Změny hladin vybraných cytokinů Th1, Th2 a Treg v séru u chronických infekcí (vč. H. pylori) v orofaryngu v závislosti na podání DHA a EPA a/nebo tonzilektomii – pilotní studie

Česká verzia English info

Changes Levels of Severe Th1, Th2 and Treg Cytokines in Blood Serum of Chronic Infection (incl. H. pylori) in Oropharynx Followed the EPA and DHA Intake and/or Tonsillectomy – a Pilot Study

Introduction:
The effect of eikospentan acid (EPA) and dokosahexan acid (DHA) on immune reactions was very intensely studied. The aim of this study was to clarify the impact of chronic Helicobacter pylori infection and EPA and DHA levels on Th1 cytokines (IL-2, IL12-p70, INF-g), Th2 cytokines (IL-4, IL-6) and T reg cytokines (IL-10, TGF-b1) in patient after tonsillectomy.

Materials and methods:
Patients were sorted into three main groups and one control group. Sampling was performed before the start of surgery or before the start of EPA and DHA administration. The second sampling was performed after 15 weeks in all main groups. The daily dosage of 540 mg of EPA and 360 mg of DHA was divides into three doses . The cytokines were analysed from the blood plasma. The concentation of the cytokines was quantified by Quantibody Custom Array. Statistical analysis was performed by using StatGraphics programme – multifactorial analysis ANOVA.

Results:
Statistically significant result was obtained in cytokine IL12-p70 in both measurements. In first sampling (2012) was the significance p=0.04 among the individual groups. In the second sampling the significance was p=0.01 in the phase before and after preparate administration. Dependence on IL-6 was prooved after the perparate admonistration (correlative coeficient 0.48), on IL-4 was dependence little bit higher (correlative coeficient 0.77).

Conclusion:
Cytokine IL12-p70 seems to be the main regulatory cytokine, thus it is possible to think about Th1 and NK cells stimulation.

Keywords:
acid, docosahexanoic acid, interleukins, chronic tonsillitis, cytokines

Autoři: J. Astl ^1,2; E. Nártová ⁴; J. Rotnágl ¹ ; T. Filipovský ¹; J. Betka jr. ²; M. Chovanec ^2,4 ; O. Šušoliaková ³; I. Šterzl ³
Působiště autorů: Klinika otorinolaryngologie a maxilofaciální chirurgie 3. LF UK a ÚVN Praha, přednosta prof. MUDr. J. Astl, CSc. ¹; Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK a FN Motol, Praha, přednosta prof. MUDr. J. Betka, DrSc. ²; Endokrinologický ústav Praha, ředitelka doc. RNDr. B. Bendlová, CSc. ³; Klinika otorinolaryngologie 3. LF UK a FN Královské Vinohrady, Praha, přednosta MUDr. M. Chovanec, Ph. D. ⁴
Vyšlo v časopise: Otorinolaryngol Foniatr, 65, 2016, No. 3, pp. 163-167.
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Úvod:
Vliv eikospentaneové kyseliny a dokosahexaneové kyseliny na imunitní reakce je studován velmi intenzivně. Cílem studie bylo zjistit, zda-li ovlivňuje DHA a EPA hladiny vybraných cytokinů Th1 odpovědi (IL-2, IL12-p70 a INF-g), a Th2 odpovědi (IL-4 a IL-6) a regulační cytokiny (IL- 10 a TGF-β1) a srovnání těchto změn u nemocných po odstranění tonzil pro chronický zánět (včetně infekce H. pylori).

Materiál a metodika:
Pacienti byli rozděleni do tří hlavních skupin a jedné kontrolní skupiny. Odběry byly provedeny před zahájením operace nebo před začátkem podávání EPA a DHA. Po 15 týdnech byl prováděn druhý odběr. Dávkování 540 mg EPA a 360 mg DHA bylo rozděleno do tří dávek denně. Ze získaných vzorků krvi byla odebrána plazma ke stanovení cytokinů. Jejich koncentrace byla následně změřena metodou protilátkových čipů Quantibody Custom Arrays. Statistické zpracování proběhlo za pomoci programu StatGraphics multifaktoriální analýzou ANOVA.

Výsledky:
Statisticky významná změna hladiny byla prokázána u cytokinu IL12-p70, kde se významnost potvrdila souběžně v obou částech měření. V první části byla zaznamenána signifikance p=0,04, a to mezi jednotlivými skupinami. V druhé části se objevil signifikantní výsledek (p=0,01), a to mezi stavem před a po podání EPA a DHA. Změna hladiny byla zjištěna i u odpovědi TH2, a to IL-6 po podávání EPA a DHA (korelační koeficient 0,48) a IL-4, kde jsou změny výraznější (korelační koeficient 0,77).

Závěr:
Cytokin IL12-p70 lze považovat za nejvíce ovlivněný podáním EPA a DHA a může mít vliv na odpověď Th1 a stimulaci Nk buněk.

Klíčová slova:
H. pylori, eikospentaenová kyselina, dokosahexaenová kyselina, chronická tonzilitida, interleukiny, cytokiny

ÚVOD

Buňky Th1 odpovědi představují tzv. buněčný typ odpovědi, která působí proti virům a intracelulárním patogenům a eliminuje nádorové buňky. Buňky Th2 odpovědi jsou spojeny s tzv. humorální reakcí imunity spojené se zvýšenou produkcí protilátek proti bakteriím. V literatuře se setkáváme s údaji o eikospentaneové kyselině (EPA) a docosohexaneové kyselině (DHA), aniž byl efekt na Th1/Th2 odpověď. Razavi a kol. (8) konstatují, že při infekci H. pylori se u dětí setkáváme především z Th17, resp. Treg odpovědí. Soracha a kol. uvádějí pokles hladiny IL-1beta, TNF - alfa a IL-6, pokud byly zvýšeny přítomností H. pylori. Achyut a kol. (1) popsali závislost mezi promotry metloproteinázy MMP-7 a TGF beta 1 a prekancerozním stavem asociovaným infekcí H. pylori (Cag A genotypem). Kong a kol. (5) popisují in vitro pokles produkce IL-12p70, IL-6, a IL-23 dendritickými buňkami. Studii uzavírají konstatováním, že aplikace DHA snižuje stimulaci dendritických buněk, resp. snížení efektu antigen specifických T lymfocytů a k diferenciaci odpovědi Th1 a Th17. In vivo pak podání DHA a EPA mělo prokazatelný vliv na snížení hladin IFN gama a IL-17 produkované CD4(+) T lymfocyty ve slezině a v CNS.

MATERIÁL A METODIKA

Charakteristika souboru

Respondenti byli zařazeni do tří různých skupin a kontrolní skupiny.

Skupina A: Pacienti, kteří byli indikováni k odstranění patrových mandlí pro chronický zánět. Současně byl nalezen pozitivní výtěr na patogen Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes a byly zaznamenány 4 exacerbace v průběhu posledního roku před operací či 2 infekce ročně v posledních 3 letech s tím, že byla zjištěna vyšší hladina ASLO nebo opakovaně elevace CRP a leukocytů. Odebrané patrové mandle byly pak zařazeny k analýze na přítomnost H. pylori.

Do této skupiny bylo zařazeno 10 pacientů.

Skupina B: Probandi, kteří byli indikováni k odstranění patrových mandlí pro chronický zánět. Tito nemocní měli pozitivní výtěr na patogen Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, současně měli 4 exacerbace v průběhu posledního roku před operací nebo 2 infekce ročně v posledních 3 letech s tím, že byla zjištěna vyšší hladina ASLO či opakovaně elevace CRP a leukocytů. Odebrané patrové mandle byly pak zařazeny k analýze na přítomnost H. pylori. V této skupině bylo 7. den po provedené operaci zahájeno podávání 540 mg EPA a 360 mg DHA (Omega3 complexNutrilite, USA). Podávání preparátů bylo denně rozděleno do tří dávek. Celkový příjem polynenasycených kyselin nebyl modifikován další dietou, kde byl sledován jídelníček, a další dietní příjem omega 3 kyselin potravinami nepřesáhl 40 mg denně. Doba podání EPA a DHA byla 15 týdnů.

Do této skupiny bylo zařazeno 18 probandů.

Skupina C: Respondenti měli pozitivní výtěr na patogen Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes a současně měli 4 exacerbace v průběhu posledního roku před operací a nebo 2 infekce ročně v posledních 3 letech s tím, že byla zjištěna vyšší hladina ASLO či opakovaně elevace CRP a leukocytů. Denní dávka byla opět 540 mg EPA a 360 mg DHA (Omega3 complexNutrilite, USA) a rovněž rozdělena do tří dávek. Doba podávání byla 84 dnů, kde celkově podaná dávka EPA byla 45,36 g, u DHA 29,24 g. Celkový příjem polynenasycených kyselin nebyl modifikován další dietou, kde byl sledován jídelníček a další dietní příjem omega 3 kyselin potravinami nepřesáhl 40 mg denně (maximální aditivní příjem byl 3,36 g). Doba podání EPA a DHA byla 15 týdnů.

Do této skupiny bylo zařazeno 18 probandů.

Skupina D (kontrolní): Respondenti s nálezem bez chronických zánětlivých změn v oblasti orofaryngu a nosní dutiny. Dotazníkem (REQUEST IN PRACTICE) byl vyloučen gastroezofageální reflux a potvrzen negativní dechový ureázový test. Do této skupiny bylo zařazeno 11, resp. 10 probandů. Odběr byl proveden pouze při vstupu do skupiny, která byla zvolena jako kontrolní. Další odběry s ohledem na absenci patologie i v orofaryngu nebyly provedeny.

Celkové vykonání studie bylo ošetřeno a povoleno etickou komisí, vybraní respondenti na znak svého souhlasu se vstupem do studie podepsali informovaný souhlas. Data byla odebírána a zpracována následujícím způsobem (viz text níže).

METODOLOGIE ODBĚRŮ

Byla odebírána krev ve všech vybraných skupinách (viz text výše). První odběr byl proveden před zahájením operace nebo před začátkem podávání EP a DHA. Druhý odběr byl obdobně prováděn po 15 týdnech v skupinách A,B,C. Skupiny B a C do doby odběru přijímaly podle předem stanovené metodiky 540 mg EPA a 360 mg DHA (viz metodika - charakteristika souboru).

Postup na stanovení cytokinů

Odběr sér ke stanovení cytokinů byl prováděn do zkumavek s citrátem. Po odběru byla krev centrifugována po dobu 10 min. při 10G. Následně byla odebrána plazma, která byla zmrazena na 60 stupňů Celsia. Následně byla provedena analýza metodou protilátkových čipů Quantibody Custom Arrays. Cílovou skupinou cytokinů byly: Th1 cytokiny (IL-2, IL-12p70 a INF-g), Th2 cytokiny (IL-4 a IL-6) a Tregulační cytokiny (IL 10 a TGF-b1). Koncentrace jsou udávány v pg/ml.

Statistické zpracování

Výsledky byly sestaveny včetně standardizačních křivek a korelací lineární regrese. Statistické zhodnocení bylo provedeno multifaktoriálním testováním ANOVA, kde získané koncentrace cytokinů (viz text výše) byly rozděleny podle skupin a podle stavu odběrů (před zahájením operace anebo před začátkem podání EPA a DHA a po skončení léčby); vzájemné vztahy mezi jednotlivými cytokiny byly vyjádřeny přímou korelací.

VÝSLEDKY

Do první fáze studie bylo zařazeno 24 probandů (skupina A=8 pacientů; skupina B=10 pacientů a skupina C= 6 pacientů), v druhé fázi 2014 bylo zařazeno 23 probandů (skupina A=4 pacienti; skupina B= 11 pacientů a skupina C=8 pacientů).

Statisticky významný výsledek paralelně v období dvou let měření vyšel v u cytokinu IL- 12p70. V roce 2012 byl rozdíl zaznamenán mezi skupinami (p=0,4), kde koncentrace u skupiny „operace bez podání omega“ byla 1,61 pg/ml, u skupiny „bez operace a bez podání omega“ bylo c=1,62pg/ml a „operace s podáním omega“ c=3,48 pg/ml (graf 1, tab. 1). V roce 2014 se ukázal statisticky signifikantní výsledek mezi stavem podání omega (p=0,01), kde před podáním byla koncentrace c=7,30 pg/ml a po skončení léčby c=14,62 pg/ml (graf 2, tab. 2).

**Graf 1. Koncentrace IL- 12p70 podle skupin (běh 1, rok 2012)...**

**Graf 2. Koncentrace IL- 12p70 podle stavu podání preparátu (běh 2, rok 2014).**

V souboru, kde byla vykonána operace s podáním omega, byla prokázaná změna hladin statisticky významná s IL-6 (korelační koeficient se pohyboval kolem 0,48) a s IL-4, kde nebyla vykonána “operace s použitím omega” (korelační koeficient byl 0,77).

Statisticky významný výsledek vykazoval i cytokin IFN-g (tab. 3), kde se rozdíl ukázal ve stavu podání omegy (p=0,0038; před užíváním c=18,11 pg/ml, po užívání c=44,37 pg/ml). U skupin Th2 cytokinů a Tregulačních cytokinů nebyl prokázán žádný statisticky významný rozdíl.

**Tab. 3. Koncentrace IFN-γ podle podle stavu podání preparátu (běh 2, rok 2014).**

V práci bylo prokázáno ovlivnění hladin cytokinů Th1 odpovědi u nemocných s chronickým zánětem u IL 6 a IL 4 při podávání DHA a EPA a prokázány změny po provedení tonzilektomie. Tyto výsledky podporuje také ovlivnění hladin IL 12p70.

Lze konstatovat:
a) podávání EPA a DHA mají vliv na hladiny cytokinů odpovědi Th1 i Th2,
b) ovlivnění hladin cytokinů je statisticky patrné i po odstraněním patrových mandlí.

DISKUSE

Whelan a kol. (14) popisují po podání PUFA boost aktivity B- lymfocytů, jejich možný vliv na odpověď Th2 a zvýšení produkce lipidových mediátorů. Shaikh a kol. (12) popisují imunomodulační efekt PUFA, který modifikuje buněčnou stěnu a tak ovlivňují i prezentaci membránových receptorů. Sijben a kol. (13) popisují metaanalýzu, v níž se zabývají skutečností, že některé práce prokazují imunomodulační efekt PUFA a na druhé straně je mnoho prací, které nepodávají tento důkaz.

Tento imunomodulační efekt považujeme za prokázaný především u INF-gama, kde je evidentní, že oba typy léčby vedou ke zvýšení jeho hladin. Fujieda a kol. (3) prokázali, že vysoká hladina IFN- ã sehrává roli v rozvoji nefropatie, ale je nezávislá na infekci haemofilus influeanzae. Vzestup hladin INF-gama můžeme především reprodukovat jako ukončení imunosuprese. INF-gama je aktivátor makrofágů a lze tedy předpokládat, že jeho vzestup je jednoznačným průkazem zvýšení Th1 odpovědi u nemocných. Je evidentní, že tento efekt lze spojit jak s odstraněním infekce v tonzilách, včetně infekce H. pylori, tak v podávání PUFA, které obě samy o sobě mají statisticky významné vzestupy.

Schwager a kol. (9) prokázali skutečnost, že produkce IL-8 (resp. CXCL8/IL8) je řízena DHA. Obdobně prokazují, že resveratrol a DHA synergicky zvyšují produkci IL-6 a podobný efekt se objevil se i pro IL-1 beta. Tito autoři učinili tedy závěr, že DHA a EPA doplňují efekt zvýšení produkce a kinetiky u prozánětlivé reakce. V naší práci jsme pro IL-6 nalezli podobné výsledky, kde zvláště při aplikaci chirurgického odstranění chronického zánětlivého ložiska, včetně inf. H. pylori, došlo k zvýšení hladin IL-6.

Studie Diehl a kol. (2) zjistila, že diferenciace buněk Th2 je indukována IL-6 a závislá na hladině IL-4, inhibice diferenciace buněk na Th1 je na IL-6 a IL-4 nezávislá a IL-6 zprostředkuje tuto inhibici zvýšením produkce supresorových cytokinů, které interferují s INF-g. Tyto závěry potvrzují duální roli IL-6 v diferenciaci odpovědi Th1/Th2. V předložené studii lze doložit, že po odstranění zánětu nebo jeho ovlivnění pomocí DHA a EPA klesá hladina IL-6 k hodnotám kontrolního souboru. Může to tedy znamenat, že aktivita IL-6 v indukci diferenciace Th2 lymfocytů je nižší, což snižuje proliferační, kterou popisují u IL-6 v předloženého práci od citovaného autora. IL-6 má nejen imunomodulační, ale i proliferační efekt a je zapojen v kaskádě procesů spojených s ovlivněním tkáňových buněk.

Schultze a kol. (10) popsali antagonizující efekt IL-12 , IL-10 a IL-4, kdy IL-10 a IL- 4 inhibují produkci IL-12. To znamená, že převaha Th1 cytokinů inhibuje Th₂ cytokiny a naopak. Tedy dojde-li k inhibici IL-6 produkce a i IL-4, potom inhibice Th2 odpovědi vede k snížení antibakteriální imunní odpovědi.

Možné vysvětlení by mohlo být v rozdílné odpovědi na infekci H. pylori obdobně jak publikovali Chizzolini C a kol.(4), kteří vycházeli z poznatku, že různá agens vyvolávají odlišné reakce T lymfocytů. Například infekce způsobena Mycobacterium tuberculosis je spojena s Th1 odpovědí (vysoké hladiny IFN-gama a snížení hladiny IL-4), na rozdíl od toxinu tetanu s odpovědí typu Th2 (nízké hladiny IFN-gama a vysoká produkce IL-4). Produkce těchto cytokinů je regulována IL-1beta a IL-1 Ra.

V souladu s tímto zjištěním jsou i hodnoty IL-12p70. Dle výsledků autorů Schultzeho a kol. (10) je možno přepokládat stimulaci, resp. diferenciaci lymfocytů Th1 odpovědi. Lukes a kol. (7) společně se studií Kučery a kol. (6) uvádějí, že může nastat ovlivnění (anebo minimální rozdíly) v produkci TGF-beta.

ZÁVĚR

Je možné uvažovat, že hlavním regulujícím cytokinem v naší studii je s velkou pravděpodobností cytokin IL12- p70. Tudíž je možno předpokládat stimulaci Th1 cytokinů a NK buněk (což může znamenat lepší vypořádání se s intracelulární infekcí a podpora imunitního dozoru).

Poděkování

Tato práce byla podpořena projektem IGA MZ ČR NT- 11523/6.

Adresa ke korespondenci:

Prof. MUDr. Jaromír Astl, CSc.

Klinika ORL 3. LF UK a ÚVN Praha

U Vojenské nemocnice 1200

169 02 Praha 6

e-mail: otorinolaryngologie-a-foniatrie@seznam.cz

Zdroje

1. Achyut, B. R., Ghoshal, U. C., Moorchung, N., Mittal, B.: Transforming growth factor-B1 and matrix metalloproteinase-7 promoter variants induce risk for Helicobacterpylori-associated gastric precancerous lesions. DNA Cell Biol., 28, 2009, 6, s. 295-301.

2. Diehl, S. L, Rincón, M. T:. He two faces of IL-6 on Th1/Th2 differentiation. Mol. Immunol., 39, 2002, 9, s. 531-536.

3. Fujieda, S. L, Suzuji, S., Sunagm H., Yamamoto, H., Seki, M., Sugimoto, H., Saito, H.: Production of interferon-gamma by tonsillar mononuclear cells in IgA nephropathy patients. Acta Otolaryngol., 120, 2000, 5, s. 649-654.

4. Chizzolini, C. L, Chicheportiche, R., Burger, D., Dayer, J. M.: Human Th1 cells preferentially induce interleukin (IL)-1beta while Th2 cells induce IL-1 receptor antagonist production upon cell/cell contact with monocytes. Eur J. Immunol., 27, 1997, 1, s. 171-177.

5. Kong, W., Yen, J. H., Ganea, D.: Docosahexaenoic acid prevents dendritic cell maturation, inhibits antigen-specific Th1/Th17 differentiation and suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Behav. Immun., 25, 2011, 5, s. 872-882.

6. Kučera, T., Pácová, H., Veselý, D., Astl, J., Martínek, J.: Apoptosis and cell proliferation in chronic tonsillitis and oropharyngeal carcinoma: role of nitroc oxide and cytokines. Biomed. Papers, 148, 2004, 2, s. 225-227.

7. Lukes, P., Pácová, H., Kucera, T., Veselý, D., Martínek, J., Astl, J.: Expression of endothelial and inducible nitric oxide synthase and caspase-3 in tonsillar cancer, chronic tonsillitis and healthy tonsils. Folia Biol. (Praha), 54, 2008, 5, s. 141-145.

8. Razavi, A., Bagheri, N., Azadegan-Dehkordi, F. et al.: Comparative immune response in children and adults with H. pylori infection. J. Immunol. Res., 2015, doi: 10.1155/2015/315957.

9. Schwager, J., Richard, N., Riegger, C., Salem, N. Jr.: ω-3 PUFAs and resveratrol differently modulate acute and chronic inflammatory processes. Biomed Res. Int., 2015; doi: 10.1155/2015/535189

10. Schultze, J., Michalak, S., Lokne, J., Wong, A., Gilleece, M. H., Gribben, J. G., Nadler, L. M.: Human non-germinal center B cell interleukin (IL)-12 production is primarily regulated by T cell signals CD40 ligand, interferon gamma, and IL-10: role of B cells in the maintenance of T cell responses. J. Exp. Med., 189, 1999, 1, s. 1-12.

11. Shaikh, S. R., Editin, M.: Polyunsaturated fatty acids, membrane organization, T cells and antigen presentation. Am. J. Clin. Nutr., 84, 2006, 6, s. 1277-1289.

12. Shaikh, S. R., Editin, M.: Immunosuppressive effects of polyunsaturated fatty acids on antigen presentation by human leukocyte antigen class I molecules. J. Lipid Res., 48, 2007, 1, s. 127-138.

13. Sijben, J. W., Calder, P. C.: Differential immunomodulation with long-chain n-3 PUFA in health and chronic disease. Proc. Nutr. Soc., 66, 2007, 2, s. 237-259.

14. Whelan, J., Goudy, K. M., Shaikh, S. R.: N-3 polyunsaturated fatty acids modulate B cell activity in pre-clinical models: Implications for the immune response to infections. Eur J. Pharmacol., 2015, pii: S0014-2999(15)00465-3. doi: 10.1016/j.ejphar.2015.03.100.

15. Rubin, G., Vebel, P., Briho-Hayek, A. et al.: Validation of a brief symptom questionnaire (REQUES IN PRACTICE) for patients it gastro-oesophageal reflex disease. Aliment Pharmacol. Ther., 27, 2008, 9, s. 846-851.