsledkem výrazného kostního úbytku v pásmu osteoporózy (T skóre -3,4). Laboratorně byla přítomna těžká karence vitaminu D (25-hydroxy vitamin D 11,7 nmol/ l, norma > 75 nmol/ l). Vzhledem k dia­gnóze plicního karcinomu lze uvažovat i paraneoplastickou etiologii osteoporózy. 2. případ: Pacientka s atypickou frakturou distální části femuru. Histologicky byla zjištěna metastáza mammárního origa, kdy fraktura byla první manifestací tohoto onemocnění. Laboratorně byly zvýšeny markery kostního obratu, normální hodnoty kalcia (Ca) a fosfátů (P). 3. případ: Kazuistika se týká pacientky s remisí nádoru prsu, u které byla při scintigrafii skeletu nalezena ložiska patologicky zvýšené metabolické aktivity v kalvě. V diferenciální dia­gnostice přicházel v úvahu metastatický relaps nádoru. Bylo doplněno CT vyšetření se závěrem vcelku typického obrazu morbus Paget. Laboratorně byla přítomna výrazně zvýšená aktivita alkalické fosfatázy (ALP, 6,6 μkat/ l, norma ≤ 0,7 μkat/ l), zvýšené markery jak kostní výstavby (P1NP), tak resorpce (CrossLaps), normální Ca a P. Tento laboratorní nález je pro morbus Paget typický. Závěr: Laboratorní metody spojené s metabolizmem kostí zahrnují stanovení Ca, P, 25-hydroxyvitamin D, PTH, ALP, P1NP, CrossLaps. V rámci širší dia­gnostiky osteoporózy je dále nutné vyšetřit iontogram, jaterní a renální soubor, hormony štítné žlázy, kortizol a provést screening monoklonální gamapatie. Pro samotnou dia­gnózu má nezastupitelnou úlohu bio­ptické vyšetření.

VI/ 327. Nádorové markery v dia­gnostice onkologických onemocnění – kazuistika

Kyselák O.

Oddělení klinické bio­chemie, FN u sv. Anny Brno

Východiska: Většina nádorových markerů má poměrně nízkou dia­gnostickou senzitivitu i specificitu. Jejich vyšetřování pro rutinní screening onkologických onemocnění proto není vhodné; primárně jsou určeny pro sledování průběhu onemocnění a efektu terapie. Případ: 56letá doposud zcela zdravá pacientka byla odeslána v roce 2017 do ambulance Oddělení klinické bio­chemie FN u sv. Anny v Brně pro dyslipidemii. Udávala ale pocit tlaku v břiše, návratu soust do jícnu a progredující dyspeptické potíže charakteru zvracení. Na UZ břicha byly pouze parapelvické cysty levé ledviny. Kromě mírné dyslipidemie byl laboratorní nález v normě, stejně tak i hodnoty vyšetřených nádorových markerů. Pacientka byla odeslána k provedení gastrofibroskopie, kde byla prokázána okrouhlá stenóza kardie, těsně průchodná pro endoskop. CT jícnu a žaludku a endosonografie horního zažívacího traktu následně prokázaly přítomnost tumorózní infiltrace kardie s lymfatickými uzlinami v okolí, avšak bez disseminace procesu. Histopatologicky šlo o nízce diferencovaný adenokarcinom gastroezofageální junkce. Pacientka podstoupila gastrektomii s našitím ezofagojejunální anastomózy a dvě navazující série adjuvantní chemoterapie (režim FUFA Mayo). Protože onemocnění bylo komplikováno malnutricí a kachexií (54 kg v době stanovení dia­gnózy vs. 39 kg při kontrole po léčbě), nebyla provedena původně plánovaná adjuvantní radioterapie. Před provedením gastrektomie (tedy přibližně 1 měsíc po prvním vyšetření v naší ambulanci) byla zjištěna pouze hraniční elevace CA 72-4, při laboratorním vyšetření po léčbě byly všechny vyšetřované nádorové markery opět v referenčních mezích. Pacientka je t. č. sledována v onkologické ambulanci FN u sv. Anny v Brně, doposud bez recidivy onemocnění. Závěr: Dia­gnostika onkologických onemocnění vyžaduje komplexní přístup. Nádorové markery zde mají spíše pomocnou roli a jejich fyziologické hodnoty nevylučují přítomnost nádoru. Ta se může projevit i změnami v běžných laboratorních parametrech (často se pak jedná o náhodný nález). Dia­gnostika se proto musí opírat především o anamnézu, klinické vyšetření a využití zobrazovacích metod.

VI/ 328. Racionální indikace vyšetření krevního obrazu aneb jak nepřehlédnout leukemii v každodenní praxi

Vytisková S.1, Mottlová V.2, Bourková L.3, Kamelander J.3, Kissová J.3, Penka M.3

1 Oddělení klinických laboratoří, Vojenská nemocnice Brno, 2 Interní oddělení, Vojenská nemocnice Brno, 3 Oddělení klinické hematologie, FN Brno

Vyšetření krevního obrazu (KO) je základním vyšetřením nejen v hematologii, ale patří mezi nejpožadovanější laboratorní vyšetření napříč všemi odbornostmi, včetně praktických lékařů, internistů, chirurgů a lékařů dalších oborů. KO je základní vyšetření, které se provádí v rámci preventivních prohlídek, to platí i v Armádě ČR. I když se jedná o nejčastější laboratorní vyšetření vůbec, interpretace jeho výsledků nemusí být úplně snadná a má svá úskalí. Tato práce si klade za cíl na příkladu několika kazuistik ukázat, jak zásadní je vyšetřovat i v rámci preventivních prohlídek KO společně s diferenciálním počtem leukocytů (DIFF). Pokud je totiž požadován a vyšetřen pouze prostý KO, tak i nejvyšší třídy analyzátorů nemusí vydat suspektní hlášení na přítomnost patologické populace leukocytů, která může být ve vzorku přítomna. Při hematoonkologických onemocněních je obvykle vstupně v KO přítomna trombocytopenie, anemie a patologie (početní či morfologická) v populaci leukocytární a tyto výrazné změny jsme schopni v laboratoři správně interpretovat a postupovat tak, aby nedošlo k prodlení v dia­gnostice a následné léčbě závažného stavu. Nicméně výrazné změny v KO nemusí být přítomny ve všech případech hematoonkologických onemocnění a vyšetření prostého KO bez DIFF je pak k jejich dia­gnostice nedostačující. Nejen první kazuistika příslušnice Armády ČR, které byl v rámci pravidelné pracovnělékařské preventivní kontroly u posádkového lékaře vyšetřen KO + DIFF, nám ukáže význam vyšetření diferenciálního počtu leukocytů. Nemocná byla v době odběru zcela bezpříznaková. Z prostého KO (tab. 1) byla patrná pouze makrocytární anemie, která by jistě za běžných okolností nevyžadovala urgentní léčebný přístup. Díky vyšetření diferenciálního počtu leukocytů, který dovolí hematologickému analyzátoru lépe identifikovat jednotlivé subpopulace leukocytů, jsme u této pacientky zaznamenali absolutní i relativní neutropenii, relativní lymfocytózu a suspektní hlášení na přítomnost blastů (tab. 2). V přesně definovaných případech, kam spadá i hlášení BLAST, vždy provádíme mikroskopickou kontrolu vzorku. Jaké bylo naše překvapení, když jsme v periferní krvi nalezli myeloblasty s Auerovými tyčemi (obr. 1). Tento nález vždy znamená hemoblastózu, v tomto případě akutní myeloidní leukemii. I díky časné dia­gnóze a předání na specializované pracoviště je v současnosti tato pacientka již 2 roky v kompletní remisi. Díky vyšetření diferenciálního počtu leukocytů a přesně definovaným postupům při vyšetření KO + DIFF, jež uvedu v přednášce, jsme schopni odhalit závažná hematoonkologická onemocnění  dříve.

VI/ 330. Jak zlepšit preanalytickou fázi laboratorního vyšetření

Juránková L., Wagnerová A.

Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ Brno

Výsledky laboratorního vyšetření jsou nedílnou součástí péče o pacienta a využívají se např. pro stanovení dia­gnózy, určení tíže onemocnění nebo pro monitorování léčby, určení prognózy či progrese choroby. Laboratorní dia­gnostický proces zahrnuje preanalytickou, analytickou a postanalytickou fázi. K ovlivnění výsledku laboratorního vyšetření může dojít ve všech třech fázích. Zdaleka nejdůležitější z hlediska možného ovlivnění výsledků laboratorního vyšetření je fáze preanalytická. Cílem našeho sdělení je přiblížit význam preanalytické fáze laboratorního vyšetření a zaměřit se na možné vlivy a chyby, ke kterým v této fázi nejčastěji dochází, a jak mohou působit na výsledek laboratorního vyšetření.

VI/ 369. Využití sekvenování nové generace v dia­gnostice nádorových onemocnění, porovnání výsledků u dětských a dospělých pacientů

Krsková L.1, Šípalová B.1, Strnadová M.1, Zápotocký M.2, Sumerauer D.2, Kopečková K.3, Linke Z.3, Balko J.1, Zámečník J.1

1 Ústav patologie a molekulární medicíny, 2. LF UK a FN Motol Praha, 2 Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol Praha,  3 Onkologická klinika 2. LF UK a FN Motol Praha

Východiska: Molekulární patologie je obor, který doplňuje a upřesňuje morfologickou dia­gnostiku detekcí specifických molekulárních změn, jež charakterizují danou onkologickou dia­gnózu. Zavedení masivního paralelního sekvenování (NGS) umožnilo obrovský rozvoj v oblasti personalizované medicíny. NGS je na rozdíl od klasické Sangerovy sekvenační metody schopno sekvenovat tisíce až miliony rozdílných molekul DNA či cDNA (komplementární DNA převedená z RNA) najednou, během jednoho sekvenačního běhu. NGS technologie nachází využití v rámci prediktivního testování (detekce molekulárních změn pro cílenou terapii), napomáhá v dia­gnostice nádorových onemocnění, určení prognózy apod. Materiál a metody: Od roku 2019 jsme v Laboratoři molekulární patologie prospektivně vyšetřili 100 vzorků nádorů dětských pacientů a 141 vzorků dospělých pacientů pomocí NGS panelů (Archer FusionPlex) (většinou indikováno patologem, popř. onkologem). Od září roku 2021 se pak díky úhradě pojišťoven zavedlo tzv. prediktivní testování za účelem nalézt terapeutický cíl. Výsledky: V analýze jsme se zaměřili na zhodnocení dia­gnostických NGS s ohledem na dia­gnostický, popř. terapeutický přínos vyšetření. Ve skupině dětských pacientů (n = 100) jsme alteraci nalezli u 62 % pacientů, z čehož fúzní gen u 43 %. Změny, které mají dia­gnostický dopad, jsme nalezli u 49,5 % pacientů, potenciálně cílitelných změn bylo 33 %. Ve skupině dospělých pacientů (n = 141) jsme alteraci nalezli u 37,5 %, fúzní geny byly detekovány u 23 %. Změny, které mají dia­gnostický dopad, jsme nalezli u 25,5 % pacientů, potenciálně cílitelných změn bylo detekováno 10 %. Závěr: Z výsledků je patrné, že vyšetření pomocí NGS může výrazně přispět k upřesnění morfologické dia­gnózy a u části pacientů zároveň v případě potřeby nalézt cíl pro případnou cílenou  terapii.

VI/ 372. Elektrochemie nukleových kyselin v molekulární onkologii

Bartošík M.1, Moráňová L.1, Izadi N.1, Sebuyoya R.1, Anton M.2, Hrstka R.1

1 RECAMO, MOÚ Brno, 2 Gynekologicko-porodnická klinika LF MU a FN Brno

Elektrochemická detekce nukleových kyselin, tj. DNA a RNA, je perspektivním analytickým nástrojem pro stanovení těchto bio­makromolekul jakožto důležitých nádorových bio­markerů. Hlavní výhody elektrochemie jsou nízké pořizovací náklady, rychlost, jednoduchost, nízká spotřeba vzorků a možnost miniaturizace, a je tak vhodná pro personalizovanou decentralizovanou medicínu 21. století. Technologický pokrok v miniaturizaci, elektrodových čipech, nanomateriálech i nových amplifikačních technikách (zejména izotermálních technikách typu LAMP, RCA nebo RPA) vedl k rozmachu elektrochemických bio­senzorů a lab-on-the-chip platforem pro stanovení velkého množství DNA a RNA bio­markerů. Nejčastěji studovanými bio­markery jsou krátké nekódující RNA (tzv. mikroRNA), metylace DNA, bodové mutace v DNA (zejména u genů KRAS a BRAF) a rovněž onkoviry, např. lidský papilomavirus (HPV). Elektrochemie by tak mohla být zajímavou alternativou v současné molekulární dia­gnostice nádorových onemocnění.

Práce byla podpořena grantovými projekty AZV NU21-08-00057, AZV NU21-08-00078, BBMRI-CZ no. LM2018125 a MZ ČR - RVO (MOÚ, 00209805).

VI/ 373. Využitie bio­senzora na báze aptamérov pre detekciu chronickej myeloidnej leukémie

Domšicová M.1, Kyca T.1, Poturnayová A.1, Bábelová A.2, Šelc M.2, Jakič K.2, Némethová V.3, Rázga F.3

1 Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky, Centrum Biovied SAV, Bratislava, Slovenská Republika, 2 Ústav experimentálnej onkológie, Biomedicínske centrum SAV, Bratislava, Slovenská republika, 3 Lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava, Slovenská republika

Východiská: Z dôvodu vysokej prevalencie a mortality v ľudskej populácii patria onkologické ochorenia medzi najviac študované. Chronická myeloidná leukémia patrí medzi formy rakoviny, ktorá postihuje biele krvinky u prevažne dospelej populácie a tvorí asi 15–20 % všetkých leukemických ochorení. Klinická dia­gnostika leukemických ochorení vyžaduje časovo náročné a pre pacienta bolestivé zákroky, a preto sa zvyšuje potreba výskumu špecifických, rapídnych a neinvazívnych dia­gnostických metód. Materiál a metódy: V predkladanej práci sme použili aptasenzor, spojenie DNA aptaméru T2-KK1B10 s bio­senzorom, ktorý je schopný rozpoznávať bunkovú líniu K562 – model chronickej myeloidnej leukémie [1]. Interakcie medzi aptamérom a bunkovou líniou boli zaznamenávané v reálnom čase citlivou metódou kremenných mikrováh. Špecifickosť aptaméru voči bunkovej línii sme dokázali sledovaním interakcií s kontrolnou líniou. Výsledky: Optimalizovali sme podmienky detekcie – zloženie roztokov, koncentrácia a predúprava aptaméru. Porovnali sme citlivosť dvoch spôsobov modifikácie povrchu senzorov aptamérmi – systém založený na samousporiadaní molekúl aptaméru značených tiolom sa ukázal ako citlivejší voči sytému založenému na interakcii neutravidínu a bio­tínom značeného aptaméru. Afinitu systému sme overili pomocou konfokálnej mikroskopie a vizualizáciou fluorescenčne značeného aptaméru naviazaného na povrchu buniek K562. Významným bodom je určenie schopnosti bio­senzora regenerovať citlivú rozpoznávaciu vrstvu pre účely viacnásobného použitia v praxi. Táto schopnosť bola overená použitím regeneračného činidla SDS, kedy sa vrstva buniek vyplavila z povrchu aptamérovej vrstvy a aptamér bol prístupný novým interakciám. Regenerovať sme dokázali oba typy modifikácie aptasenzorov 2–3× s vysokou efektivitou následnej detekcie. Záver: Získané výsledky ukazujú, že aptasenzory môžu poskytnúť nový, vysoko citlivý bio­snímací systém pre detekciu rakovinových buniek. Prínosom našich výsledkov je perspektíva posunu detekcie onkologických ochorení smerom k rapídnejším, citlivejším a menej invazívnym dia­gnostickým metódam. Pokladajú základy do budúcnosti, kedy by dia­gnostika pomocou aptasenzorov mohla ponúknuť alternatívu k zaužívaným metódam.

Podporené grantovou agentúrou VEGA (2/ 0160/ 21 a 1/ 0069/ 20).

Literatúra: [1] Yu T, Zhang H, Huang Z et al. A simple electrochemical aptamer cytosensor for direct detection of chronic myelogenous leukemia K562 cells. Electroanalysis 2017, 29(3): 828–834. doi: 10.1002/ elan.201600505.