19. sympozium asistované reprodukce

1. Data z Národního registru asistované reprodukce (NRAR) České republiky za rok 2008

K. Řežábek
Gynekologicko‑porodnická klinika 1. LF UK a VFN Praha

Úvod: NRAR shromažďuje data o cyklech IVF, KET a příbuzných metodách. Cílem příspěvku je informovat centra asistované reprodukce (poskytovatele dat) a všechny členy SAR o datech a jejich analýze za uzavřený loňský rok 2008 a porovnat je s rokem 2007.

Soubor a metodika: Data popisují výchozí parametry cyklů (věk, diagnóza ženy a muže, cíl cyklu), vstupní parametry léčebného cyklu před in vitro fází (stimulace ovarií/endometria, způsob získání spermií), průběh cyklu in vitro (oocytů získáno, darováno, přijato, oplozováno, oplozeno atd.), výsledky cyklu (gravidita, počet implantovaných embryí, počet porozených dětí), komplikace a ně­kte­ré další údaje, např. počet PGD.

Výsledky: Prezentace výsledků bude pro svou obsáhlost provedena až na přednášce.

Závěr: NRAR umožňuje analyzovat údaje o provádění metod asistované reprodukce v České republice a umožňuje poskytnout data do mezinárodního registru EIM.

2. Možnosti a výsledky genetického vyšetření preimplantačních embryí (PGD) u párů s chromozomální translokací

T. Mardešić
Sanatorium Pronatal; Praha

Úvod: Páry s chromozomální translokací mají výrazně nižší naději na úspěšnou reprodukci a vysoké riziko opakovaných potratů. Genetické vyšetření preimplantačních embryí (PGD) snižuje riziko potratu a zvyšuje naději na porod zdravého plodu. Úspěšnost IVF cyklů s PGD u těchto párů však zůstává nižší než u ostatních indikací pro mimotělní oplodnění.

Cíl studie: Posoudit úspěšnost a výsledky PGD u párů s chromozomální translokací.

Soubor a metodika: Do studie bylo zařazeno 37 párů s chromozomální translokací, kterým se nepodařilo porodit zdravé dítě po spontánní koncepci. Před zahájením IVF-PGD cyklu byly otestovány DNA sondy vzhledem k jejich vhodnosti u konkrétního páru rozlišit buňky normální a s balancovanou translokací od buněk s nebalancovanou translokací. Teprve poté a po podpisu informovaného souhlasu, ovariální stimulaci a IVF byla provedena po 72 hod od fertilizace u každého embrya bio­psie jedné blastomery. Po fixaci buněčných jader byly metodikou FISH vyšetřeny translokované chromozomy a dále chromozomy 13, 15, 16, 18, 21, 22, X a Y. Transferována byla maximálně dvě embrya s dvěma signály pro každý vyšetřovaný chromozom a s normálním embryologickým vývojem a morfologií, případná nadpočetná euploidní embrya byla kryokonzervována.

Výsledky: V našem čtyřletém souboru (2005–2008) představovaly páry s translokací 7,8% (37/435) PGS/PGD cyklů, průměrný věk pacientek byl 31,6 (±2,1). Z celkového počtu 221 vyšetřených embryí bylo 72 embryí (32,6%) normálních či s balancovanou translokací. Přenos embryí byl proveden ve 31 z 37 cyklů (83,8%), 11 dosažených těhotenství představuje úspěšnost 29,7%/cyklus, resp. 35,5%/transfer. Dvě z dosažených těhotenství skončila potratem (18,8%), ostatní těhotenství vedla k porodu zdravých plodů.

Závěr: PGD u vysokého procenta párů s chromozomální translokací, kterým se nepodařilo porodit zdravé dítě po spontánní koncepci, umožňuje v krátkém časovém horizontu dosažení těhotenství a porodu zralého plodu.

3. Význam hodnocení morfologie spermií a možnosti jeho objektivizace

P. Trávník, E. Oráčová, G. Tauwinklová, K. Veselá, L. Hromadová, J. Veselý
Sanatorium Repromeda; Brno

Hodnocení morfologie spermií tvoří nedílnou součást vyšetření parametrů mužské plodnosti. Morfologie spermií odráží průběh spermatogeneze, jejich schopnost oplodnit vajíčko a také informuje o vývojovém potenciálu vzniklého embrya. Indikuje spolu s ostatními parametry spermiogramu i možný výskyt genetických odchylek.

Existuje řada metod rutinního hodnocení morfologie spermií, ať už v nativním stavu nebo na barvených preparátech. Zcela nesprávné výsledky dávají metody, které odvozují hodnocení morfologie spermií od jejich motility. Spolehlivější výsledky dává počítačem asistované vyšetření morfologie v nativním preparátu. Nejkvalitnější výsledky poskytuje vyhodnocení barvených nátěrů, pokud však je hodnocení prováděno subjektivně, jsou i tak zatíženy vysokou interlaboratorní a inter­individuální variabilitou, která může být až 40%.

Domníváme se, že cestou k objektivizaci vyšetření morfologie spermií je použití počítačového vyhodnocení obrazu spermie v barveném preparátu. Takové vyšetření podle našeho názoru umožní jak dobrou diagnostiku poruch spermiogeneze, tak i spolehlivější výzkum závislostí mezi morfologií, fyziologií a genetikou spermií. Z tohoto důvodu se zabýváme praktickými možnostmi analýzy obrazu spermií získaných z obarvených nátěrů.

4. Digitální holografická mikroskopie spermií

I. Crha¹, H. Janečková², J. Žáková¹, P. Ventruba¹, E. Lousová^1
1 Gynekologicko‑porodnická klinika LF MU a FN Brno
² Ústav fyzikálního inženýrství, Fakulta strojního inženýrství, VUT Brno

Úvod: Digitální holografická mikroskopie (DHM) patří k nejmodernějším technikám výzkumu dynamiky živé buňky. Úspěšně byla využita při výzkumu strukturální integrity rakovinných buněk. Cílem studie bylo vypracovat metodiku DHM pro zobrazení spermií a posoudit její přínos pro vyšetření poruch plodnosti.

Materiál a metody: Princip holografické mikroskopie je založen na zviditelnění změny fáze světla indukovaného vzorkem. Využívá interference světla procházejícího objektem se světlem procházejícím mimo vyšetřovaný objekt. Holografický mikroskop má dvě větve. V jedné větvi je umístěn preparát a v druhé větvi ne. Světlo procházející oběma větvemi ve výstupní rovině mikroskopu interferuje – vytváří proužky, které jsou deformovány fází objektu. Matematickým zpracováním lze z DHM rekonstruovat jak amplitudu (tím získáme obraz jako z klasického světelného mikroskopu), tak i fázi objektu. V buněčném výzkumu fáze buňky vypovídá o rozložení její aktivní hmoty (cukry, tuky, bílkoviny). Vzorky spermatu s fyziologickými a patologickými hodnotami spermiogramu byly získány a standardně vyšetřeny v andrologické laboratoři našeho centra. Vyšetřovaný vzorek byl umístěn do speciální komůrky vyrobené ze dvou krycích sklíček separovaných od sebe mezikružím o tloušťce 1mm. Vyšetření byla prováděna na DHM se zabudovanou digitální kamerou Astropix 1.4 a softwarem vyvinutým pro rekonstrukci obrazu. Obraz spermie získaný metodou DHM byl porovnán s obrazem získaným fázovým mikroskopem.

Výsledky: Byla vypracována metodika přípravy a vyšetření spermatu metodou DHM, která umožňuje zřetelné zobrazení spermií. Fázový posun vzniklý průchodem paprsků spermiemi byl zobrazen ve 3D pomocí barevné škály pro lepší prostorovou orientaci. Trojrozměrný obraz spermie získaný metodou DHM je zcela odlišný od obrazu z fázového mikroskopu. Limitem pro podrobnou analýzu obrazu z DHM je maximální zvětšení použitého přístroje – zvětšení závisí na použitém objektivu, nyní jsme upravili tak, že lze zvětšovat i víckrát.

Závěr: DHM umožňuje hodnotit jiné vlastnosti spermie než světelná nebo elektronová mikroskopie. Otvírá nový prostor pro studie poruch mužské plodnosti. Vyžaduje speciální zařízení; příprava a vyšetření vzorků jsou časově náročné. Souvislost mezi výsledným holografickým obrazem spermie a jejími klinicky významnými vlastnostmi vyžaduje další výzkum.

Podpořeno Grantem IGA MZ ČR NS/6641-4 a Grantovou agenturou ČR, grantem č.202/08/0590.

5. Jak dále v preimplantačním genetickém screeningu (PGS)?

K. Veselá
Sanatorium Repromeda; Brno

Od roku 2004 bylo publikováno celkem jedenáct kontrolních randomizovaných studií (RCT) studujících benefity preimplantačního genetického screeningu (PGS) prováděného metodou multicolor FISH z indikace vyššího věku matky. Deset z těchto studií bylo provedeno na embryích ve stadiu rýhování, jediná pak na embryích ve stadiu blastocysty. Žádná z těchto studií doposud neprokázala vyšší THBR po provedení PGS pro vyšší mateřský věk. Řadu z těchto studií je však možno kritizovat jak pro „technologické“ chyby, tak i pro bias, eventuálně i pro nedostatky ve statistickém zpracování.

Hlavními indikacemi k provedení PGS je vyšší věk matky (AMA), opakované selhání implantace kvalitních embryí (RIF), opakované potraty u párů s normálním karyotypem (RM) a závažný andrologický faktor (SMF). V databázích ESHRE se objevuje rovněž množství tzv. „dalších“ indikací – např. selekce embryí pro single‑embryo transfer (SET), genetické abnormity předchozího plodu, předchozí radioterapie apod. Ve většině případů se indikace k provedení screeningu kumulují.

Dosud chybí RCT hodnotící efekt PGS prováděného pro jiné indikace nežli je selektivně vyšší věk (AMA). Je rovněž zajímavé, že na ně­kte­rých centrech metoda benefity přináší, na jiných však ne.

Je pravděpodobné, že vysoký podíl chromozomálního mozaicismu v rýhujících se embryích může vést k množství falešně pozitivních a falešně negativních výsledků, stejně jako se projevuje limitace metody ve smyslu nemožnosti vyšetřit plné spektrum chromozomů. Předpokládá se, že v části spektra nevyšetřených chromozomů se mohou skrývat významné aneuploidie, které nejsou slučitelné s perspektivním vývojem embrya. V neposlední řadě stále jako možný faktor neúspěchu na ně­kte­rých pracovištích se jeví nedostatečné zvládnutí techniky bio­psie a následné kultivace bio­ptovaného embrya.

Vzhledem k tomu, že technika multicolor FISH se stává vzhledem ke svým limitacím nedostatečnou pro posouzení genetického statutu embryí, je potřeba ji v brzké době nahradit jinou plnohodnotnou technikou. V současnosti se rozbíhá v rámci ESHRE nová RCT, která na vyšetřování polocytů a trofectodermu má za úkol zdokumentovat možné benefity PGS s užitím mikročipové technologie.

6. ACC haplotyp protaminových genů PRM1 a PRM2 je asociován s vyšším počtem spermií

P. Křenková, F. Tüttelmann, S. Römer, A. R. Nestorovic, M. Ljujic, A. Štambergová, M. Macek jr., E. Nieschlag, J. Gromoll, M. Simoni, M. Macek sr.
ÚBLG, FN Motol; Praha

Během spermatogeneze jsou histony v hlavičkách spermií nahrazovány protaminy, které umožňují kondenzaci chromatinu nezbytnou pro stabilitu DNA a neporušené vyzrávání spermií. Haploinsuficience těchto genů vede u myší k neplodnosti způsobené abnormální morfologií spermií a jejich sníženou pohyblivostí. Publikované studie zabývající se rolí PRM1/2 variant v mužské neplodnosti jsou však nejednoznačné. Cílem naší studie bylo stanovit frekvenci těchto variant a objasnit jejich vztah k poruchám spermiogeneze.

V mezinárodní retrospektivní studii případů a kontrol byla provedena sekvenační analýza protaminových genů u tří skupin německých mužů – u neplodných pacientů s idiopatickou teratozoospermií a normálním (N = 88) nebo sníženým množstvím spermií (N = 83) a u kontrolní skupiny normozoospermických mužů s normálním počtem spermií (N = 77).

V genu PRM1 byly detekovány dvě vzácné varianty (c.54G>A, c.102G>T) a jedna častá (c.230A>C), v genu PRM2 pak šest vzácných variant a dvě časté (c.298G>C a c.373C>A).

Ve frekvenci nalezených variant nebyl nalezen žádný signifikantní rozdíl mezi testovanými skupinami. Mutace jsou v protaminových genech vzácné a nejsou přímou příčinou poruch spermiogeneze.

Analýza haplotypů třech nejčastějších polymorfizmů PRM1 230A>C a PRM2 298G>C/373C>A prokázala u společně testovaných 248 mužů vztah k počtu spermií. Homozygotní nosiči haplotypu ACC mají dvojnásobně vyšší počet spermií než muži bez tohoto haplotypu. Signifikantní odchylka analýzy Hardy-Weinbergovy rovnováhy těchto polymorfizmů prokazuje selekční výhodu alely ACC, která podporuje vyšší spermiogenezi, a tudíž lepší fertilitu. Uvedené nálezy jsou prioritní.

Podpořeno VZFNM00064203 a NR9448-3/2007.

7. Monozygotní dvojčata v asistované reprodukci

E. Oráčová^1,2, G. Tauwinklová¹, P. Trávník¹, K. Veselá¹, J. Veselý¹, L. Hromadová¹, E. Pagáčová^1
1 Sanatorium Repromeda; Brno
² Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.; Brno

Úvod: Monozygotní dvojčata (MZD) vznikají rozdělením jednoho embrya. U spontánních těhotenství se MZD vyskytují v 0,4%. Incidence MZD po metodách asistované reprodukce se pohybuje od 0,2% do 12,5%. Příčina vzniku není doposud jasná. Mezi vnitřní faktory související s MZD je řazen vyšší věk, odlišná inaktivace X chromozomu a vrozené defekty proteinů zona pellucida (genetické faktory). Jako vnější faktory související s MZD jsou uváděny ovariální stimulace, mikromanipulační metody narušující zonu pellucidu, transfer blastocyst a kultivační podmínky.

Materiál a metody: Retrospektivní studie monozygotních dvojčat zjištěných od ledna 2000 do srpna 2009 z čerstvých cyklů v programu IVF s použitím metod ICSI, PGD i darování oocytů.

Výsledky: Z 1 255 gravidit bylo zjištěno 25 (1,99%) monozygotních dvojčat. Ve všech případech se jednalo o transfer embryí po pětidenní kultivaci. Mezi transferovanými embryi převažovaly expandované a hatchující blastocysty. Z porozených plodů bylo 16 ženského a 10 mužského pohlaví. Oproti celému souboru pacientek byl v této skupině zjištěn nižší věk pacientek (29,36 vs 32,39) a vyšší počet získaných oocytů (16,8 vs 14,94). Během posledních tří let byla zaznamenána vzrůstající tendence v počtu zjištěných MZD na graviditu; a to 2,80% (rok 2007), 3,33% (rok 2008) a 4,24% (část roku 2009).

Závěr: Nenašli jsme souvislost výskytu monozygotních dvojčat s vyšším maternálním věkem, typem ovariální stimulace ani použitými mikromanipulačními technikami AR (ICSI, PGD). Skutečnými příčinami jejich vzniku se budeme dále zabývat.

8. Zobrazení spermií metodou AFM (Atomic Force Microscope) s vysokým rozlišením

J. Přibyl¹, P. Skládal¹, I. Crha² , J. Žáková^2
1 Národní centrum pro výzkum bio­molekul PřF MU Brno
² Gynekologicko‑porodnická klinika, LF MU a FN Brno

Úvod: Vyšetření spermatu je základním andrologickým vyšetřením. Informuje lékaře o morfologii a dalších vlastnostech spermií. Morfologie spermie je stěžejním faktorem ovlivňujícím průběh oplození a následný vývoj embrya. Standardním postupem je vyšetření barveného nátěru spermií fixovaných na podložním sklíčku pod optickým mikroskopem s imerzí (zvětšení 100krát). Cílem práce bylo vypracovat metodu přípravy vzorku a nastavení přístroje pro optimální zobrazení spermií metodou AFM.

Materiál a metody: Mikroskop atomárních sil AFM je velmi citlivé zobrazovací zařízení pracující typicky s rozlišením pod 1 nm. Principem zobrazování je kontakt velmi ostrého hrotu s povrchem vzorku, na němž je vhodně fixován vizualizovaný objekt. Nad tímto povrchem je hrot posouván, jeho výchylka je zaznamenávána laserovým paprskem a pomocí počítače převáděna do podoby trojrozměrného obrazu. Byla provedena pilotní studie použití mikroskopu AFM pro zobrazování spermií připravených standardní cestou na podložních sklech. Byly použity vzorky spermatu mužů s normospermií vyšetřovaných v andrologické laboratoři Centra asistované reprodukce FN Brno. Pro vyšetření byly vybrány spermie bez výrazných morfologických změn.

Výsledky: Pro dosažení kvalitního obrazu bylo nutné vypracovat techniku přípravy nátěru s odstraněním složek, které nejsou optickým mikroskopem pozorovatelné – stopy seminální plazmy, krystaly solí po zaschnutí fyziologického roztoku na preparátu. Nastavení přístroje vyžadovalo optimalizaci několika parametrů. Byly získány obrazy spermií s vysokým rozlišením umožňujícím hodnocení detailní morfologie povrchu.

Závěr: Studie potvrdila schopnost AFM mikroskopie zobrazit morfologii spermií až s molekulárním rozlišením.

Podpořeno Grantem GAAV KJB401630701 a IGA MZ ČR NS/9661-4.

9. Porovnání kvality spermatu u mužů dle věku, povolání a místa bydliště

T. A. Veselá, P. Trávník, D. Rathouzská, K. Veselá
Sanatorium Repromeda; Brno

Úvod: Pokles kvality spermatu u mužů je velmi diskutovaným tématem. V práci jsme se proto zabývali závislostí kvality spermatu na vybraných kritériích jako je věk, povolání a místo bydliště (okres).

Materiál a metodika: Zpracovali jsme výsledky vyšetření 4 000 nativních vzorků ejakulátu od klientů i od zdravých mladých dárců. Mezi porovnávanými parametry ejakulátu byl objem, koncentrace spermií, podíl progresivně pohyblivých spermií, podíl nepohyblivých spermií a morfologie, která byla vyšetřována na preparátech připravených obarvením nátěru v roztoku Dip-Quick-Stain. Výsledky byly ověřeny dle Kruskal-Wallisova neparametrického testu odlišnosti.

Výsledky: Z porovnávání vyplývá, že věk významně ovlivňuje parametry spermiogramu. Dané parametry ejakulátu se také ovlivňují navzájem. Nejvýznamnější závislost vyšla z porovnání objemu, koncentrace, podílu progresivně pohyblivých spermií a podílu morfologicky normálních spermií (P = 0,001). U dalšího kritéria – povolání – jsme rovněž zjistili závislost u progresivně pohyblivých spermií a morfologicky normálních spermií (P = 0,01). U porovnání dle místa bydliště je závislost nejméně výrazná.

Závěr: S věkem se kvalita ejakulátu zhoršuje nejvíce, místo bydliště naopak ovlivňuje kvalitu nejméně. Sedavá a psychicky náročná povolání byla označena z hlediska kvality spermatu jako nejrizikovější. U všech porovnávaných kritérií se podařilo nalézt statistické závislosti. Autoři se dále hodlají zaměřit na sledování dalších faktorů, jakými je například závislost kvality ejakulátu na kouření cigaret a užívání ně­kte­rých léků.

10. Využití nového markeru ADAM12 k záchytu rizikových gravidit v I. a II. trimestru

M. Macek sr.¹, D. Springer², H. Klučková¹, A. Lashkevich¹, R. Vlk³, I. Špálová³, D. Chudoba¹, D. Novotná¹, Š. Vilímová¹, M. Simandlová¹, M. Turnovec¹, M. Hladíková¹, H. Cuckle^4
1 Ústav bio­logie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol; Praha
² VFN Praha
³ Gynekologicko‑porodnická klinika 2. LF UK a FN Motol; Praha
⁴ Columbia University, New York, USA

Úvod: ADAM12 (A Disintegrin And Metalloproteinase 12) je glykoproteinem placentárního původu. Jeho proteolytická aktivita vůči vazebným proteinům pro IGF (Insulin Like Growth Factor) uvolňuje růstové faktory IGF‑I, IGF‑II a další nezbytné pro růst a diferenciaci embrya a plodu. Je proto perspektivním markerem rizika IUGR, SGA (Small for Gestational Age), preeklampsie a aneuploidií v I. a II. trimestru.

Cílem naší studie bylo proto zjistit percentilové hodnoty ADAM12 v séru českých těhotných v rozmezí 8. až 18. týdne. Systematická studie tohoto období prozatím chybí.

Materiál a metody: K imunofluorochemickému měření hladin ADAM12 byl použit systém Delfia (Perkin Elmer). Pro každý den mezi 8. a 18. týdnem bylo vyšetřeno 30 vzorků. Výsledek každé gravidity byl potvrzen chromozomálním a klinickým vyšetřením.

Výsledky: Byly vypočteny hodnoty 5., 10., 25., 50., 75., 90. a 95. percentilu. Hladiny rostou úměrně se stářím gravidity, v 18. týdnu dosahují 1 352 ng/ml. Bylo prokázáno, že ADAM12 umožňuje v I. a II. trimestru detekci +21 u 7/24 (29,17%), +18 u 2/5 (40%), +13 u 3/3 (100%), triploidie u 8/9 (88,89%), trisomie X u 7/8 (87,5%).

Závěr: Snížení hladin ADAM12 pod 25. percentil v I. i II. trimestru významně zlepšuje záchyt triploidie, trisomie 13, 18 a X oproti stávajícím bio­chemickým markerům. ADAM12 je již od 7. týdne gravidity perspektivním markerem nejenom pro poruchy vývoje v důsledku aneuploidií, ale také funkčních poruch vývoje placenty.

Podpořeno VZ FNM 00064203 a NR/9448-3/2007.

11. Přežívání a diferenciace P19-odvozených neuroprogenitorů u myší typu Lurcher. Pilotní studie

Z. Houdek^1,2, R. Hűttelová¹, J. Cendelín², M. Králíčková^1,2, N. Zech^1,3, J. Pacherník⁴, P. Uher^1
1 Institut reprodukční medicíny a endokrinologie; Plzeň
² I. LF UK; Plzeň
³ University of Graz; Austria
⁴ Ústav experimentální bio­logie MU Brno

Téma: Jedním z aktuálních témat současnosti je neuroregenerace a její podpora různými typy kmenových buněk (KB). V případě neurodegenerativních chorob mohou vlastnosti patologicky změněné hostitelské tkáně ovlivňovat osud transplantovaných buněk. Transplantace neuronů vytvořených z buněčných linií pocházejících z teratokarcinomu se ukázala být prospěšná u zvířecích modelů několika neurologických onemocnění. Mutantní myši typu Lurcher představují experimentální model olivocerebellární degenerace. Jedinci nesoucí heterozygotní formu mutace v delta-2 podjednotce glutamátového receptoru trpí úplnou ztrátou Purkyňových buněk mozečku a sníženým počtem buněk granulárních a buněk dolní olivy. V naší studii jsme se zaměřili na porovnání krátkodobého přežívání neuroprogenitorů odvozených od myších embryonálních karcinomových (EC) KB (linie P19). Ty byly transplantovány do mozečku dospělých myší Lurcher a kontrolních zdravých jedinců.

Metodika: Buňky P19 byly značeny zeleným fluorescenčním proteinem a diferencovány do neuroprogenitorů přidáním kyseliny retinové. Transplantace buněk do mozečku byla provedena u 15 myší Lurcher a 18 zdravých jedinců. Mozečky byly hodnoceny histologicky po třech týdnech od transplantace. Statistické vyhodnocení bylo provedeno Fisherovým testem.

Výsledky: Přežívání a další neurodiferenciace transplatovaných buněk byly pozorovány u 3 myší typu Lurcher a u 10 zdravých myší (statisticky nevýznamný rozdíl p = 0,0724). Ve všech případech byly transplantované buňky nalezeny v místě jejich aplikace a neměly tendence pronikat do okolní tkáně.

Závěr: Jde o první studii porovnávající osud transplantovaných EC buněk ve zdravém a neurodegenerativními procesy postiženém mozečku. Výsledky potvrzují domněnku, že diferencované EC buňky jsou schopny přežívat a dále se diferencovat v hostitelské tkáni. Vliv neurodegenerace na přežívání neuroprogenitorových buněk nebyl zatím jednoznačně prokázán. EC buňky by se tak v budoucnu mohly stát vhodným médiem pro buněčnou terapii v případě neurodegenerativních onemocnění.

Tato práce byla podpořena grantem IGA MZd NR/ 9135-3, VZ MSM 021620816 a grantem COST B30/2007 OC 152.

12. Věk muže negativně ovlivňuje podíl euploidních embryí v cyklech s pgs

G. Tauwinklová¹, E. Oráčová^1,2, P. Trávník¹ , K. Veselá^1,3, L. Hromadová¹, J. Veselý^1,3, R. Rybář^1,2, P. Musilová^1,2,3, J. Rubeš^1,2,3
1 Sanatorium Repromedea; Brno
² Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.; Brno
³ GENPROGRESS; Brno

Úvod: Ačkoliv bylo prokázáno, že fertilita páru je silně závislá na věku ženy, vliv mužského věku na reprodukční zdraví páru a potenciální riziko vzniku aneuploidií v embryích není dosud znám.

Materiál a metodika: Byly analyzovány výsledky vyšetření embryí u 170 párů s normálním karyotypem, které za období leden 2004 až duben 2008 podstoupily v Sanatoriu Repromeda IVF cyklus s preimplantačním genetickým screeningem (PGS). 2 134 embryí bylo vyšetřeno metodou FISH s detekcí chromozomů X, Y, 13, 16, 18, 21 a 22. Páry byly rozděleny podle věku muže na tři skupiny, ve kterých byl hodnocen podíl embryí euploidních pro studované autozomy, podíl embryí euploidních pro gonozomy a podíl euploidních embryí.

Výsledky: Podíl embryí euploidních pro autozomy statisticky významně klesal u párů s vyšším věkem mužského partnera (P = 0,02). Nejvyšší procento embryí euploidních pro autozomy (60%) bylo nalezeno ve skupině párů, kde muž byl mladší než 28 let. Podíl embryí euploidních pro gonozomy se nelišil ve skupinách párů rozdělených podle věku muže. Podíl euploidních embryí negativně koreloval s věkem muže (P = 0,05). Korelace byla prokázána i po odstranění vlivu ženského věku na souboru párů, kde věk ženy byl nižší než 32 let (107 párů/1 318 embryí).

Závěr: Věk muže zvyšuje riziko vzniku numerických chromozomálních abnormalit v embryích a následně negativně ovlivňuje výsledek PGS cyklů.

13. Investigation of cellular outgrowths from developmentally abnormal human blastocysts

C. Bradley¹, O. Chami¹, K. Texlova², B. Dumevska¹, T. Stojanov^1
1 Sydney IVF Stem Cells
² Sanatorium Helios; Brno

Routine IVF practices result in the discarding of a significant proportion of embryos considered unsuitable for transfer on morphological grounds. The poor morphology can in principle result from genetic abnormalities or other metabolic failure. To provide karyotypes on clinically unsuitable embryos, 1,056 poor quality blastocysts due to be discarded were plated to obtain mitotically active cellular outgrowths for conventional cytogenetic investigation. Stable cellular outgrowths were obtained from 82 embryos (7,8%) of which only 13 (16%) were karyotypically abnormal, a smaller proportion than expected. These included trisomies frequently observed in miscarriages, all of which resulted from meiotic non‑disjunction. To further characterize the normal diploid cells, five cellular outgrowths were consented for further study. In each case the cellular outgrowths expressed pluripotency marker proteins including Nanog, Oct4, SSEA3 and Tra-1-81. Moreover, teratoma experiments revealed the cells to be capable of developing into cell lineages representative of the three germ layers, indicating that the cellular outgrowths represent pluripotent stem cell lines. In summary, we have demonstrated that developmentally abnormal blastocysts from which cellular outgrowths can be obtained are predominately cytogenetically normal, implying that many aneuploidies inhibit cell line derivation. As such, these ordinarily discarded embryos can be used to derive diploid pluripotent stem cell lines, potentially for use in therapeutic applications.

14. Návrh české koncepce psychosociální péče o páry trpící poruchami plodnosti

H. Konečná
ZSF JU, Katedra klinických oborů; České Budějovice + Nadace Mateřská naděje; Praha

Nedobrovolná bezdětnost a její řešení je podle mnoha výzkumných prací životní krizí přinášející klientům závažné psychosociální problémy. Nezvládnutá psychická zátěž je poměrně častým důvodem, proč pár léčbu vzdá, ačkoliv šance na její úspěch jsou poměrně velké. Ve všech státech, kde je léčba poruch plodnosti dobře přístupná, hledají možnosti, jak pomoci postiženým osobám zvládnout situaci. Ukazuje se, že i pomoc vyžadující minimální náklady – například vhodná nabídka informací – může mít významný dopad na zmenšení psychické zátěže. V rámci odborných diskuzí ESHRE SIG Psychology and Counselling i International Infertility Counseling Organization se objevují požadavky na speciální školení poradců a psychoterapeutů pracujících v této oblasti.

Z českých i zahraničních výzkumů a praktických zkušeností vyplývá, že pro pacienty potřebující pomoc reprodukční medicíny je problémem komunikace s partnerem/partnerkou, s ošetřujícím lékařem a s okolím. Častou stížností je nedostatek potřebných informací a málo empatie ze strany zdravotníků, jejich podceňování psychosociálního kontextu.

Česká republika má bohatou síť kvalifikovaných manželských poradců, jejichž psychoterapeutická pomoc je obvykle pro klienta bezplatná, bez nutnosti mít jakékoliv doporučení, dobře přístupná i pro obyvatele menších měst či obcí po celé ČR. Máme také dostatečné, dobře přístupné a laikům srozumitelné zdroje informací zahrnující celý interdisciplinární kontext řešení poruch plodnosti.

Ošetřující lékař, ať už praktický gynekolog nebo androlog či specialista z centra asistované reprodukce, bývá první styčnou osobou pro člověka hledajícího pomoc při řešení nedobrovolné bezdětnosti, proto osobou klíčovou. Příspěvek bude návrhem české koncepce komplexní a navazující psychosociální péče v oblasti řešení poruch plodnosti.

15. Využití oocytů ve stadiu MI pro asistovanou reprodukci

L. Jelínková
Sanatorium Pronatal; Praha

Úvod: Při standardním postupu ICSI jsou injikovány pouze oocyty ve stadiu MII. Po denudaci oocytů do 1 hod po punkci je průměrně 80% oocytů ve stadiu MII, 11% ve stadiu MI a 9% ve stadiu GV. Do 4 hod po denudaci dozraje 16–57% oocytů z MI do MII, do 24 hod dozraje 43–85% těchto oocytů. V literatuře jsou popsány výsledky nestandardní ICSI, kdy byly injikovány oocyty ve stadiu MI. Procento oplození (2PN) bylo výrazně nižší (28–43%) než po standardní ICSI, procento degenerace oocytů bylo vyšší (11%). Chromozomální analýza takto vzniklých embryí ukázala vysoký podíl aneuploidií (97,2%), nejčastěji komplexní mozaiky. Přesto je popsán případ, kdy po ICSI jediného MI oocytu došlo k oplození, implantaci a porodu zdravého dítěte.

Cíl práce: Chromozomální stav embryí po ICSI oocytů ve stadiu MI.

Materiál a metody: Pacientky, u kterých byl plánován PGS, které po šesti hodinách po denudaci měly ≥ 3 MII a ≤ 1 MI oocytů. Pro studii byly použity oocyty ve stadiu MI, které nedozrály do 6 hod po punkci. Bylo sledováno procento oplození, procento degenerace oocytů a chromozomální stav vzniklých embryí. Po 72 hod kultivace byly odebrány 1–3 buňky s viditelným jádrem, analyzovány za použití metody FISH sondami pro chromozomy 13, 15, 16, 18, 21, 22, X a Y.

Výsledky: Po ICSI oocytů ve stadiu MI byla pozorována 30,2% fertilizace (2PN), v 11% 3PN, ve 14% lyze oocytů. Po chromozomální analýze jsme pozorovali 100% aneuploidních embryí.

Závěr: Embrya pocházející z ICSI MI oocytů mají vysoký podíl aneuploidií, dle našich údajů 100%, embrya vykazují komplexní anomálie. Vzhledem k našim výsledkům (ve shodě s literárními údaji) ICSI oocytů ve stadiu MI nevede ke vzniku embryí s nadějí na implantaci.

16. Selektivita vazby morfologicky normálních spermií na hyaluronovou kyselinu

P. Přinosilová¹, T. Kruger², L. Sati³, S. Ozkavukcu⁴, L. Vigue⁵, E. Kovanci⁶, G Huszar^5
1 Výzkumný ústav veterinárního lékařství; Česká republika
² University of Stellenbosch, Tygerberg Hospital; South Africa
³ Akdeniz University School of Medicine; Turkey
⁴ Ankara University School of Medicine; Turkey
⁵ Yale University School of Medicine; USA
⁶ Baylor School of Medicine; USA

Během spermiogeneze dochází k přetváření plazmatické membrány spermie, vznikají vazebná místa pro vazbu spermie na zonu pellucidu a také vazebná místa pro hyaluronovou kyselinu (HA). Spermie nedostatečně maturované, obsahující nadbytečnou cytoplazmu, mají sníženou schopnost vázat se na zonu pellucidu a také na HA. Naopak spermie, které jsou schopné vazby na HA, jsou maturované, zbavené nadbytečné cytoplazmy, perzistentních histonů, nevykazují apoptotické procesy a byl u nich zjištěn nižší výskyt fragmentací DNA a chromozomálních aneuploidií.

Dle Tygerbergské skupiny (Menkveld et al 1991) spermie, které se vázaly na zonu pellucidu, se vyznačily 4,2krát lepším morfologickým obrazem než spermie celého ejakulátu. Cílem prezentované práce bylo dokázat, že toto zlepšení vykazují i spermie vážící se na hyaluronanem pokrytá podložní skla (sperm Hyaluronan Binding Assay HBA, MidAtlantic Diagnostics Inc., USA).

Bylo srovnáno procento morfologicky normálních spermií v HA navázané frakci ejakulátu (část B skla) a v celém ejakulátu (část A skla). Morfologická analýza byla provedena dle Tygerberských striktních kriterií na Diff-Quikem obarvených spermiích. Procento morfologicky normálních spermií bylo na části B 3,04krát vyšší než na části A. Selekční síla hyaluronanu a zony pelucidy na morfologii spermií byly shledány srovnatelné. Kombinace metod stanovení morfologického obrazu spermií a vazby spermií na hyaluronovou kyselinu by mohla zlepšit management mužské infertility.

17. Porovnání produkce reaktivních kyslíkových částic metodami chemiluminiscence a flow-cytometrie v suspenzi spermií

M. Svobodová, H. Fingerová, I. Oborná, J. Novotný, J. Březinová, K. Machovská, J. Vysloužilová
CAR, Gynekologicko‑porodnická. klinika FN Olomouc

Cíl práce: Simultánní porovnání chemiluminiscence a flow-cytometrie v měření produkce ROS ve vzorku promytých spermií.

Materiál a metodika: Do studie bylo zařazeno 166 mužů z infertilních párů a 31 fertilních dobrovolníků. Spermiogram byl hodnocen dle manuálu WHO (1999). Seminální plazma byla odstraněna centrifugací, sediment byl promyt pufrem PBS a naředěn na výslednou koncentraci spermií 1,25 × 10⁶ mil/ml, ve které bylo provedeno měření produkce ROS oběma metodami. Celková produkce ROS byla měřena chemiluminiscenční metodou, při které byl použit luminol. Flow-cytometrií byl změřen jednak příspěvek intracelulárního H₂O₂ pomocí carboxy-2’7’-dichlorodihydrofluorescein diacetatu (DCFDA) a podíl peroxynitritu (ONOO-) pomocí dihydrorhodaminu 123 (DHR). Emitované světlo jednotlivých prob bylo měřeno mezi 515–545 nm. Pro jednotlivá měření bylo použito 25 000 buněk s rychlostí průtoku < 500 buněk/s. Po logaritmické transformaci bylo provedeno statistické vyhodnocení.

Výsledky: Byla zjištěna dobrá korelace mezi celkovou produkcí ROS a intracelulárním H₂O₂ (r = 0,53; P < 0,0001) a také intracelulárním peroxynitritem ( r = 0,62; P < 0,0001). Dále byla nalezena signifikantní korelace mezi hladinami H₂O₂ a ONOO- (r = 0,73; P < 0,0001). U 5% mužů nebyly ROS detekovány chemiluminiscenčně, ale pouze flow-cytometricky. Byla prokázaná negativní korelace mezi pohyblivostí spermií a produkcí intracelulárního H₂O₂ (r = –0,2; P < 0,0009), ale nebyla potvrzena korelace s celkovou produkcí ROS (P = 0,27) ani hladinou ONOO- (P = 0,22). Celková produkce ROS (r = –0,17; P = 0,02) i hladina intracelulárního peroxinitritu (r = 0,16; P = 0,03) signifikantně negativně korelovala s procentem morfologicky normálních spermií.

Závěr: Byla potvrzena signifikantní korelace naměřených hladin ROS ve vzorku spermií mezi oběma metodami. Flow-cytometrie je citlivá metoda, která může detekovat ROS i v případě, kdy chemiluminiscenčně jsou ROS negativní. Motilita spermií negativně koreluje pouze s intracelulárním H₂O₂, zatímco normální morfologie negativně koreluje jak s hladinou intracelulárního peroxinitritu, tak i s celkovou produkcí ROS.

Podporováno grantem IGA MZd č. A1 8621-5.

18. Obezita a věk ve vztahu ke standardním parametrům ejakulátu a integritě chromatinu spermií infertilních mužů

R. Rybář^1,2, V. Kopecká¹, P. Přinosilová¹, P. Marková³, J. Rubeš^1,2
1 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.; Brno
² Sanatorium Repromeda; Brno
³ Sanatorium ART; České Budějovice

Obezita může negativně ovlivnit lidské zdraví včetně plodnosti. Zatímco je známo, že obezita narušuje hormonální profil ženského organizmu a je spojována se ztrátou plodnosti, relativně málo informací existuje o vlivu obezity na plodnost mužů.

Prezentovaná studie analyzovala vzorky ejakulátů celkem 153 mužů. Muži pocházeli z infertilních párů snažících se o graviditu nejméně dvanáct měsíců. Byl zaznamenán věk všech mužů a byl vypočten jejich Body mass index (BMI). U ejakulátů všech mužů byl zjištěn objem, koncentrace, motilita a byla provedena striktní morfologická analýza. Integrita chromatinu spermií byla zjištěna metodou Sperm chromatin structure assay (SCSA). Kvalita kondenzace chromatinu spermií byla vyšetřena barvením toluidinovou modří, anilinovou modří a chromomycinem A3.

Na základě výsledků můžeme konstatovat, že nebyl potvrzen vztah mezi BMI a základními spermatologickými parametry, integritou chromatinu ani kondenzací chromatinu. Další výsledky naznačují, že kvalita ejakulátu vyšetřovaných mužů je ovlivněna jejich věkem. Ukázalo se, že věk je výraznější faktor, který ovlivňuje kvalitu ejakulátu, nikoliv však základní spermatologické parametry, ale integritu chromatinu spermií, která může výrazně ovlivnit fertilitu muže.

19. Vztah polymorfizmu receptoru pro FSH k těžkým formám OHSS

P. Feldmár¹, M. Macek sr.², H. Klučková², M. Hrehorčák¹, Š. Vilímová², M. Macek jr.^2
1 Gynekologicko‑porodnická klinika 2. LF UK a FN Motol; Praha
² Ústav bio­logie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol; Praha

Cíl: Zhodnocení vztahu mezi genotypem receptoru pro FSH (FSHR) a ovariálním hyperstimulačním syndromem (OHSS) III. a IV. stupně dle Golana u českých žen. Polymorfizmus FSHR ovlivňuje citlivost specifického receptoru na FSH, a tím spoluurčuje riziko OHSS. Genotyp Ser680Ser vede ke snížené citlivosti, Asn680Ser má vyšší citlivost, Asn680Asn pak nejvyšší citlivost k FSH.

Materiál a metody: Klinicky a molekulárně‑geneticky bylo vyšetřeno jedenáct žen s OHSS III. stupně a deset žen s OHSS IV. stupně. Průměrný věk byl 31,5 roku, BMI 24,02. Polymorfizmus FSHR byl vyšetřen metodou Real Time PCR na přístroji ABI Prism 7000.

Výsledky: Průměrná hladina estradiolu 12 013 pmol/l. U III. a IV. stupně OHSS bylo průměrně 21,78 a 28 oocytů.

Frekvence genotypů FSHR u 317 fertilních kontrol byla: Asn680Asn 32,77%, Asn680Ser 47,32% a Ser680Ser 15,46%.

Frekvence u OHSS III. stupně: Asn680Asn 27,27%, Asn680Ser 72,72% a Ser680Ser 0%. Došlo k významnému zvýšení zastoupení genotypu Asn680Ser z 47,32% na 72,72% se snížením frekvence genotypu Asn680Asn z 37,33% na 27,27%.

Frekvence u OHSS IV. stupně: Asn680Asn 63,64%, Asn680Ser 27,27% a Ser680Ser 9,09%. Došlo ke snížení u genotypu Asn680Ser z 47,32% na 27,27% a k významnému zvýšení genotypu Asn680Asn z 37,22% na 63,64%. Frekvence genotypu Ser680Ser se významně nezměnila.

Závěr: Tyto výsledky ukazují souvislost mezi stupněm citlivosti FSHR a závažností OHSS. Považujeme proto za důležité ověřit tyto výsledky na rozsáhlejším souboru žen tak, aby bylo možno dle genotypu FSHR a jeho citlivostí na FSH optimalizovat dávku FSH, a přispět tak ke snížení rizika OHSS.

Podpořeno VZ FNM 00064203 a NR/9448-3/2007.

20. Submikroskopické změny primordiálních a primárních folikulů po rozmražení ovariální tkáně

M. Sedláčková¹, J. Žáková², J. Dumková¹, P. Ventruba^2
1 Ústav histologie a embryologie LF MU Brno
² Gynekologicko‑porodnická klinika LF MU a FN Brno

Úvod: Kryoprezervace ovariální tkáně je jednou z možností, jak zachovat reprodukční schopnost mladým ženám, které se musí podrobit radiační nebo chemické onkologické léčbě a nemohou využít možnosti zamražení embryí. Zatímco kryoprezervace embryí je již léta rutinně prováděna, mražení ovariální tkáně je využíváno sporadicky a s různými výsledky.

Cílem naší studie bylo stanovení submikroskopických změn, které lze identifikovat v rozmražené ovariální tkáni ve srovnání s tkání čerstvou, a posoudit tak vhodnost použitého postupu kryoprezervace.

Materiál a metodika: Z ovarií 21leté pacientky byly laparoskopicky odebrány kortikální proužky a zamraženy na přístroji Planer Kryo F10. Současně byla malá část čerstvých vzorků s informovaným souhlasem pacientky zpracována pro elektronovou mikroskopii. Jeden ze vzorků kryoprezervované ovariální tkáně byl po dvou měsících rozmražen a rovněž zpracován pro elektronovou mikroskopii.

Výsledky: Ve vzorcích čerstvé i rozmražené tkáně byly nalezeny primordiální a primární folikuly, jejichž kvalita značně kolísala. Bylo vyšetřeno celkem 12 folikulů čerstvých a 15 rozmražených. Jak v čerstvé, tak v rozmražené ovariální tkáni byl nalezen omezený počet folikulů s velmi dobře zachovalou strukturou, ve většině případů však byly folikuly v různé míře alterovány. Změny postihovaly jak oocyty, tak folikulární buňky. Ke změnám ve folikulárních buňkách patřila vyšší kondenzace chromatinu v jádře, dilatace perinukleárního prostoru a granulárního endoplazmatického retikula, zbobtnání mitochondrií, přítomnost denzních lipidových kapek, vakuolizace cytoplazmy až úplná destrukce buněk. V oocytech pak bylo pozorováno zmnožení profilů hladkého endoplazmatického retikula, ruptury jaderného obalu, zvýšený výskyt lipofuscinu, vakuolizace cytoplazmy, nepravidelné mitochondrie s atypickými kristami.

Závěr: Ně­kte­ré morfologické změny v ovariálních folikulech jsou projevem atresie, a jsou tudíž pozorovatelné i u čerstvé tkáně. Jiné změny je možno považovat za důsledek procesu kryokonzervace (ruptury jaderného obalu, ně­kte­ré typy změn na mitochondriích, vakuolizace). I v rozmražené tkáni však byly nalezeny folikuly s velmi dobře zachovanou morfologií, což poskytuje naději na úspěšné pozdější klinické využití a zároveň svědčí o vhodnosti použitého postupu mražení.

21. Kometová analýza jako nástroj pro stanovení integrity DNA spermií. Porovnání různých protokolů

M. Matejovičová¹, M. Králíková¹, J. Melounová¹, J. Žáková², I. Crha^2
1 Biochemický ústav, LF MU Brno
² Gynekologicko‑porodnická klinika LF MU a FN Brno

Úvod: Kometová analýza je metoda, jejíž pomocí lze stanovit fragmentaci DNA v jednotlivých buňkách. Metoda je založena na elektroforéze jaderné DNA buněk, imobilizovaných v agarózovém gelu, následující po lýze a denaturaci DNA. Buňky s poškozenou DNA mají po elektroforéze tvar komety: kruhovitou „hlavu“ reprezentující nepoškozenou DNA a protáhlý „ohon“, jehož délka a intenzita závisí na míře poškození DNA a velikosti fragmentů. Specifika aplikace kometové analýzy na spermie spočívají v odlišné organizaci chromatinu spermií. Ten je, na rozdíl od somatických buněk, asi šeskrát kompaktnější a obsahuje díky protaminům velké množství disulfidových vazeb. Proto je při sledování poškození DNA spermií rozhodujícím krokem efektivní lýza buněčných struktur a denaturace DNA bez zvyšování míry fragmentace.

Metody: V této práci jsme sledovali kometovou analýzou bazální poškození DNA ve spermiích mužů podstupujících vyšetření ejakulátu v Centru asistované reprodukce FN Brno. Ejakulát byl ponechán 1 hod při pokojové teplotě do úplného zkapalnění a přibližně 1ml zkapalněného ejakulátu byl zmrazen v tekutém dusíku bez kryoprotektivních látek a uchován pro další analýzu.

Výsledky: V několika experimetech bylo základní poškození DNA zmrazených vzorků porovnáno s poškozením DNA v čerstvě odebraných vzorcích spermatu, které byly analyzovány v den odběru. Nepozorovali jsme rozdíly v poškození DNA. Dále jsme porovnávali různé metody buněčné lýzy. V souladu s dříve publikovanými metodikami byly použity dva odlišné základní protokoly a jejich modifikace. Protokol A zahrnuje proteolýzu pomocí proteinázy K v průběhu lýzy a protokol B využívá k destrukci membrán a chromatinových struktur jako hlavní detergent dijodosalicylát lithný. V obou protokolech je navíc použit dithiothreitol (DTT) sloužící k redukci disulfidových vazeb. Užití této látky zároveň s proteinázou K v protokolu A však zvyšovalo míru poškození DNA spermií.

Závěr: Nejméně poškozená DNA byla pozorována při vyšetřeních, při kterých byl aplikován protokol B.

Tato studie je podporována z grantu NS/9661-4 Ministerstva zdravotnictví České Republiky.

22. Softwarové hodnocení poškození DNA kometovým testem u poruch reprodukce

P. Houska¹, B. Novotná², J. Diblík¹, M. Macek sr.^1
1 Ústav bio­logie a lékařské genetiky FN Motol; Praha
² Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.

Jednou z příčin poruch plodnosti je zvýšená nestabilita DNA v jinak morfologicky normálních spermiích. Integritu DNA je možné analyzovat kometovým testem. Je to metoda jednoduchá, levná, použitelná pro jakýkoliv typ jaderných buněk a umožňuje kvantifikovat rozsah poškození DNA na úrovni jednotlivých buněk při minimálních požadavcích na množství analyzovaného materiálu. Vizuální hodnocení nestability DNA je zatíženo subjektivní chybou, proto se využívají speciální softwary (SW) obrazové analýzy. Cílem práce bylo srovnání 18 SW a výběr nejvhodnějšího pro klinické účely.

Hodnoceny byly čtyři komerční SW (Komet6, CometAssayIV, Lucia6 a CometImager) a tři nekomerční (CASP, CometScore a CellProfiler), na kterých byly analyzovány buňky s různým stupněm poškození DNA. Bodovým hodnocením (0–100 bodů) bylo oceněno programové vybavení (import/export dat aj. – maximálně 20 bodů), obrazová analýza (měření pozadí, thresholding, informace poskytované v průběhu měření aj. – maximálně 60 bodů) a uživatelské rozhraní (komfort, automatizace aj. – maximálně 20 bodů).

Na základě hodnocení byl vybrán z každé skupiny nejlepší SW pro další srovnávací studii – CASP a Lucia6. Z desíti parametrů poškození DNA byly použity pouze hodnoty nejspolehlivějšího markeru – TailDNA% (TD). Srovnání proběhlo na mikroskopech Olympus VANOX BHS a Zeiss AxioPlan2.

Mediány TD se v obou programech statisticky významně nelišily (Lucia6: 22 a 19, CASP: 25,3 a 18,3). CASP není závislý na používaném operačním systému, je dostupný zdarma i se zdrojovým kódem (www.casplab.com) a umožňuje hodnotit preparáty i s nerovnoměrným pozadím. Lucia6 poskytuje navíc možnost přímého ovládání mikroskopů zn. Nikon a dokáže měřit více buněk najednou.

Podpořeno VZ FNM 00064203 a NR/9448-3/2007.

23. Homocystein, vitamin B12 a kyselina listová v seminální tekutině

M. Králíková¹, J. Melounová¹, I. Crha², J. Žáková², M. Matejovičová¹, J. Jarkovský³, M. Beňovská⁴, J. Tallová^1
1 Biochemický ústav LF MU Brno
² Gynekologicko‑porodnická klinika LF MU a FN Brno
³ Institut bio­statistiky a analýz MU Brno
⁴ Oddělení klinické bio­chemie a hematologie FN Brno

Úvod: Celá řada fyziologických dějů v mužských pohlavních žlázách souvisí s metabolizmem homocysteinu (Hcy) a k němu se vztahujících vitaminů. Foláty hrají velmi důležitou roli v lidské reprodukci a léčba antagonisty folátu poškozuje mužské reprodukční funkce. Předchozí studie ukázaly, že nízká hladina folátu v seminální plazmě je spojena se sníženým množstvím spermií. Nedostatečný příjem vitaminů B6, B12 a kyseliny listové omezuje metabolizmus Hcy a způsobuje hyperhomocystenémii, která je spojena se zvýšenou tvorbou reaktivních forem kyslíku, snižuje dostupnost NO a zvyšuje expresi prozánětlivých cytokinů. Nadměrný oxidační stres poškozuje DNA a negativně ovlivňuje funkci spermií během fertilizace. Cílem práce bylo stanovit koncentraci Hcy, vitaminu B12 a folátů v seminální tekutině a zjistit vztahy mezi nimi, věkem a parametry spermiogramu.

Materiál a metody: Studie se zúčastnilo 271 mužů ve věku 18–58 let (medián 31 let). Pro část statistické analýzy byli rozděleni do šesti skupin podle výsledku vyšetření ejakulátu dle pokynů SZO. Hladina Hcy byla měřena pomocí HPLC/FD, hladina vitaminů pomocí electrochemiluminescenční imunoeseje. Pro analýzu vztahů mezi vitaminy, Hcy a parametry spermiogramu byla použita Spearmanova neparametrická korelace a pro srovnání hodnot mezi skupinami pacientů Kruskal Wallis test doplněný o post‑hoc test průměrných pořadí.

Výsledky a závěr: Byly nalezeny statisticky významné korelace mezi koncentrací B12 a folátu i Hcy a také počtem spermií, jejich pohyblivostí a procentem patologických hlaviček. Koncentrace folátu korelovala s B12, počtem a pohyblivostí spermií a procentem patologických hlaviček a krčků. Také rozdíly v koncentracích Hcy a vitaminů mezi jednotlivými skupinami pacientů byly statisticky významné. Další výzkum by měl být zaměřen na vztahy mezi výše zmiňovanými parametry a schopností oplodnění v (sub)fertilních párech.

Práce byla podpořena grantem IGA Ministerstva zdravotnictví ČR č. NS/9661-4.

24. Asistovaná reprodukce s použitím kryokonzervovaného spermatu onkologicky nemocných mužů

E. Lousová, J. Žáková, P. Nentwichová, H. Pochopová, I. Crha, P. Ventruba
Gynekologicko‑porodnická klinika LF MU a FN Brno

Úvod: Nádorová onemocnění patří k závažným onemocněním, která mají vliv na reprodukci jak primárním působením nádoru, tak sekundárně působením onkologické léčby. V důsledku onkologické léčby vznikají poruchy reprodukčních funkcí až trvalá neplodnost. Metody asistované reprodukce dovedou zachovat vyléčeným pacientům šanci na vlastní dítě díky kryokonzervaci spermatu před radikální léčbou (radioterapie, chemoterapie, orchidectomie).

Materiál a metodika: Materiál tvoří vzorky spermatu 826 pacientů (věk 13–64 let) přicházejících na naše pracoviště ke kryokonzervaci před léčbou onkologického onemocnění v letech 1995–2008. Hodnocení spermiogramu bylo prováděno dle manuálu WHO. Kryokonzervace se prováděla do roku 2004 s Richardsonovým médiem a od roku 2004 s komerčně vyráběnými médii (Medi-Cult).

Výsledky: Nejpočetnější skupinu představovali pacienti s tumorem varlete (42,7%), dále Lymfom Hodgkin (15,8%), Lymfom nonHodgkin (6,3%), leukémií (7,6%) a zhoubným nádorem kosti a chrupavky (6,5% ). Nejnižší hodnoty spermiogramu byly zjištěny u mužů s tumorem varlete, naopak nejvyšší hodnoty byly u mužů s nádorovým onemocněním CNS. Vyšetření spermiogramu s odstupem šesti měsíců až devíti let po léčbě podstoupilo 84 pacientů. Ke zhoršení spermiogramu došlo ve 41 případech (48,8%). U 24 (28,6%) mužů zůstaly hodnoty obdobné, jaké měli v době zamražení ejakulátu. Lepší hodnoty než před léčbou onemocnění vykazovalo 19 mužů (22,6%). Kryokonzervovaného spermatu využilo po léčbě 32 mužů (29,1 ±7 let). Ve všech případech podstoupily jejich partnerky odběr oocytů a oplozování bylo provedeno metodou ICSI. Bylo získáno 233 oocytů s fertility rate 65,2%. Nižší fertility rate je pravděpodobně způsoben nižší kvalitou spermií po rozmražení.U čtrnácti žen bylo dosaženo klinického těhotenství (43,7%) a 10 žen porodilo.

Závěr: Muži po léčbě onkologického onemocnění mohou využitím asistované reprodukce s použitím kryokonzervovaných spermií před léčbou dosáhnout početí bio­logicky vlastního dítěte. Procento dosažených těhotenství ukazuje, že zamražení spermatu před onkologickou léčbou by mělo patřit mezi standardní postupy.

25. Nové poznatky o koncentraci thiolů ve folikulární tekutině – intraindividuální rozdíly a doporučení pro další stanovení

M. Králíková¹, J. Melounová¹, J. Jarkovský², M. Matejovičová¹, M. Vodová³, J. Žáková⁴, I. Crha^4
1 Biochemický ústav LF MU Brno
² Institut bio­statistiky a analýz MU Brno
³ Ústav bio­chemie; Přírodovědecká fakulta MU Brno
⁴ Gynekologicko‑porodnická klinika LF MU a FN Brno

Úvod: Zvýšená hladina homocysteinu v plazmě je rizikovým faktorem pro rozvoj mnoha onemocnění, včetně vrozených vývojových vad a komplikací těhotenství, a jeho hladina ve folikulární tekutině podle předchozích studií s plazmatickou koreluje. Metabolizmus homocysteinu úzce souvisí s metabolizmem dalších thiolů – cysteinu, který mj. vzniká při transsulfurikační dráze, a cysteinylglycinu a glutathionu, jejichž metabolizmus se s cysteinovým spojuje v gama‑glutamylovém cyklu. Glutathion je také jedním z nejdůležitějších antioxidantů, který chrání organizmus před oxidačním stresem. Cílem studie bylo zjistit intraindividuální rozdíly v koncentraci thiolů ve folikulární tekutině jednotlivých folikulů získaných po ovariální stimulaci FSH, určit rozdíly mezi folikuly bez oocytu a s oocytem a dle získaných výsledků deklarovat doporučení pro další stanovení.

Materiál a metody: Studie se zúčastnilo 49 žen ve věku 24–44 let, u každé jsme stanovovali koncentraci thiolů ve 2–8 folikulech metodou HPLC-FD. Pro srovnání bio­chemických parametrů mezi folikuly a v krvi byl použit Wilcoxonův párový test, závislost na věku byla stanovena Spearmanovým korelačním koeficientem a míra intraindividuální variability pomocí zobrazení rozdílu mezi střední hodnotou u folikulů s vajíčky a bez nich oproti rozsahu hodnot získaných z jednotlivých měřených folikulů.

Výsledky: Byl potvrzen pokles hladin thiolů v krvi po ovariální stimulaci FSH, nalezeny významné rozdíly v koncentraci cysteinu a glutathionu mezi folikuly s oocytem a bez něj a zjištěna velká intraindividuální variabilita v koncentracích thiolů.

Závěr: Variabilita koncentrací všech thiolů mezi jednotlivými folikuly je velmi vysoká a pro charakterizaci dané ženy doporučujeme medián z minimálně třech folikulů s oocytem nebo bez něj. Vzhledem k této velké variabilitě je nejvhodnější pro další výzkum a pozorování počtu získaných oocytů a dosažených těhotenství sledovat stále tentýž folikul.

Studie byla podpořena grantem IGA Ministerstva zdravotnictví ČR č. NS/9661-4.

26. Jsou kritéria pro zrušení embryotransferu z důvodu předpokládaného rozvoje OHSS u pacientek v IVF cyklu dostatečně efektivní?

J. Pavelková¹, K. Řežábek¹, M. Moosová¹, R. Jarošová¹, V. Filová², J. Moos^1,3
1 CAR, Gynekologicko‑porodnická klinika 1. LF UK a VFN Praha
² Immunotech a.s.; Praha
³ Sigma-Aldrich; Praha

Úvod: Hormonální stimulace žen s cílem mimotělního oplození oocytů může až u 3% pacientek vést k rozvoji ovariálního hyperstimulačního syndromu (OHSS). Embryotransfer (ET) s následnou graviditou u pacientky s postupně se rozvíjejícím OHSS způsobí posun směrem k závažnějšímu průběhu OHSS. Z těchto důvodů je při předpokladu rozvoje závažné formy OHSS transfer zrušen a embrya jsou kryokonzervována. Cílem této práce je zjistit, zda algoritmy pro posuzování rozvoje OHSS pro účely zrušení ET jsou dostatečně efektivní.

Materiál a metody: V období od 1. 1. 2005 do 31. 3. 2009 jsme analyzovali klinická data pacientek, které podstoupily IVF cykly a které patřily do rizikové skupiny s ohledem na rozvoj OHSS (> 18 rostoucích folikulů). Pacientky byly rozděleny na skupinu se zrušeným ET (44), skupinu s ET a prokázaným těhotenstvím (92) a skupinu s ET a neprokázaným těhotenstvím (95). Ve všech třech skupinách byly pacientky také rozděleny dle závažnosti průběhu OHSS. Skupina OHSS 1 zahrnuje pacientky bez symptomů OHSS a s lehkou formou OHSS, skupiny OHSS 2 a OHSS 3 zahrnují pacientky se středně závažnou resp. závažnou formou OHSS.

Výsledky: Ve skupině se zrušeným ET bylo přítomno 56,8% pacientek trpící středně závažnou nebo závažnou formou OHSS (OHSS 2 = 11,4% a OHSS 3 = 45,4%). Ve skupině s ET a prokázaným těhotenstvím bylo přítomno 17,9% pacientek s OHSS 2 a 3. Ve skupině s ET a neprokázaným těhotenstvím bylo přítomno 7,6% pacientek trpící středně závažnou nebo závažnou formou OHSS. Současný model poskytuje 8,2% falešně pozitivních výsledků a 10,4% falešně negativních výsledků.

Závěr: Dle současných kritérií je výběr pacientek navrhovaných pro zrušení ET z důvodu hrozícího OHSS přiměřený. Další pomocný prediktivní marker rozvoje OHSS by pomohl k přesnějšímu výběru pacientek, u kterých by byl možný embryotransfer s následnou graviditou bez rizika závažného stupně OHSS.

Podpořeno grantem IGA MZ ČR NS 9781-3.

27. Ovlivňuje řízení menstruačního cyklu dárkyň vajíček charakteristiky cyklů? Zhodnocení s výsledky skupiny GnRH antagonisté randomizované studie

R. Středa
Sanatorium Pronatal; Praha

Úvod: Pro řízení menstruačního cyklu dárkyň vajíček používáme hormonální antikoncepci nebo norethisteron acetát. Po pozorování několika případů pomalé odpovědi dárkyň vyvstala otázka, zda nejsou rozdíly mezi průběhem cyklu v porovnání s ženami, u kterých nebyl nástup menstruačního cyklus ovlivňován.

Cíl: Zhodnocení charakteristiky cyklů mezi skupinou dárkyň vajíček připravovaných GnRH antagonistickým protokolem, skupinou GnRH antagonistického protokolu v pilotní fázi randomizované studie srovnávající GnRH antagonisty vs GnRH agonisty – skupina A – (Středa, Mardešič, Sobotka et al; Česká gynekologie 2009) a skupinou GnRH antagonistického protokolu randomizované studie – skupina B – (Středa, Mardešič, Sobotka et al; in press).

Metoda: Popisná studie.

Výsledky: Od ledna do srpna 2009 jsme hodnotili léčebné cykly 50 dárkyň vajíček, které jsme porovnali se  17 cykly skupiny A a 50 cykly skupiny B, u všech cyklů bylo použito rekombinantního FSH, GnRH antagonistického protokolu a aplikace Pregnyl 10 000 IU inj. pro dozrání vajíček. Výsledky jsou uvedeny pro skupinu dárkyň vajíček, skupinu A a B resp. Při aplikaci průměrné denní dávky rFSH 240 ± 19 IU, 208 ± 18 IU a 220 ± 31 IU resp., při celkové spotřebě 1 817 ± 486 IU, 1 513 ± 357 IU a 1 510 ± 370 IU resp. a při trvání aplikace rFSH 8,3 ± 1,2 dní, 7,8 ± 1,2 dní a 7,3 ± 1,1 den resp. jsme získali 7,9 ± 1,2 oocytů, 7,3 ± 5,8 oocytů a 8,7 ± 5,5 oocytů resp. Malou ovariální odpověď (charakterizovanou získáním ≤ 3 vajíček) jsme pozorovali u 5, 3 a 3 léčených žen resp., velkou ovariální odpověď (charakterizovanou získáním ≥ 20 vajíček) u 1, 1 a u 7 léčených žen resp., ovariální hyperstimulační syndrom I. stupně jsme zaznamenali pouze ve skupině B u jedné léčené ženy, mezi dárkyněmi vajíček nebyl OHSS prokázán.

Závěr: Ve skupině dárkyň vajíček připravovaných GnRH antagonistickým protokolem, skupině A a skupině B jsme neprokázali odlišnosti v charakteristikách stimulačních cyklů.

I pro skupinu dárkyň vajíček připravovaných GnRH antagonistickým protokolem je důležité určení patřičné počáteční denní dávky rFSH s případnou modifikací během léčby.

28. Indexy krev/folikulární tekutina u ovariálních proteinů mohou sloužit k predikci rozvoje OHSS u pacientek v IVF cyklu

M. Moosová¹, K. Řežábek¹, V. Filová², J. Pavelková¹, J. Pěknicová³, J. Moos^1,4
1 CAR, Gynekologicko‑porodnická klinika 1. LF UK a VFN; Praha
² Immunotech a.s.; Praha
³ BTÚ AV ČR v.v.i.; Praha
⁴ Sigma-Aldrich, s.r.o.; Praha

Úvod: Ovariální hyperstimulační syndrom (OHSS) je zdravotní komplikace, jejíž závažná forma postihuje až 3% pacientek v IVF cyklu. Posouzení rozvoje OHSS je založeno zejména na počtu rostoucích folikulů. Počet rostoucích folikulů je však parametr nedostatečný, neposkytující spolehlivé údaje o rozvoji OHSS. Cílem této práce je identifikovat/definovat potenciální prediktivní faktory OHSS v krvi a/nebo folikulární tekutině (FF).

Materiál a metody: V této retrospektivní studii jsme analyzovali párové vzorky FF a krevního séra odebrané v den punkce od 53 pacientek v IVF cyklu. V séru i ve FF byly měřeny koncentrace Inhibinu A a Inhibinu B (inhibiny se ukázaly v předběžném experimentu jako nejvhodnější kandidáti).

Výsledky: Výskyt OHSS je vázán na skupinu pacientek s vysokým počtem rostoucích folikulů (> 18 folikulů), i v této skupině však většina pacientek netrpí závažnou formou OHSS. Porovnání koncentrací Inhibinu A a Inhibinu B u kontrolní skupiny (> 18 folikulů, bez OHSS) se skupinou pacientek se závažnou formou OHSS (> 18 folikulů, s OHSS) neposkytlo statisticky významné rozdíly. Abychom získali statisticky významné rozdíly nezávislé na počtu rostoucích folikulů, navrhli jsme tři nové indexy vypočítané na základě pacientských dat a koncentrací v séru a ve FF. Nejlepších výsledků bylo dosaženo u Inhibinu B za použití indexu TFF/SBM. (TFF/SBM = [koncentrace ve FF] × [počet rostoucích folikulů]/[koncentrace v séru] × [hmotnost pacientky]). Index TFF/SBM u Inhibinu B poskytl statisticky významný rozdíl (p = 0,00433) mezi kontrolní skupinou (> 18 folikulů, bez OHSS) a skupinou pacientek se závažnou formou OHSS, a zároveň nevykazoval korelaci s počtem rostoucích folikulů.

Závěr: Prokázali jsme, že zatímco koncentrace inhibinů v séru ani ve FF nejsou vhodné pro predikci rozvoje OHSS, indexy vypočítané s jejich pomocí mohou plnit tuto roli mnohem lépe.

Podpořeno grantem IGA MZ ČR NS 9781-3.

29. Posouzení výskytu DNA-fragmentací spermií v souvislosti s karyotypem muže

K. Faltusová¹, R. Rybář², I. Bělobrádková¹, J. Štěpán¹, J. Rubeš³, K. Veselá^3
1 CAR Sanus; Hradec Králové
² Výzkumný ústav veterinárního lékařství; Brno
³ Genprogress; Brno

Úvod: Již dříve jsme referovali o různém rozsahu výskytu DNA-fragmentací spermií u mužů, o jejich vztahu k parametrům klasického spermiogramu, o jejich negativním vlivu na vývoj embrya, a tím dopadu na fertilitu. Tato studie se zabývá srovnáním DFI-hodnot s nálezem v karyotypu.

Materiál a metodika: Vyšetřili jsme 39 vzorků semene mužů na přítomnost fragmentací DNA spermií (údaj DFI) metodou Sperm Chromatin Structure Assay. Všichni pacienti sledovaného souboru měli vyšetřený karyotyp – klasickou metodou G-pruhování z lymfocytů periferní krve. Chí-kvadrát testem jsme zjišťovali, zda výskyt DNA-fragmentací souvisí s nálezem v karyotypu.

Výsledky: Všichni pacienti s DFI v normě (tj. do 15%, celkem 15 mužů) vykazovali normální karyotyp, stejně i 10 pacientů v kategorii zvýšeného DFI (15% – 27%). Ve skupině mužů se závažným výskytem spermií se zlomy řetězců DNA (= nad 27%, 14 mužů) byla 1krát diagnostikována mikrodelece chromozomu Y. Chí-kvadrát testem nebyla zjištěna průkazná závislost mezi zvýšeným DFI a nálezem v karyotypu muže (hladina významnosti 0,43%).

Závěr: Zatímco téměř všichni pacienti měli normální karyotyp, zvýšené DFI, ať již mírně či velmi závažně, jsme zaznamenali u většiny z nich. Normální nález ohledně karyotypu nevypovídá o hodnotě DFI, která bývá často zvýšena nad normu. Při pátrání po příčině sterility je vyšetřování DNA-fragmentací oprávněným parametrem, který mnohdy odhalí skrytý důvod neúspěchu při snaze o graviditu.

30. Srovnání účinku krátkodobě a dlouhodobě působících GnRH analog (triptorelin 0,1mg denně vs 3mg) – hormonální charakteristiky cyklů

R. Středa
Sanatorium Pronatal; Praha

Úvod: Zájem o krátkodobě působící GnRH analoga byl vyvolán obavou z hlubokého hormonálního útlumu a útlumu folikulogeneze u depotních GnRH analog. Cílem desenzitizace u dlouhého GnRH analogového protokolu není vymizení endogenní sekrece LH, ale její snížení a prevence předčasného vzestupu LH.

Cíl: Porovnání bazálních hladin estradiolu (E2) a LH a hladin E2 a LH po desenzitizaci, dále v den 5 aplikace rFSH a v den aplikace hCG v dlouhém GnRH analogovém protokolu srovnávajícím krátkodobě působící vs dlouhodobě působící GnRH analoga v neselektované skupině žen.

Typ studie: Prospektivní studie.

Předmět a metoda: Od června 2003 do června 2009 autor hodnotil 212 cyklů u neselektovaných pacientek léčených triptorelinem 0,1mg denně a 47 pacientek léčených triptorelinem 3mg v dlouhém GnRH analogovém protokolu (oba GnRH analoga byla aplikována 21. den menstruačního cyklu) s rekombinantním FSH. Při znalosti bazálních hladin E2 a LH jsme realizovali odběr krve na estradiol a LH po desenzitizaci (14 dní od počátku aplikace GnRH analoga), dále v 5. den a v den aplikace hCG.

Výsledky: Obě sledované skupiny se nelišily v základních charakteristikách. Prokázali jsme bazální FSH (IU/l) 6,6 ± 2,3 vs 6,5 ± 2,2 (ns), bazální LH (IU/l) 5,8 ± 3,5 vs 5,1 ± 2,0 (ns), bazální E2 (pg/ml) 91 ± 81 vs 110 ± 57 (ns), E2 po desenzitizaci byl (pg/ml) 16,8 ± 11,3 vs 16,4 ± 11,2, LH po desenzitizaci (IU/l) 2,3 ± 1,4 vs 0,6 ± 0,4 (p < 0,05), E2 v den 5 aplikace rFSH (pg/ml) 363 ± 335 vs 385 ± 345 (ns), LH v den 5 (IU/l) 1,7 ± 1,0 vs 0,59 ± 0,6 (ns), E2 v den aplikace hCG (pg/ml) 1 506 ± 1 072 vs 973 ± 650 (ns) a LH v den aplikace hCG (IU/l) 1,7 ± 1,0 vs. 0,6 ± 0,3 (ns).

Závěr: Existují významné odlišnosti v hormonálních charakteristikách pro oba protokoly.

Znalost hormonálních hladin v průběhu stimulace umožňuje zajistit nezbytnou individualizaci léčby (případné exogenní podání LH).

31. Vysoký výskyt aneuploidií v polárních tělíscích u ženy s hyperstimulačním syndromem IV. stupně

J. Diblík¹, M. Macek sr.¹, M. Hrehorčák², P. Feldmár², H. Klučková¹, P. Paulasová¹, Š. Vilímová¹, M. Montag^3
1 Ústav bio­logie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol; Praha
² Gynekologicko‑porodnická klinika 2. LF UK a FN Motol; Praha
³ Abteilung für Gynäkologische Endokrinologie und Reproduktionsmedizin, Zentrum für Geburtshilfe und Frauenheilkunde, Universitätsklinikum Bonn, Německo

Stimulační protokoly používané pro IVF by se mohly podílet na zvýšeném riziku aneuploidií v dozrávajících oocytech. Na tomto riziku se mohou podílet jak vysoké dávky gonadotropinů, tak i individuální zvýšená citlivost k těmto hormonům, která zvyšuje i riziko ovariálního hyperstimulačního syndromu (OHSS). Předmětem sdělení je kazuistika prvního IVF cyklu u ženy ve věku 29 let. Pacientka je nosičkou polymorfizmu Asn680Ser v genu pro receptor FSH, který zvyšuje jeho citlivost na FSH. Po stimulaci krátkým protokolem s antagonisty bylo získáno 40 kumulů. ICSI byla provedena u 35 zralých oocytů. Fertilizovaných bylo 24 oocytů, u 22 z nich byla ve stadiu zygoty provedena bio­psie polárních tělísek. Výsledky byly získány pro 95% (21/22) s 29% (6/21) normálních a 66% (14/21) abnormálních nálezů. První polární tělísko (PB1) bylo vyšetřeno u 95% zygot s normálním nálezem v 38% (8/21) a abnormálním v 62% (13/21). Abnormality zahrnovaly 4 komplexní aneuploidie a 9 abnormalit jednoho chromozomu (1× nulisomie 13, 1× nulisomie 16, 1× monosomie 16, 2× monosomie 18, 2× trisomie 22 a 2× monosomie X). Druhé polární tělísko (PB2) bylo vyšetřeno v 73% zygot s 62% (10/16) normálními a 38% (6/16) abnormálními (po jedné komplexní aneuploidii, disomii 16, disomii 18, disomii 21, nulisomii 21 a disomii 13). Analyzovány byly i blastomery z abnormálních embryí. Ve dvou s abnormálním PB1 a normálním PB2 byly výsledky normální. Zbylá 4 embrya (2 ze zygot s normálními tělísky, ale s morfologickými abnormalitami, 2 s aneuploidiemi v tělíscích) byla mozaiková. Den po odběru oocytů byla pacientka hospitalizovaná s OHSS IV. stupně (bolesti břicha, zvracení, průjem, ascites) celkem na 12 dnů. Embryonální transfer nebyl proveden z důvodu OHSS, vysokého výskytu aneuploidií a špatné kvality zbylých embryí. Jde o první publikovanou kazuistiku, která ukazuje na možný vztah mezi genotypem receptoru pro FSH, OHSS a zvýšeným rizikem aneuploidie chromozomů 13, 16, 18, 21, 22 a X.

Podpořeno VZ FNM 00064203 a NR/9448-3/2007.

32. Právní aspekty náhradního (surogátního) mateřství

M. Sedláčková², M. Petrenko^1
1 Gynekologicko‑porodnická klinika LF MU a FN Brno
² Sociální lékařství, doktorský studijní program, téma: Právní aspekty v gynekologii a porodnictví

Institut náhradního mateřství je nyní v České republice hojně diskutovaným tématem, začátkem letošního září dokonce byla na toto téma svolána konference, na které se odborníci vyjadřovali k legislativním a zdravotním hlediskům. V současné době v našem právním řádu není o institutu surogátního mateřství ani zmínka, přesto však lékaři tímto způsobem neplodnost několik let řeší. Cílem autorů je zmapovat náhradní mateřství de lege lata, tedy současný právní stav a postupy, kterými se řeší absence výslovné právní úpravy včetně jejich rizik. V závěrečné části se pokusí o navržení řešení de lege ferenda, tedy zda a jak by bylo vhodné do budoucna tento institut právně zakotvit v českém právním řádu.

Jako určitá inspirace české justice budou zřejmě sloužit také ně­kte­ré zahraniční právní úpravy a zkušenosti. Kromě jiných zdrojů lze zde použít i publikaci FIGO z října 2009 o etických aspektech lidské reprodukce a zdraví žen. K nejdůležitějším závěrům patří:

• náhradní mateřství má jen medicínskou indikaci, sociální indikace nepřipadá v úvahu
• nutná je úplná autonomie surogátní matky během celého těhotenství včetně rozhodování o jakýchkoli prenatálních vyšetřeních, kontakt s čekajícím párem může totiž vyvolat neřešitelný konflikt
• realizace surogátního mateřství by neměla být založená na komerci, doporučuje se účast transparentních neziskových organizací

Vzhledem k probíhající integraci českého právního systému do EU je vhodné srovnat a sjednotit společný postup v této právně i eticky závažné problematice na úrovni příslušných komisí evropského parlamentu.

33. Optimalizácia včasnej diagnostiky ovariálneho hyperstimulčného syndrómu

P. Feldmár¹, M. Hrehorčák¹, M. Korbeľ², M. Macek³, K. Šuchová¹, L. Teslík¹, M. Halaška¹, L. Rob^1
1 Gynekologicko‑porodnická klinika 2. LF UK a FN Motol; Praha
² I. gynekologicko‑porodnická klinika LF UK a FNsP Bratislava
³ Ústav bio­logie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol; Praha

Cieľ štúdie: Zhodnotenie novej metodiky analýzy multifrekvenčnej bio­elektrickej impedancie (MFBIA) a vyšetrenie α2 makroglobulínu (α2M) u pacientok s kontrolovanou ovariálnou hyperstimuláciou (KOH) a posúdenie ich významu v predikcii a vo včasnej diagnostike ovariálneho hyperstimulačného syndrómu (OHSS).

Klinický súbor a metodika: V období od 1. 1. 2005 – 31. 12. 2008 sme v Centre asistovanej reprodukcie Gynekologicko‑pôrodnickej kliniky FN Motol v Prahe vyšetrili 209 žien zaradených do programu IVF s KOH. Hodnotili sme anamnestické údaje, vek, váhu, výšku, menštruačný cyklus (MC), dávky liekov, dávky hCG, počet odobraných oocytov, hladiny estradiolu (E2) a α2M v sére a namerané hodnoty impedancií. Impedancie sme merali prístrojom MFBIA pri frekvenciách prúdu 1, 5, 50 a 100 kHz. Hladiny E2 boli vyšetrené imunochemickým analyzátorom Cobas e411/Roche/ a α2M prístrojom ADVIA^® 1800 /SIEMENS/. Výpočty boli spracované v programe Excel a v programe SAS 8.2. Na porovnanie priemerov rôznych parametrov sa použil dvojvýberový t‑test (two‑sample t‑test).

Výsledky: Zistili sme, že pokles hodnôt impedancií medzi dňom odberu oocytov a dňom embryotransferu predstavuje štatisticky signifikantné zvýšenie relatívne riziko (RR) rozvoja OHSS III. – V. stupňa. Najsilnejšiu koreláciu sme našli pre frekvenciu 5 kHz (RR = 8,17, p < 0,0001). Relatívne riziko (RR) vývoja OHSS pre hladiny E₂ nad 10000 pmol/l v čase odberu oocytov je 3,49 (p < 0.0001). Relatívne riziko rozvoja OHSS pri odbere 20 a viac oocytov je 5,71 (p < 0.0001). Pre hladiny α2M vyššie ako 2g/l v čase odberu oocytov je RR pre vývoj OHSS 2,22 (p < 0,0361).

Záver: Sledovanie dynamiky impedancií pomocou MFBIA a vyšetrenie hladín α2M v deň odberu oocytov predstavujú nové metódy predikcie rozvoja OHSS u pacientok podstupujúcich liečbu metódami AR. Naše výsledky preukázali význam MFBIA i α2M v predikcii OHSS.

Štúdia je podporovaná grantom IGA MZ CR NR 8855-3.

34. Pokles ovariální funkce u pacientek léčených pro neplodnost

A. Sobek ml., E. Tkadlec, B. Hladíková, O. Koutná, E. Klásková, A. Sobek
Fertimed; Olomouc

Úvod: V průběhu posledních 50 let došlo k výraznému poklesu testikulární funkce u mužů, který byl potvrzen řadou studií. Je dosud nejasné, co je příčinou tohoto jevu, a dá se předpokládat, že stejný trend je možné očekávat i u funkce ovariální. Na velkém vzorku pacientek léčených pro neplodnost jsme v období 14 let vyhodnotili trend jednotlivých parametrů popisujících ovariální funkci.

Materiál a metody: V retrospektivní studii jsme vyhodnotili data pacientek (20–40 let) léčených v našem centru v období 1995–2008 metodou IVF/ICSI. Definovali jsme pět proměnných: hladinu estradiolu v den podání HCG, počet získaných oocytů, spotřebu gonadotropinu, bazální hladinu FSH a dávku gonadotropinu/1 oocyt. U každé ženy jsme zařadili vždy jen první cyklus IVF/ICSI. Pomocí generalizovaných aditivních modelů jsme po korekci vlivu věku a použitého stimulačního protokolu popsali trend ve vývoji funkce vaječníků.

Výsledky: V období 1995–2008 jsme retrospektivně vyhodnotili 2 760 IVF/ICSI cyklů. Průměrný věk pacientek stoupl o 2,7 let. Během studie došlo k poklesu hladiny estrogenů v průměru o 31 pmol/rok. Počet získaných oocytů klesl o –0,3 oocytů/rok a tento pokles byl zřetelný jak u starších pacientek, tak zejména u žen mladších 35 let. Dávka gonadotropinu se sice zvyšovala s věkem, v průběhu studie se však významně neměnila. Bazální hladina FSH se lineárně zvyšovala s věkem, v jednotlivých letech studie ale zůstala bez signifikantních změn. Dávka gonadotropinu nutná k zisku jednoho oocytu stoupala jak s věkem, tak i v jednotlivých letech studie. Tento růst byl 4 IU/oocyt/rok.

Diskuze a závěr: Pomocí pěti parametrů popisujících ovariální funkci jsme zjistili malý, ale detekovatelný pokles senzitivity vaječníků na stimulaci gonadotropiny, který nelze připisovat pouze stárnutí populace žen léčených pro neplodnost. Po korekci vlivu věku a použitého stimulačního protokolu zde prezentujeme výsledky, které naznačují, že by negativní trend ve vývoji testikulární funkce mohl být analogicky přítomen i u ženské populace. Příčina sledovaného jevu zůstává podobně jako u mužů nejasná.

Ve sledovaném období došlo v naší společnosti k výrazným demografickým změnám, které měly za následek mimo jiné i výrazné prodloužení průměrné délky života. Je snížení funkce ovarií odpovědí právě na tyto změny nebo máme hledat příčinu jinde?

35. Genetika ovariální insuficience

D. Stejskal, M. Brandejská, A. Langerová, M. Trková, M. Putzová
GENNET, s.r.o.

Předčasná ovariální insuficience (POI) definovaná zvýšením gonadotropinů, snížením ovariálních hormonů a poruchami menstruačního cyklu před čtyřicátým rokem věku je variabilní entitou od iniciálních a tranzitorních forem až po předčasné ovariální selhání (POF). V Centru asistované reprodukce GENNET patří více než 10% stimulovaných cyklů do indikační skupiny „Hypergodadotropní anovulace“ a u 5% prvně vyšetřených je hodnota FSH v časné folikulární fázi cyklu vyšší než 20 IU. POI je etiologicky heterogenní a nejméně jedna třetina případů je idiopatických. O významném podílu dědičných etiologických faktorů POI svědčí opakovaný výskyt v rodinách asi u 15% případů. Empirická rizika opakování multifaktoriálně podmíněných stavů jsou zpřesňována celogenomovými asociačními studiemi (GWAS) s nukleotidovými polymorfizmy (SNP). Vyšetřování chromozomálních (genomových) příčin POI – aneuploidie nebo strukturálních aberací chromozomu X – klasickými cytogenetickými metodami je doplňováno vyšetřením submikroskopických genomových aberací (CNV) pomocí array technologií. Zatím nejvýznamnější asociací POI s mutací určitého genu je asociace s expanzí CGG tripletů v nekódující části genu FMR1.

36. The role of of three-dimensional ultrasonography in assisted reproduction

T. Žáčková¹, L. Krofta^1,3, T. Marděšič^2,3, J.Řezáčová^1,3, J.Kalina^4
1 Institute for Mother and Child Care; Praha
² Sanatorium Pronatal; Praha
³ Institute for Postgraduate Medical Eduacation – IPVZ
⁴ Department of Probability and Statistics, MFF UK; Praha

Study design and details: A prospective pilot study of 17 women in IVF/ICSI stimulation related to kind of stimulated protocol and cause of sterility to determine ovarian and dominant follicle blood flow characteristics using three dimensional power Doppler ultrasound, grading system of perifollicular vascularity (Chui D. K. C et al 1997) and power doppler inde PI and RI of dominant follicle.

Materials and methods: 17 the patients were stimulated in a long protocol and subsequently with rekombianat FSH 15 days after downregulation .We exluded the women, who didn‘t agree with the examination, with high risk of OHSS, women with the operation of gynekology operation of ovary or uterus, with FSH level more than 10 mIU/l in early follicular period or women with ovarian cysts. The 3D ultrasound examinations and power doppler sonography of the ovary and dominant follicle we provided on the day HCG (pregnyl) before ovum pick up. The volume of the ovary and dominant follicle, VI, FI, VFI and, mean grayness, perifolicular vascularity and PI a RI of the dominant follicle was determined for each ovary separately. The oocyte of the dominant follicle from both ovaries was fertilized by ICSI and observed his embryogeny.

Results: The IVF/ICSI cycle was evaluated in 17 women, among which 5 were pregnant (29,4%) and 12 non‑pregnant (70,6%). The median age of the women was 32 (range 26 – 36). The causes of the infertility were male in 12 cases (70,6%), tubal in 2 cases (11,8%) and mixed in 3 cases (17,6%). There were 11 cases (64,7%) of primary and 6 cases (35,3%) of secondary infertility. Statistical analysis of the data was performed with R programming language (http://cran.r-project.org), version 2.4.1. Ultrasonography and Doppler angiography parameters measured on both ovaries are analyzed for each ovary separately. There is no significant difference between groups in the age of patients, type and causes of infertility and other general and clinical characteristics. In the group of pregnant women, there is a significantly larger number of grade 1 embryos on transfer day, a significantly larger flow index dx and there is a significant difference in the degree of morphological preimplantation quality of the 1. and 2. transferred embryos and in the degree of perifollicular vascularity of the right follicle dx. Other variables yield a non‑significant difference between the pregnant and non‑pregnant group because of small sizes of the data samples; however the p-values are near the 5%-level for the vascularization index and vascularization flow index, for which the observed values have the tendency to be larger for pregnant women and a future research with a larger number of patients is intended to attain significant results.

37. Je Supermale (XYY) karytoyp indikací k PGD?

R. Jarošová, A. Panczak, K. Řežábek
Gynekologicko‑porodnická klinika a Ústav bio­logie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN Praha

Úvod: Cílem kazuistiky je úvaha, zdali námi indikovaná vyšetření jsou vždy nezbytně nutná. V našem případě šlo o zdravou pacientku a jejího manžela s karyotypem 47, XYY – supermale, kteří v prvním cyklu IVF podstoupili PGD k záchytu numerické aberace u plodů. Populační frekvence výskytu supermale se odhaduje na 0,15%. Při segregaci gamet u muže s tímto karyotypem a při následném oplození zdravého oocytu můžeme teoreticky očekávat 50% embryí s normálním karyotypem a celkem 50% embryí s aberantním karyotypem 47,XXY (Klinefertův syndrom) nebo 47,XYY (Supermale). Široké epidemiologické studie ukazují, že v potomstvu těchto mužů jsou takové cytogenetické nálezy vzácné. Uvádí se, že ačkoliv jejich zastoupení není statisticky významně vyšší ve srovnání s potomky mužů s normálním karyotypem, podíl spermií s aneuploidiemi gonozomů může být u těchto mužů navýšen. U novorozenců s fenotypovým pohlavím mužským je výskyt anomálie heterochromozomu 1,2%. Zatím není ve světové literatuře zmiňováno mnoho karyotypizací u dětí či embryí, jejichž otec měl karyotyp supermale. Naše kazuistika jeden takový případ přidává.

Metodika a zpracování: 32letá zdravá pacientka se snahou o koncepci posledních pět let se obrátila na naše CAR. Před devíti lety se stejným partnerem spontánně otěhotněla a porodila zdravého syna s normálním karyotypem (46,XY). V jiném CARu před dvěma lety podstoupili vyšetření pro sekundární sterilitu a u partnera byl zjištěn syndrom supermale. Tímto nálezem byla zdůvodněna indikace k PGD. Celkem bylo PGD vyšetřeno pět embryí, čtyři embrya byla normální a u pátého embrya byla nalezena kombinace aneuploidií autosomů i gonosomů (mozaicizmus). Postupně byla transferována všechna zdravá embrya. Pacientka neotěhotněla. Další cyklus proběhl již v našem centru a po konzultaci s genetiky nebylo PGD provedeno. Provedeno standartně IVF a poté embryotransfer dvou dvoudennních embryí. V osmém týdnu byla potvrzena intrauterinní gravidita – gemini biamniales, bichoriales. Po porodu provedena karyotypizace obou plodů – normální karyotypy.

Závěr: Je tedy PGD vhodná či dokonce nutná v tomto případě? V žádné z cytogenetických analýz u konceptů naší pacientky (pět embryí vyšetřeno v rámci PGD, dvě embrya vedoucí k porodu a po porodu vyšetřená, starší zdravý syn) nebyla prokázána gonozomální aberace, na kterou bychom mohli mít podezření vzhledem ke karyotypu otce. Dále je na zvážení i fakt, že po PGD a postupném transferu čtyř embryí pacientka neotěhotněla. Přitom po transferu dvou embryí bez PGD obě embrya implantovala a vedla k porodu zdravých dětí. V každém jednotlivém případě je tedy nutno indikaci k PGD vždy pečlivě zvážit.

38. ET blastocyst?

O. Teplá¹, M. Mrázek¹, J. Hulvert¹, J. Strnadová¹, M. Vrbová¹, T. Rieger¹,J. Pěknicová^2
1 ISCARE IVF a.s., Prague, Czech Republic
² Laboratory of Diagnostics for Reproductive Medicine, Institute of bio­technology AS CR, Prague, Czech Republic

Introduction: Recent advances in cell culture media have led to a shift in IVF practice from early cleavage embryo transfer to blastocyst stage transfer. There have been reports about the hinger incidence monozygotic twin pregnancies (MZG) a cases with transfer of blastocyst compared to pregnancies after spontaneus conception.

Objectives: To determine if spontaneus hatched blastocyst stage embryo transfers (ETs) affect pregnancy rate (PR), implantation rate (IR) and associated outcomes compared with blastocyst stage ET. To asses number of MZG.

Material and methods: 1 203 ET performed from January 2008 to Juny 2009 were analyzed retrospectively. If cells of blastocyst hatched trough a hernia in the zona pellucida day 5 morning, we mark it as hatched blastocyst.

Results: We acheieved from all transfers 194 ET (16,1%) hatched blastocyst and 407 ET (33,8%) nonhatched blastocyst. Pregneancy rate for all cycles were 45,8% (534/1 203), for nonhatched blastocyst 52,9% (128/242) and for hatched blastocyst 58,8% (89/153). Implantation rate for hatched blastocyst was 36,7% (136/371) and for nonhatched blastocyst was 30,9% (238/771). During this period were made 150 SETs. We obtained 44 pregnancy (29,3%). In 16 cases (11/150 – 11%) we transferred hatched blastocyst and were 8 (50%) women pregnant. When we transferred nonhatched EB (33/150 – 22%) cases, 13 (39%) women were pregnant. There are incidence of MZG in our study in 4 cases (0,33%). In two cases is possible to asses MZG on the basis of blastocyst morfology.

Conclusion: Cultivation of embryos 120 hrs improve pregnancy rate and is applicable for single embryo transfer.

This study was supported by NS 10009 from the grant agency of health of the Czech Republic.

39. Spolupráca centier asistovanej reprodukcie a univerzitnej kliniky na Slovensku

L. Maršík^1,2, A. Ďurechová^1,2, K. Greksová¹, J. Války², P. Štencl¹, M. Gažo², R. Sysák¹, J. Oravec¹, Z. Pešková^1
1 I. gynekologicko‑pôrodnícka klinika LF UK Bratislava
² Iscare Bratislava, a.s.

Úlohou univerzitnej kliniky je okrem liečebno preventívnej starostlivosti aj vývoj, výskum, výuka a s nimi súvisiaca publikačná činnosť. Platí to pre všetky oblasti jej činnosti, vrátane asistovanej reprodukcie u gynekologicko‑pôrodníckej kliniky. Paradoxne, v mnohých krajinách strednej Európy túto úlohu prebrali súkromné IVF centrá, ktoré okrem kapitálu priniesli aj „know-how“ a s ním súvisiaci rozvoj asistovanej reprodukcie. Uvedená situácia vznikla nedostatočným ekonomickým zabezpečením zdravotníctva a školstva jednotlivých krajín, vrátane Slovenska.

Iscare, prvé súkromné IVF centrum na Slovensku, oslavuje v súčasnosti 10. výročie svojho vzniku. Na Slovensku máme dnes 7 IVF centier a pripravuje sa otvorenie ďalších, vrátane univerzitných. Tieto nemusia znamenať pre súkromné IVF centrá iba obavu z konkurenice, ale aj možnosť na rozšírenie spolupráce.

Okrem riešenia komplikácií, ako krvácanie do brušnej dutiny po odbere oocytov, ťažký OHSS a manažment viacplodovej gravidity, je potrebná spolupráca práve v oblasti vývoja, výskumu a publikačnej činnosti, ktoré potom umožnia výchovu kádrov v oblasti reprodukčnej medicíny, vrátane postgraduálnej výuky. Široké možnosti spolupráce sa črtajú v oblasti genetiky, hlavne predimplantačnej genetickej diagnostiky, v oblasti gynekologickej endokrinológie, napr. pri liečbe pacientok s hypogonadotropným hypogonadizmom, v oblasti bazálneho výskumu v embryológii, napr.v oblasti mrazenia oocytov, hlavne u onkologických pacientok, v andrológii a vo všetkých hraničných oblastiach reprodukčnej medicíny, vrátane kreovania a vedenia registrov AR a darcov gamét.